DT è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato da Le Fonds de Recherche du Québec-Natura et Technologies (FQRNT) e ha una MITACS Elevate strategico Fellowship. CMC è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato da Le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e Ernest e Margaret Ford cardiologia dotato ricerca borsa di studio presso l&#39;Università di Ottawa Heart Institute. EOB è stato sostenuto da sovvenzioni di funzionamento MOP80204 dal Canadian Institute for Health Research (CIHR) e T6335 dalla Heart and Stroke Foundation of Ontario. Il CIHR e Medtronic collettivamente forniscono EOB con una sedia di ricerca peer-reviewed (URC # 57093). AEP è finanziato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC) Discovery Grant, un supplemento NSERC Discovery Accelerator e riconosce con gratitudine il sostegno dei presidenti di ricerca Canada (CRC) del programma e di un ricercatore Award anticipata dalla Provincia dell&#39;Ontario.

1. Deformazione meccanica di singole cellule <ol><li> Realizzazione di un substrato PDMS con perline fluorescenti incorporati Prima di montaggio del substrato, microsfere fluorescenti in soluzione acquosa vengono risospese in isopropanolo per migliorare perla di miscelazione nelle PDMS dovute alla natura idrofoba. <ol><li> Pipettare 500 ml di microsfere fluorescenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 16.200 xg per 10 min. </li><li> Eliminare il surnatante e aggiungere 500 ml di isopropanolo seguito con 5 min di vortex. Mettere il flaconcino da parte una notte al buio, al fine di consentire eventuali particelle più grandi aggregati a sedimentare. </li><li> La mattina successiva, rimuovere con attenzione il surnatante per una microcentrifuga fiala pulita. Questa soluzione tallone può essere utilizzato per fabbricare più di 5 substrati. NOTA: La soluzione tallone continuerà a sedimentare per i prossimi 3 giorni. Fare attenzione a non risospendere il pellet. </li><li> Versare 0,5 g dell&#39;agente indurente fornitocon il kit PDMS in una microcentrifuga fiala 1,5 ml con una bilancia scientifica. Per fasi successive, aggiungere un totale di 90 ml di perle (in sei 15 microlitri integrazioni), vortex per 1 minuto tra ogni aggiunta. Mettere da parte. </li><li> Pesare 10 g di PDMS e mescolare per almeno 12 minuti con 0,5 g di agente reticolante integrato con perline fluorescenti. </li><li> Realizzare un SU-8 2050 stampo a forma di croce con tecniche di fotolitografia standard, seguendo le istruzioni del produttore. Lo stampo utilizzato ha un&#39;altezza di 320 micron e una superficie del 13,4 cm 2 (Figura 3). Lo stampo può contenere 428 ml o 440 mg di PDMS. </li><li> Versare 400 mg di PDMS con perline nello stampo a forma di croce con una pipetta di trasferimento e curare per 2 ore a 80 ° C. Dopo l&#39;indurimento, staccare il substrato dallo stampo (Figura 5A). Il substrato può essere conservato in una piastra di Petri a temperatura ambiente per 2 settimane senza mostrare variazioni significative relative proprietà meccaniche. </li&gt; <li> Versare goccioline di PDMS (induritore: PDMS con un rapporto di 1,20) in una piastra di Petri con una dimensione finale di circa 4 mm di diametro e curare capovolti per 2 ore a 80 ° C (Figura 5B). Queste caratteristiche di ancoraggio possono essere conservati in una capsula di Petri per settimane. NOTA: Mantenere il piatto capovolto per evitare che le gocce di appiattimento durante il processo di polimerizzazione. </li><li> Trattamento aria-plasma (30 sec a 30 W), il substrato e 8 funzioni di ancoraggio. Associare le caratteristiche su ciascuna estremità del substrato ad una distanza di 4 mm dal trattino forma quadrata presenti sul substrato (Figura 5C). </li></ol></li><li> Montaggio membrana sui morsetti <ol><li> Avvolgere ogni estremità del substrato intorno alla parte cilindrica scanalato dei morsetti e fissarlo in posizione con le 2 viti di fissaggio dalla parte superiore (Figura 2B e figure 5D-E). </li><li> Avvitare le 4 fascette sul supporto pinza e versare PDMS (rapporto 01:20) utilizzando un t usa e gettaransfer pipetta all&#39;interfaccia tra il substrato e la parte cilindrica scanalata dei morsetti. Stendere le PDMS non induriti intorno alla parte cilindrica scanalata utilizzando una chiave esagonale da 1,5 millimetri. </li><li> Versare PDMS (1,20) nelle scanalature completamente riempito per azione capillare e curare il montaggio a 80 ° C per 2 ore (Figura 5F). </li></ol></li><li> Semina celle dal Membrane <ol><li> Trattamento aria plasma (30 sec a 30 W) l&#39;intero gruppo di sterilizzare e funzionalizzare il substrato per consentire rivestimento collagene. </li><li> Funzionalizzare la superficie del substrato dove saranno seminate cellule con 1 ml di 0,02 M di acido acetico, completata con 16 ug / ml di coda di topo collagene a temperatura ambiente per 1 ora. La densità collagene finale desiderato è 5 mg / cm 2. </li><li> Sciacquare il 3x supporto con tampone fosfato e lasciare asciugare a temperatura ambiente per almeno 10 min. </li><li> Aggiungere 40 ml di mezzo di coltura supplementato con 10% fetale Seru bovinam e 1% di penicillina-streptomicina contiene 2.000 celle nella parte centrale del substrato per coprire una superficie di 1 cm 2 (densità delle cellule: 20 cellule / mm 2). Densità cellulare può essere modificata a seconda delle esigenze sperimentali. </li><li> Mettere tutto assieme in un incubatore di coltura cellulare standard con il substrato rivolta verso l&#39;alto con la goccia di terreno di coltura contenente cellule su di esso. NOTA: Il gruppo deve essere conservato con il substrato rivolto verso l&#39;alto per almeno 3 ore per permettere alle cellule di allegare saldamente. Per evitare l&#39;evaporazione, 30 ml di terreno di coltura caldo viene aggiunto nella goccia sul substrato ogni 45 min per 3 ore. </li><li> Dopo 3 ore, capovolgere l&#39;intera assemblea in una capsula di Petri riempita con terreno di coltura fresco per immergere il substrato e incubare una notte per consentire alle cellule di proliferare. </li><li> Il giorno successivo, preparare la soluzione salina tamponata con HEPES (HBSS, 20 mM di Hepes, 120 mM di NaCl, 5,3 mM di KCl, 0,8 mM di MgSO4, 1.8 mM di CaCl 2, e 11,1 mM di dextrose). Regolare il pH a 7,4. NOTA: La soluzione HBSS deve essere preparata giornalmente e mantenute a 37 ° C durante gli esperimenti. Questa soluzione fisiologica viene utilizzato per mantenere le cellule sul palco microscopio imitando il normale ambiente di tessuto / sangue. </li><li> Montare il set-up sul contrasto di fase invertito o microscopio a fluorescenza Montare il gruppo pinza-substrato sulla piattaforma e motori BAXS. Riempire il piatto di Petri all&#39;interno del riscaldatore piatto di Petri con tampone HEPES (Figura 2D). </li></ol></li></ol> 2. Rigidità stazzatura delle navi di piccolo calibro <ol><li> Preparazione <ol><li> Soluzione fisiologica Krebs: Preparare una soluzione di 118,1 mM NaCl, 11.1 mM D-glucosio, 25 NaHCO mm 3, 4.7 mM KCl, 1,2 MgSO mm 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, e 2,5 mM CaCl 2. Aggiustare il pH a 7,4 e ossigenare la soluzione con gas medicali CarboGen (95% O 2/5% CO 2) per 30 min. NOTA: Il soluti Krebson deve essere preparato giornalmente e mantenute a 37 ° C durante gli esperimenti. Questa soluzione fisiologica viene utilizzato per mantenere i tessuti vivi simulando l&#39;ambiente normale tessuto / sangue. </li><li> Raccogliere strumentazione per la dissezione e la valutazione meccanica dei vasi aortici: forbici chirurgiche, pinzette piegate, micro-forbici, microscopio da dissezione chirurgica, 50 ml provette per centrifuga in polipropilene, e 10 ml pipette sierologiche. La procedura chirurgica e esperimento non richiede condizioni sterili. Montare i morsetti della piattaforma BAXS con la cella di carico anticipo. </li></ol></li><li> Isolamento tessuti e dissezione Tutte le procedure sperimentali su animali da laboratorio devono essere approvati dal comitato degli utenti cura degli animali ed uso &#39;istituzione, conforme alla Guida alla salute per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio degli utenti&#39; paese. <ol><li> Eseguire il mouse eutanasia con l&#39;inalazione del 99% di CO 2 (7 psi)in una (Figura 6A) camera di plexiglas. </li><li> Aprire il mouse addome e tagliare l&#39;aorta toracica a sanguinare il mouse. </li><li> Rimuovere il diaframma, la gabbia toracica e lobi polmonari (Figura 6B). NOTA: Per ridurre al minimo il rischio di danneggiare il tessuto, mantenere il cuore attaccato alla aorta ed evitare di toccare direttamente il vaso ma manipolarlo usando cuore. </li><li> Rimuovere cuore, la radice aortica e dell&#39;aorta toracica tagliando delicatamente tra la nave e la colonna vertebrale. NOTA: Non provocare alcun allungamento in nave durante l&#39;escissione di mantenere la struttura interna del tessuto intatto (Figura 6C). </li><li> Immergere immediatamente e mantenere il cuore e l&#39;aorta in soluzione Krebs. </li><li> Tagliare e lavare accuratamente l&#39;aorta in soluzione Krebs per rimuovere eventuali coaguli di sangue. Rimuovere il tessuto connettivo utilizzando micro-forbici, pinzette e chirurgico microscopio da dissezione (Figura 6D-E). NOTA: Conservare tutta la lunghezza della nave e utilizzare il aorradice tic per determinare l&#39;orientamento nave. </li></ol></li><li> Mezzo Dimension Determinazione e montaggio Per determinare la rigidità della nave, dalle dimensioni del serbatoio scaricate sono necessari e possono essere determinate con un microscopio calibrato. <ol><li> Tagliare un anello aortico di circa 2 mm di lunghezza e misurare con precisione la sua lunghezza con una impostazione (figure 6F-G) microscopio calibrato. Mettete questo segmento da parte in soluzione di Krebs. </li><li> Tagliare un altro anello aortico più piccolo possibile tra ciascuno dei segmenti mm2 (Figura 6F). Mettere questo piccolo segmento su un vetrino da microscopio con il lume rivolto verso l&#39;alto e misurare lo spessore della parete utilizzando un&#39;impostazione microscopio calibrato (Figura 6H). </li><li> Riempire il piatto Petri sulla piattaforma BAXS con soluzione di Krebs e inserire il segmento anello aorta 2 mm perni di trazione (riquadro in Figura 4C). </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. PDMS substrato di fabbricazione e di montaggio. A) Dopo l&#39;indurimento, il substrato viene accuratamente staccata il SU-8 2050 stampo e mettere da parte in una capsula di Petri. B) Ancoraggio caratteristiche fatte di PDMS e aiutano a fissare il supporto sul morsetti. C) Substrato di ancoraggio caratteristiche pronta per il montaggio. D) Il substrato è montato sui morsetti 4, che vengono poi montati sul supporto del morsetto (vedi riquadro). E) Un&#39;immagine dettagliata del substrato montati sulle 4 morsetti. F ) Procedimento di colata PDMS alla scanalatura sottostante substrato. La freccia indica il PDMS lentamente riempiendo la scanalatura per capillarità. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 6. Preparazione ed isolamento dell&#39;aorta toracica. A) Preparazione di strumenti chirurgici e il mouse eutanasia. B) attraverso un&#39;incisione longitudinale addominale, la gabbia toracica e pallonetti polmonari vengono rimossi. C) L&#39;aorta è attentamente rimosso usando il cuore per manipolare il tessuto. D) Il cuore e aorta sono messi in soluzione fisiologica Krebs. L&#39;aorta viene pulita rimuovendo tutti i tessuti connettivi. E) Immagine dettagliata che mostra l&#39;. F) segmento aorta cuore e aorta utilizzata per la valutazione rigidità con piccoli segmenti utilizzati per la misura di spessore. GH) La lunghezza precisa (G) e spessore (H) ripartiti per segmenti di flotta vengono valutate utilizzando un microscopio inverso e un programma di analisi.

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C., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+collagen+production+of+human+patellar+tendon+fibroblasts+in+response+to+cyclic+uniaxial+stretching+in+serum-free+conditions.">Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions.</a> J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).</li><li>Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-induced+cell+polarisation+is+linked+to+RhoA-driven+microtubule-independent+focal-adhesion+sliding.">Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding.</a> J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).</li><li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments.">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li><li>Zdero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+and+torsional+mechanical+characteristics+of+intact+and+reconstructed+scapholunate+ligaments.">Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments.</a> J Biomech Eng. 131, (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La piattaforma BAXS qui presentato facilita numerosi esperimenti nello studio di mechanobiology, dalle indagini di singole cellule ai tessuti interi. Inoltre, la piattaforma è altamente flessibile e configurabile, consentendo numerosi esperimenti di stimolazione meccanici e prove di trazione multiassiale. La piattaforma consente anche la manutenzione di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche e permette di microscopia simultanea durante gli esperimenti di stretching. I due esperimenti descritti nelle sezioni prece...

Il microambiente meccanica svolge un ruolo importante in molte funzioni cellulari come la proliferazione, migrazione e differenziazione, che hanno un profondo impatto nello sviluppo e omeostasi dei tessuti e anche in malattie 1-6. Nel corso degli anni, una moltitudine di strumenti sperimentali sono stati utilizzati per stimolare meccanicamente cellule o tessuti e misurare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici con l&#39;obiettivo di aumentare la nostra comprensione di mechanobiology base e studiando l&#39;insorgenza e la progressione delle malattie 6-17. Tuttavia, si deve spesso basarsi su varie differenti dispositivi sperimentali per conseguire gli obiettivi di un particolare studio. Questo articolo presenta un unico multi-funzionale, allungamento biassiale (BAXS) piattaforma, che consente per gli studi che indagano il ruolo che le proprietà meccaniche e le forze meccaniche giocano in biologia a livello sub-cellulare per intere scale di lunghezza del tessuto. La piattaforma BAXS permette non solo per la quantification delle proprietà meccaniche dei tessuti isolati, ma agevola anche la capacità di applicare campi di deformazione semplici, complessi e dinamici di cellule viventi per capire le loro risposte a deformazione che si verifica in vivo. La piattaforma BAXS mantiene anche la capacità di eseguire la microscopia live-cell durante le prove meccaniche e perturbazioni sulle cellule e tessuti. La piattaforma BAXS è un apparecchio su misura che può essere usato per studiare l&#39;effetto di substrato deformazione a livello cellulare ed eseguire prove di trazione sui tessuti biologici (Figura 1A). Un riscaldatore di alluminio è stato fabbricato per accogliere un piatto 10 cm Petri standard mantenere le soluzioni fisiologiche a 37 ° C utilizzando un regolatore di temperatura e riscaldatori kapton (Figura 1B). Questa piattaforma BAXS può essere integrato su un contrasto di fase invertita e / o microscopio a fluorescenza e permette l&#39;imaging simultaneo (Figura 1C).In breve, la piattaforma BAXS consiste di quattro motori voice coil lineari i cui movimenti sono montati su sfere in miniatura movimento lineare guide a orientate lungo due assi ortogonali (Figura 1D). Una tavola di posizionamento lineare è montato a ciascuno dei quattro motori per consentire il movimento verticale del sistema di bloccaggio che verrà utilizzato (Figura 1E). La posizione di ciascun motore è controllato da un encoder ottico con una risoluzione di 500 nm (Figura 1F). Tutti e quattro i motori sono controllati in modo indipendente con un controller di movimento impiegando encoder ottici per eseguire comandi di movimento (Figura 1G). Un&#39;interfaccia LabVIEW fornisce il pieno controllo della grandezza spostamento, velocità e accelerazione di ciascun motore per generare deformazioni completamente personalizzabile, statica e dinamica, delle cellule o campioni di tessuto. La tecnica utilizzata per indurre una deformazione in cellule avviene semplicemente allowincellule g di aderire saldamente ad un substrato flessibile e trasparente e poi si estende questo supporto con i quattro motori della piattaforma BAXS. La piattaforma BAXS permette il montaggio di un set custom-designed di morsetti per il fissaggio del supporto sui motori voice coil. A questo scopo, abbiamo progettato una serie di morsetti per cui un substrato flessibile e trasparente, fatta di polidimetilsilossano (PDMS), può essere fissata (figure 2A-C e Figura 3). Come i morsetti saranno esposti a soluzioni fisiologiche, tutte le parti sono state lavorate da acciaio inossidabile per consentire la sterilizzazione. Questi morsetti sono stati accuratamente progettati per portare il substrato più vicino possibile al microscopio obiettivo di migliorare la qualità dell&#39;immagine riducendo al minimo lo stress sul substrato durante stiramento (Figura 2D). La stessa piattaforma BAXS può anche essere usato per quantificare la rigidità di piccoli campioni di tessuto, utilizzando un insieme appropriato di pinze con adattatoreTED supporti per i campioni di tessuto e una cella di carico per controllare le forze. Diversi approcci possono essere adottate per montare un tessuto ai motori piattaforma BAXS; in questo caso l&#39;acciaio inossidabile minutiens insetti spilli possono agganciare attraverso l&#39;apertura di tessuti vascolari per eseguire prove di trazione (Figure 4A-B). In alternativa, per i tessuti spessi senza apertura naturale, bordi di tessuto può essere tenuto in posizione con i morsetti collegati ai motori voice coil o incollati ai piccoli vetrini con colla biologica e collegati ai motori con le pinze. Al fine di effettuare test di trazione è richiesta una cella di carico miniatura e facilmente integrabile sui motori piattaforma BAXS e usato per misurare la forza che agisce sul tessuto durante un ciclo stiramento (Figura 4C). Mentre la piattaforma BAXS è composta di quattro motori, l&#39;introduzione di una seconda cella di carico permette di eseguire prove di trazione lungo due direzioni ortogonali. Questa capacità consente di quantify la rigidità meccanica di un singolo tessuto lungo due direzioni perpendicolari durante lo stesso esperimento. È importante sottolineare che, in tutte le configurazioni, le cellule o campioni di tessuto di interesse sono sempre mantenuti in un bagno a temperatura controllata che è accessibile all&#39;utente. Questa capacità consente l&#39;introduzione di agenti farmacologici durante campione estende per esaminare la risposta temporale del campione. Inoltre, come l&#39;asse ottico del microscopio invertito rimane libera, tutte le forme di microscopia sono ancora disponibili per l&#39;utente. Infine, come tutti i quattro motori della piattaforma BAXS sono indipendenti è possibile applicare campi di deformazione altamente configurabili al campione di interesse. In vivo cellule e tessuti sono esposti a complessi e anisotropo stiramento che può essere più appropriatamente imitato in questa piattaforma rispetto tradizionali monoassiale allungamento piattaforma 7,13,15,18,19. Inoltre, le caratteristiche fisichedel campo di deformazione può essere modificato al volo durante un esperimento. Queste capacità consentono all&#39;utente di esaminare la risposta cellulare e tissutale livello ad un ampio numero di elevata complessità, anisotropo, temporalmente, e campi di deformazione spazialmente variabili. Questo articolo descrive i vantaggi e le limitazioni della piattaforma BAXS così come il suo design, principi di funzionamento, ed i dettagli sperimentali per singola cella e gli esperimenti dei tessuti interi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Panoramica della piattaforma BAXS. A) Vista dall&#39;alto della piattaforma BAXS che mostra i quattro motori voice coil. B) quadro dettagliato del riscaldatore piastra di Petri usato per mantenere le cellule e tessuti a 37 ° C. C) La piattaforma può essere montato su un microscopio invertito per eseguire live- imaging cellulare durante gli esperimenti di stretching.D) Immagine dettagliata del motore bobina; la parte mobile della piattaforma. E) quadro dettagliato della fase di posizionamento lineare che permette lo spostamento verticale dei sistemi di bloccaggio. F) quadro dettagliato del encoder ottico che fornisce la posizione in tempo reale del motore per il controller di movimento. G) Immagine dettagliata del controller di movimento che mostra i quattro ingressi encoder ottici e le uscite di potenza per i quattro motori voice coil. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Sistema di bloccaggio per esperimenti sulle cellule stretching. AB) immagini che mostrano i dettagli dei morsetti utilizzati per fissare il substrato PDMS ai motori voice coil per stiramento. C) Il substrato è avvolto attorno alla parte cilindrica del morsetto con la sua featur ancoraggioes seduto nella scanalatura in alto. Poi il substrato è fissato con le viti che spingono il substrato / ancoraggio caratteristiche nella scanalatura superiore. D) Illustrazione della piattaforma BAXS con i morsetti tenendo il substrato in posto. L&#39;inserto mostra una vista dettagliata del substrato con cellule attaccate ad esso seduto sopra un vetrino e l&#39;obiettivo microscopio. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Distinte dei materiali della membrana e del suo sistema di bloccaggio. Disegni con le dimensioni delle parti principali integrati alla piattaforma biassiale effettuare esperimenti sulle cellule stretching. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Exampio di un sistema di bloccaggio per valutare la rigidità di vasi di piccolo calibro. AB) Quadri dettagliati del dispositivo di fissaggio utilizzato per indurre la deformazione in una aorta topo diametro di 1 mm. Spilli di acciaio inossidabile sono stati accuratamente modellate in triangoli aperti per permettere alla nave di scivolare su entrambi i pin. C) Illustrazione della piattaforma BAXS con i morsetti mantenere la nave e una cella di carico divisoria tra motore fisso e il morsetto sinistro. L&#39;inserto mostra una vista dall&#39;alto dettagliata della nave montato sui perni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PDMS</td>
			<td style="width:155px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:255px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:167px;">The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">FluoSpheres fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">F8810</td>
			<td>Keep away from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Linear voice coil</td>
			<td style="width:155px;">Moticont</td>
			<td style="width:255px;">LVCM-051-051-01</td>
			<td>The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Ball bearing slide</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">NT37-360</td>
			<td>Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">linear positioning stage</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">38-960</td>
			<td>Center Drive 1.25&#34; Square Linear Translation Stages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">optical encoder</td>
			<td style="width:155px;">GSI microE systems</td>
			<td style="width:255px;">Mercury II 1600S - 0.5um resolution</td>
			<td>reflective incremental encoder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">motion controller</td>
			<td style="width:155px;">Galil</td>
			<td style="width:255px;">DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440</td>
			<td>4 axis controller with a 4 axis amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">load cell&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Honeywell</td>
			<td style="width:255px;">31 low</td>
			<td>miniature load cell with a range of 0-150 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Insect minutiens pins (0,20mm)</td>
			<td style="width:155px;">Pin Service Austerlitz Insect pins</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SU-8 2050</td>
			<td style="width:155px;">Micro Chem</td>
			<td style="width:255px;">SU-8 2050</td>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Air-plasma treatment system</td>
			<td style="width:155px;">Glowresearch</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Autoglow Oxygen Plasma System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A10483-01</td>
			<td>Collagen I, Rat Tail 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">R37605</td>
			<td>DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">KHLV-0504/(10)-P</td>
			<td>28V flexible heaters; can be supplied with a 24V</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">CN63200-R1-LV</td>
			<td>Temperature controller; supply 24 V.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">DMEM culture medium</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3024301</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SV30010</td>
			<td>Keep stock frozen. Keep working solution at 4 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3039603C</td>
			<td>Keep frozen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Trypsin 0,05%</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH30236,02</td>
			<td>Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hepes</td>
			<td style="width:155px;">Wisent Inc</td>
			<td style="width:255px;">330-050-EL</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP358-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">KCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP366-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">MgSO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">M65-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C614-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dextrose</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP220-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP328-1</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP362-500</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">Carbogen 95% O2/ 5% CO2</td>
			<td style="width:155px;">Lindle</td>
			<td style="width:255px;">DIN:02154749</td>
			<td>Krebs physiological solution oxygenation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1404</td>
			<td>Microtubules depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cytochalasin-D</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C8273</td>
			<td>Actin filaments depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-&#945;-SMA-FITC</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">F3777</td>
			<td>Used to stain and quantify smooth muscle cells content</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Picrosirius red stain</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td style="width:255px;">43665</td>
			<td>Used to stain and quantify collagen content</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stretching platform for applications in cell and tissue mechanobiology

Strumenti che consentono l&#39;applicazione di forze meccaniche alle cellule e tessuti o che possono quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mechanobiology base. Queste tecniche sono stati ampiamente utilizzati per dimostrare come l&#39;insorgenza e la progressione di diverse malattie sono fortemente influenzati da stimoli meccanici. Questo articolo presenta un allungamento biassiale (BAXS) piattaforma multi-funzionale che può sia stimolare meccanicamente le cellule singole o quantificare la rigidità meccanica dei tessuti. La piattaforma BAXS consiste di quattro motori voice coil che possono essere controllati in modo indipendente. Singole cellule possono essere coltivate su un substrato flessibile che può essere collegato ai motori permettendo di esporre le cellule a campi di deformazione complessi, dinamici e spazialmente variabili. Viceversa, incorporando una cella di carico forza, si può anche quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti primari come sono esposti a cicli di deformazione.In entrambi i casi, un adeguato sistema di aggancio deve essere progettato e montato ai motori piattaforma BAXS per trattenere saldamente il substrato flessibile o tessuto di interesse. La piattaforma BAXS può essere montato su un microscopio invertito effettuare simultanea luce trasmessa e / o fluorescenza per esaminare la risposta strutturale o biochimica del campione durante gli esperimenti di stretching. Questo articolo fornisce dettagli sperimentali di progettazione e l&#39;utilizzo della piattaforma BAXS e presenta risultati per singola cella e gli studi di tutto il tessuto. La piattaforma BAXS stato usato per misurare la deformazione di nuclei in cellule singole topo mioblasti in risposta al substrato ceppo e per misurare la rigidità di isolato aorte topo. La piattaforma BAXS è uno strumento versatile che può essere combinato con vari microscopia ottica al fine di fornire nuovi approfondimenti mechanobiological ai livelli tissutali sub-cellulari, cellulari e complesso.

Cella Stretching La piattaforma BAXS stato usato per studiare la risposta meccanica del nucleo in cellule singole topo mioblasti (C2C12) esposta a una deformazione substrato del 25%. Mioblasti si trovano nel tessuto muscolare e sono costantemente esposti a stiramento meccanico e compressione in vivo. Le proprietà di forma e meccaniche del nucleo cellulare hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella regolazione dell&#39;espressione genica e l&#39;attività...

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A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Presentiamo in questo articolo un romanzo stiramento piattaforma che può essere usato per studiare le risposte delle cellule singole a complessi anisotropo deformazione meccanica biassiale e quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici.

Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Views.  University of Ottawa.  Presentiamo in questo articolo un romanzo stiramento piattaforma che può essere usato per studiare le risposte delle cellule singole a complessi anisotropo deformazione meccanica biassiale e quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici. 

Video: A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ricerca

Bioingegneria

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Una nuova tecnica di sutura Tenorrhaphy con innesto di collagene ingegnerizzato per riparare grandi difetti tendinei

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...