Ringraziamo Rebecca Nishi, MS, ed i tecnici del Fondo per la Christopher &amp; Dana Reeve core Animal Foundation presso la UC Irvine per il loro aiuto in chirurgia animali. Ringraziamo anche Gabriella Funes, Usha Nekanti e Denisse Moreno per le preparazioni sparare assistenza tecnica, manoscritti, video e animazione. Questa ricerca è stata sostenuta da NINDS (RO1 NS43428-01 a AJA), il Progetto Paralisi d&#39;America (PPA-32574 a HXN), e la California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) cellule staminali Premio Formazione T1-00008 per HXN. KDB è stato sostenuto dal programma di formazione molecolare e cellulare neuroscienze all&#39;Università della California di Irvine (T32 NS007444).

1. Dissociazione del tessuto del midollo spinale <ol><li> Segmenti del midollo spinale T8-T10 di non feriti o contusione del midollo spinale danneggiato (lesione al T9) ratti Sprague Dawley sono stati sezionati e dissociato meccanicamente con le forbici bene in HBSS a temperatura ambiente, come descritto in precedenza 1. Prima di dissociazione dei tessuti, intere colonne del midollo spinale sono stati tenuti in ghiaccio secco per 5 minuti prima dell&#39;estrazione dei segmenti cavo T8-T10. </li><li> Frammenti di tessuti che sono stati recuperati per centrifugazione (1 minuto, 1000 rpm, temperatura ambiente) e enzimaticamente dissociato con 2,5 mg di tripsina e 5 collagenasi mg in 5 ml DME (Dulbecco Modified Eagle Media) per 20 minuti a 37 ° C prima di triturazione (~ 10 volte a temperatura ambiente) con una pipetta Pasteur di vetro (9-pollici). </li><li> 10 ml di DME + 10% di siero fetale bovino è stato aggiunto alle cellule di inibire l&#39;attività enzimatica e poi è stato filtrato attraverso un colino cellula 40 micron. Dopo un giro veloce, il pellet è stato risospeso in 6 ml di HBSS e sovrapposto OptiPrep soluzioni gradiente descritto di seguito. </li></ol> 2. Creazione OptiPrep soluzioni gradiente <ol><li> Diluito OptiPrep è stato costruito diluendo OptiPrep 1:1 con tampone MOPS (0,15 M di NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4). </li><li> Quattro OptiPrep soluzioni gradiente sono state fatte da mescolando 350, 250, 200, o 150 microlitri OptiPrep diluito con HBSS ad un volume finale di 1 ml (Tabella 1). </li><li> I quattro soluzioni sono state lentamente e con attenzione disposti a strati in un tubo da 15 ml con il minimo diluire in basso e il più diluire in alto (Figura 1A). </li></ol> 3. Separare lipidi / mielina detriti dalle cellule <ol><li> 6 ml di cellule dissociate spinale in HBSS stato accuratamente a strati sopra di soluzioni del gradiente OptiPrep. </li><li> Provetta contenente le cellule e le soluzioni gradiente è stato centrifugato (15 minuti, 1900 rpm o 726 RCF, 20 ° C) utilizzando una centrifuga Eppendorf 5810R con un rotore basculante (A-4-62), separando la soluzione cella in strati distinti con i lipidi / detriti mielina (in alto 7 ml di tubo), seguita da 3 strati di neuroni, con le cellule infiammatorie, glia, e globuli rossi nel pellet. Sebbene la maggior parte delle cellule infiammatorie, tra cui monociti, macrofagi, granulociti PMN e linfociti sono stati trovati nel pellet, alcuni di grandi dimensioni-macrofagi attivati ​​è stato trovato in strati sopra il pellet. </li><li> La lipidi / strato di mielina detriti (in alto 7 ml) è stato accuratamente aspirati e rimossi. Le cellule sono state poi lavate e risospese in 2,5 ml HBSS e utilizzati per immunomarcatura sotto. </li></ol> 4. Immunomarcatura di specifiche cellule del sistema immunitario per la citometria a flusso <ol><li> Cellule (500 microlitri) raccolti da preparativi del midollo spinale sono stati pellettato e risospesi in cloruro di ammonio 0,85% (diluito in acqua distillata) per 5 minuti per lisare i globuli rossi. </li><li> Le cellule sono state lavate con 500 microlitri HBSS e poi bloccata per 30 minuti in coniglio normale o nel siero del mouse a temperatura ambiente. </li><li> Le cellule sono state lavate e incubate a temperatura ambiente per 1 ora con anticorpi (anti-coniglio PMN FITC, chimica accurato e scientifico; topo anti-ratto ED1 Alexa 488, Serotec; o Mouse anti-ratto CD3 Alexa 488) o isotipo IgG soluzione diluita in HBSS (tutti in diluizione 1:100), come descritto in precedenza 1. </li><li> Le cellule sono state lavate due volte dopo ogni passo sopra e poi risospeso in 300 microlitri HBSS dopo il passo finale. </li></ol> 5. Valutazione quantitativa delle cellule mediante citometria di flusso <ol><li> I campioni sono stati analizzati su un FACS Calibur (Becton-Dickinson) citofluorimetro utilizzando Quest software cellulare. 5.000 eventi per campione sono stati letti per tutti i campioni e analisi dei dati è stata completata con Summit (DakoCytomation). </li><li> Porte citometria a flusso sono stati fissati con il controllo delle cellule isotipo IgG etichettati o cellule del midollo spinale di animali di controllo indenne per impostare i valori di base per la normalizzazione attraverso punti di tempo come descritto in precedenza 1. I valori medi di cellule positivamente etichettati sono stati espressi come percentuale (± SEM) dell&#39;intero campione. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: La capacità di un gradiente OptiPrep per rimuovere i detriti della mielina e migliorare la rilevazione delle cellule immunitarie mediante citometria di flusso è stata valutata attraverso la quantificazione PMN spinale a 1 dpi (Figura 1B), il picco precedentemente segnalati di infiltrazioni PMN dopo SCI 1-3. In alternativa, identicamente sezionato il midollo spinale erano dissociate enzimaticamente senza OptiPrep-rimozione dei detriti mielina e sono stati valutati allo stesso modo in parallelo per infiltrazioni PMN mediante citometria di flusso. Come abbiamo riportato precedentemente 1, ci fu un cambiamento nella posizione degli eventi in campioni isolati con il metodo del gradiente di purificazione OptiPrep rispetto alla dissociazione enzimatica da solo, dimostrando la percentuale di PMN rilevati nei campioni con intatta debris mielina era solo uno frazione (0,5%) della percentuale di PMN rilevati (5,1%) in OptiPrep purifcampioni IED (Figura 1B). Questi dati suggeriscono che i detriti mielina nei preparati di tessuto può oscurare letture di citometria a flusso, e dimostrare che la rimozione dei detriti mielina aumenta la sensibilità di rilevazione delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale. Dopo aver stabilito la sensibilità del sistema gradiente OptiPrep per il rilevamento delle cellule nel midollo spinale danneggiato, abbiamo caratterizzato i cambiamenti in infiltrazione cellulare per un periodo che varia da 2 ore a 180 dpi e ha stabilito una risposta romanzo multifasico di infiammazione cellulare dopo SCI che comprendeva PMN, macrofagi / microglia e T-cellule. Come confermato da studi precedenti 1-3, PMN primo ingresso il cavo a 2 ore di post-infortunio e ha alzato a 1 dpi (Figura 2 e 4). Macrofagi / microglia invece 1,4,5, non sono stati rilevati nel midollo spinale lesionato fino a 3 dpi, e un picco inizialmente a 7 ​​dpi (Figura 3 e 4). Sorprendentemente, si mostra per la prima volta che i macrofagi / microglia picco per la seconda volta 60 dpi ed è rimasta elevata di 180 dpi (Figura 3 e 4). Simile a macrofagi / microglia, cellule T infiltrazione è stato previsto il picco 05-07 luglio dpi, tuttavia, la citometria a flusso non rileva le modifiche nel numero delle cellule T nei primi 7 dpi, anche se un elevato numero di cellule T è stata rilevata a 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Mentre il numero delle cellule T è stata diminuzione di 10 dpi, una persistente risposta delle cellule T è stata osservata di 180 dpi, momento in cui il 4,4% delle cellule sono stati etichettati per CD3 (Figura 4). Insieme, questi dati dimostrano un dipendente dal tempo di risposta multifasico di infiammazione cellulare dopo SCI (Figura 4), le fasi iniziali di infiammazione cellulare erano comprende il picco precoce di PMN 1 dpi seguito da un picco di ED1 + macrofagi / microglia 7 dpi e T 9-celle dpi, mentre le fasi successive erano composte da tutte e tre le popolazioni cellulari in aumento dopo 14 dpi e persistente di 180 dpi, con un picco notevole seconda macrofagi / microglia a 60 dpi. Questo studio timecourse ed i dati quantitativi generati mediante citometria di flusso sono state convalidate in precedenza, che mostrano risultati comparabili ai dati raccolti da stereologia quantitativo di immunolabeled sezioni del midollo spinale 1. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="Tabella 1"/> Tabella 1. Preparazione del gradiente OptiPrep per la rimozione di detriti mielina. Quattro soluzioni gradiente OptiPrep sono realizzati con HBSS OptiPrep e diluito (1:1 diluizione OptiPrep e MOPS). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Gradiente di densità OptiPrep separati più mielina / detriti dalla ferita del midollo spinale tessuti / cellule e migliorare la valutazione delle cellule immunitarie mediante citometria di flusso. (A) La mielina / detriti è stato separato dalle cellule (neuroni, cellule gliali e cellule del sistema immunitario) dopo centrifugazione del dissociato tessuto del midollo spinale attraverso un gradiente OptiPrep seguita da aspirazione di mielina / strato di detriti. (B) numero di PMN nel midollo spinale danneggiato, mostrando una maggiore sensibilità nel rilevare PMN dopo la rimozione detriti (Student t-test, p = 0,0001). Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali illeso; n = 5 per gruppo, media ± SEM. 5.000 eventi per campione sono stati letti per tutti i campioni e il valore medio di cellule positivamente etichettati sono stati espressi come percentuale (± SEM) dell&#39;intero campione. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Rilevamento di infiltrazioni PMN nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Dopo un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9, PMN rapidamente entrato nel midollo spinale di partenza 2 ore (B) post-infortunio e con un picco 1 dpi (C). Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali indenni (A). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Rilevazione dei macrofagi / microglia infiltrazione nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Dopo un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9, ED1 + macrofagi / microglia numero maggiore nel midollo spinale danneggiato a partire da 3 dpi (D), ha raggiunto il picco acutamente a 7 dpi (E), è sceso a livelli bassi a 14 dpi (F) , prima di risalire ad un secondo picco a 60 dpi (G), ed è rimasto nel midollo spinale lesionato fino a 180 dpi (H). IgG etichettatura controllo isotipo di 7 celle dpi spinale (B) hanno anticorpi minimo di etichettatura sfondo e nessuna differenza per le cellule anticorpo marcato da 2 ore post-infortunato (C) o indenne (A) gli animali. Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali illeso. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="Tabella 2"/> Tabella 2. Campioni di animali negli esperimenti timecourse. Per ogni punto temporale (0 hr a 180 dpi), cinque animali hanno ricevuto un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9,e del midollo spinale sono stati valutati mediante citometria di flusso per il numero di PMN, ED1 + macrofagi / microglia, e CD3 + T-cellule. Tuttavia, non tutti i campioni animali sono stati recuperati con successo da PMN (4-5), ED1 (3-5), e CD3 (4-5) analizza citometria a flusso. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Un timecourse di infiammazione cellulare nel midollo spinale a seguito di un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9. Valutata mediante citometria di flusso, il numero di PMN, ED1 + macrofagi / microglia, e CD3 + T-cellule ha raggiunto un picco acuto (1,7, e 9 dpi, rispettivamente) e persistito cronicamente nel midollo spinale danneggiato. N = 3 al 5 per gruppo, media ± SEM.

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	<li>Beck, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cellular+inflammation+after+traumatic+spinal+cord+injury:+evidence+for+a+multiphasic+inflammatory+response+in+the+acute+to+chronic+environment.">Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.</a> Brain. 133, 433-447 (2010).</li><li>Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;uso di citometria a flusso per quantificare le cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale è complicata da lipidi / mielina contenuti e detriti. Oltre ad interferire con il legame degli anticorpi e la specificità, detriti mielina possono avere dimensioni e proprietà simili granulazione per le cellule immunitarie, diminuendo la sensibilità e la precisione di misurazione 8. La cella nuovo metodo di preparazione qui descritto è efficace nella rimozione di detriti mielina e accresce quindi la sensibilità della citometria a flusso per rilevare i cambiamenti nel processo infiammatorio cellulare nel midollo spinale danneggiato. Per esempio, la rimozione dei detriti mielina da questo metodo di rilevamento maggiore di cellule immuni rispetto alla dissociazione enzimatica alone.Critically, l&#39;utilizzo di questo nuovo metodo ha permesso la prima caratterizzazione dei acuta e cronica infiammazione cellulare dopo SCI per includere un corso completo di tempo per PMN, macrofagi / microglia e le cellule T fino a 180 dpi, e ha individuato una fase secondo romanzo di infiammazione cellulare. Questi risultati importanti di un componente multifasico di neuroinfiammazione può essere fondamentale per la progettazione e realizzazione di razionali strategie di trattamento terapeutico, tra cui interventi sia a base di cellule e farmacologici per la SCI. Il sistema gradiente OptiPrep è stato utilizzato per separare i detriti dalle cellule nel sangue 9, o neuroni purificare dal cervello ai fini di coltura cellulare 10; tuttavia, abbiamo modificato e avanzato questo sistema di metodo per separare i detriti mielina a partire da cellule del midollo spinale dissociato, e ha permesso quantificazione rapida e più accurata di infiammazione cellulare mediante citometria di flusso. Questo metodo con citometria a flusso è tale da rendere avanzamento significativo nella ricerca infiammazione dopo lesioni del SNC o condizioni patologiche, come la maggior parte degli studi hanno solo caratterizzato l&#39;infiammazione cellulare nel sistema nervoso centrale con tecniche morfologiche e istologiche che non sono cellule di tipo specifico o non può sempre fornire informazioni veritiere valutazione quantitativa. Inoltre, alcuni studi recenti hanno tentato di quantificare le cellule immunitarie nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso con ingredienti freschi tessuti dissociato cavo 11,12 o cellule separate dal gradiente Percoll sistema 13, tuttavia, questi studi hanno dimostrato sia i rendimenti delle cellule bassa o insensibile rilevamento di cellule immunitarie. Al contrario, il metodo del gradiente OptiPrep cellula preparazione ha fornito per la prima volta, sensibile e affidabile valutazione quantitativa mediante citometria di flusso ai cambiamenti di infiammazione cellulare in risposta alla gravità delle ferite e graduati su una timecourse esteso fino a 180 dpi. La sensibilità e l&#39;affidabilità di citometria a flusso dipende anche dalla specificità degli anticorpi utilizzati per rilevare specifici tipi di cellule immunitarie, come la citometria a flusso non consente di stabilire criteri morfologici per distinguere ulteriormente i tipi di cellule. La specificità degli anticorpi per i PMN, macrofagi / microglia o T-dice è stato testato a fondo in citometria a flusso per PMN peritoneali e macrofagi alveolari in coltura e le cellule del 1,2 tessuto del midollo spinale lesionato. Insieme al sistema di gradiente OptiPrep, questi anticorpi utilizzati per la citometria a flusso hanno contribuito alla generazione di un&#39;analisi temporale e quantitativa delle infiammazioni cellulari che ha fornito nuovi aspetti delle dinamiche del microambiente SCI, e individuato per la prima volta una risposta estesa Multiphasic di infiammazione cellulare. Questa risposta multifasico delle cellule dopo SCI può essere importante per indagare il ruolo di specifici tipi cellulari presenti in momenti specifici dopo infortuni o generare interventi terapeutici contro specifici tipi cellulari che possono aggravare le lesioni. Inoltre, questi risultati possono contribuire allo sviluppo di una logica adeguata per gli interventi ottimale droga o cell-based per la SCI.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387 </td></tr><tr><td> Coniglio anti-topo PMN (CIC) </td><td> Chimica accurate e scientifiche </td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td> Topo anti-ratto ED1 (Alexa Fluor 488) </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td> Topo anti-ratto CD3 (CIC) </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma </td><td> T9935 </td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td> Sigma </td><td> D1152 </td></tr><tr><td> MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> Siero di coniglio </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td> Siero di topo </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td> Cellulari Filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry:  a novel use for a cell purification method

Rilevamento di cellule immunitarie nel feriti sistema nervoso centrale (SNC) con tecniche morfologiche e istologiche non ha sempre fornito vera analisi quantitativa di infiammazione cellulare. Citometria di flusso è un metodo veloce alternativa per quantificare le cellule immunitarie nel cervello ferito o tessuto del midollo spinale. Storicamente, la citometria a flusso è stato utilizzato per quantificare le cellule immunitarie raccolti dal sangue o milza dissociati o timo, e solo pochi studi hanno tentato di quantificare le cellule immunitarie nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso con ingredienti freschi tessuti dissociato cavo. Tuttavia, il tessuto dissociato midollo spinale è concentrato con detriti mielina che possono essere scambiate per cellule e ridurre l&#39;affidabilità conta delle cellule ottenute dal citometro a flusso. Abbiamo cercato di migliorare un metodo di preparazione delle cellule utilizzando il sistema gradiente OptiPrep per separare in modo efficace lipidi / mielina detriti dalle cellule, fornendo quantificazioni sensibile e affidabile di infiammazione cellulare nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Come descritto nel nostro recente studio (Beck &amp; Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47), la preparazione delle cellule OptiPrep è aumentata la sensibilità per rilevare l&#39;infiammazione cellulare nel midollo spinale danneggiato, con un numero di specifici tipi cellulari correlazione con la gravità della lesione. Criticamente, l&#39;utilizzo di questo nuovo metodo previsto la prima caratterizzazione dei acuta e cronica infiammazione cellulare dopo SCI per includere un corso completo di tempo per leucociti polimorfonucleati (PMN, neutrofili), macrofagi / microglia e le cellule T per un periodo che varia da 2 ore 180 giorni dopo la lesione (dpi), individuando una fase sorprendente secondo romanzo di infiammazione cellulare. Caratterizzazione approfondita dei infiammazione cellulare con questo metodo può fornire una migliore comprensione della neuroinfiammazione nel SNC feriti, e rivelano una componente importante multifasico di neuroinfiammazione che possono essere critici per la progettazione e realizzazione di razionale strategie di trattamento terapeutico, sia a base di cellule e farmacologici interventi per la SCI.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Quantificazione di infiammazione cellulare nel sistema nervoso centrale feriti / patologico mediante citometria di flusso è complicata da lipidi / mielina detriti che possono avere dimensioni simili e granulazione per le cellule, diminuendo la sensibilità / precisione. Abbiamo cercato di migliorare un metodo di preparazione delle cellule per rimuovere i detriti della mielina e migliorare la rilevazione delle cellule mediante citometria di flusso nel midollo spinale danneggiato.

La valutazione quantitativa delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale mediante citometria di flusso: un nuovo uso per un metodo di purificazione cellulare

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K Views.  University of California. Quantificazione di infiammazione cellulare nel sistema nervoso centrale feriti / patologico mediante citometria di flusso è complicata da lipidi / mielina detriti che possono avere dimensioni simili e granulazione per le cellule, diminuendo la sensibilità / precisione. Abbiamo cercato di migliorare un metodo di preparazione delle cellule per rimuovere i detriti della mielina e migliorare la rilevazione delle cellule mediante citometria di flusso nel midollo spinale dann...

Video: Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

L&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...