Questo protocollo è significativo in quanto consente di inucidare il ruolo delle forze cellulari in molti processi fisiologici e patologici, come la guarigione delle ferite e le metastasi tumorali, per esempio. Il principale vantaggio di questa tecnica basata sulla meccanica è la sua capacità di interrompere simultaneamente le giunzioni cellulari e misurare il suo impatto sulle forze meccaniche generate dalle cellule, principalmente trazioni e fattori di stress intercellulari. Il nostro protocollo è applicabile a una vasta gamma di processi fisiopatologici, come metastasi tumorali, aterosclerose e ipertensione, per esempio.
I nostri metodi possono essere integrati per eseguire analisi biochimiche e biomeccaniche con modelli organo su chip, costrutti di tessuti bio-ingegnerizzati, sistemi di somministrazione di farmaci in vitro e sistemi di co-coltura tissutale. Il nostro protocollo è abbastanza semplice da eseguire. Tuttavia, consigliamo a coloro che es fanno questo protocollo per la prima volta di avere pazienza e di non affrettarsi attraverso i passaggi di questo protocollo.
Il nostro protocollo ha passaggi unici che potrebbero non essere chiari per gli utenti per la prima volta. Pertanto, incoraggiamo gli utenti a seguire le nostre procedure dettagliate scritte e a utilizzare le dimostrazioni visive come guida. Per iniziare, preparare la soluzione blind-silane mescolando 200 millilitri di acqua ultra pura con 80 microlitri di acido acetico e 50 microlitri di metacrilato di silane.
Mescolare la soluzione Bind-silane su una piastra di agitazione per almeno un'ora. Trattare il pozzo centrale di una piastra di Petri con la soluzione Bind-silane per 45 minuti. Rimuovere la soluzione Bind-silane e sciacquare la piastra di Petri con acqua ultra pura da due a tre volte.
Asciugare la superficie della piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente per un uso futuro. Per preparare la soluzione di idrogel, mescolare 12,49 millilitri di acqua ultra pura a 2,062 millilitri di acrilammide al 40% e 375 microlitri di 2%bisacrilammide in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere 80 microlitri di perline fluorescenti alla soluzione di idrogel.
Agitare delicatamente il tubo per mescolare le perline con la soluzione di gel. Tenere il cappuccio sciolto sul tubo di centrifuga e posizionarlo in una camera a vuoto. De-gas la soluzione di gel per almeno 45 minuti nella camera a vuoto.
Per polimerizzare l'idrogel, aggiungere prima 75 microlitri di persolfato di ammonio al 10%, quindi aggiungere otto microlitri di TEMED alla soluzione di idrogel. Posizionare 24 microlitri della soluzione di idrogel al centro della piastra di Petri. Premere sull'idrogel con un coperchio di 18 millimetri scivolare per appiattire l'idrogel e fare un'altezza di circa 100 micrometri.
Attendere almeno 30-40 minuti per la polimerizzazione del gel. Immergere l'idrogel polimerizzato in acqua ultra pura per prevenire la disidratazione del gel. Coprire la piastra di Petri con un foglio di alluminio per evitare il fotolicenza delle perline fluorescenti e conservare a quattro gradi Celsius.
In primo luogo, mescolare la base in silicone PDMS con l'agente polimerizzante in silicone con un rapporto di 20 a uno in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Invertire il tubo capovolto e agitare vigorosamente più volte per garantire una corretta miscelazione della soluzione PDMS. Rimuovere le bolle nella soluzione PDMS centrifugando per un minuto a 190 volte G.Versare da cinque a sei millilitri della soluzione PDMS al centro di una piastra di Petri da 100 millimetri e agitare la piastra fino a quando la soluzione PDMS copre l'intera superficie della piastra di Petri.
Curare la soluzione PDMS durante la notte a 50-60 gradi Celsius. Quindi, rimuovere uno stencil PDMS circolare di 16 millimetri di diametro con un perforatore. Utilizzare un punzone di biopsia di 1,25 millimetri di diametro per creare piccoli fori nello stencil PDMS.
Sterilizzare gli stencil PDMS immergendoli in etanolo al 70% per due o tre minuti, aspirando l'etanolo in eccesso e quindi posizionandoli sotto una luce UV per cinque minuti. Aspirare qualsiasi liquido in eccesso e rimuovere lo scivolo di copertura dall'idrogel. Posizionare lo stencil PDMS sulla superficie dell'idrogel e utilizzare le pinzette per applicare una leggera pressione allo stencil PDMS per garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e la superficie dell'idrogel.
Coprire la superficie dell'idrogel con Sulfo-SAMPA sciolto in soluzione tampone HEPES molare 0.1 ad una concentrazione da uno a 1.000 e posizionare l'idrogel sotto una lampada UV con una potenza di 36 watt per otto minuti. Aspirare l'eccesso di soluzione Sulfo-SAMPA e HEPES e sciacquare l'idrogel due volte con HEPES molare 0.1 seguito da altri due risciacqui con acqua ultra pura. Aspirare l'acqua ultra pura in eccesso e utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rivestire l'idrogel con 0,1 milligrammi per millilitro di Collagene-1.
Coprire il piatto per proteggere le perline fluorescenti dal fotolicenza e conservare l'idrogel a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, aggiungere tre millilitri di 1X Tripina nel pallone e posizionarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti per staccare le cellule dal pallone di coltura tissutale. Dopo la tripsidenza, aggiungere tre millilitri di mezzi di coltura cellulare nel pallone, ruotare per mescolare e trasferire la miscela in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Centrifugare la soluzione cellulare per tre minuti a 1.710 volte G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in mezzo a una concentrazione di 50 volte 10 alle quattro cellule per millilitro. Eserti il piatto di idrogel dal frigorifero. Rimuovere il Collagene-1 dall'idrogel e risciacquare una volta con PBS.
Aggiungere 75 per 10 alle terze cellule nella parte superiore dello stencil PDMS e consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie dell'idrogel per almeno un'ora nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Rimuovere lo stencil PDMS e immergere lo stencil PDMS in 10X Trypsin per 10-15 secondi per rimuovere eventuali celle collegate. Aggiungere almeno due millilitri di supporto alla piastra di Petri e sterilizzare lo stencil spruzzando con il 70% di etanolo, quindi posizionandolo sotto la luce UV per cinque minuti.
Posizionare la piastra di Petri nell'incubatrice per almeno 36 ore o fino a quando non si osserva un monostrato confluente. Immagini di contrasto di fase di 30 minuti prima del trattamento concalcono e due ore dopo il confronto del trattamento con il calcone. Gli spostamenti di perline indotti dalle cellule sono stati osservati diminuire sia in condizioni di calcone a bassa dose che di calcone ad alta dose rispetto ai monostrati HUVEC di controllo.
Prima del trattamento con chalcone, le trazione RMS erano circa 51 Pascal per tutte le condizioni. Dopo il trattamento con calcone, c'è stato un piccolo aumento delle trazioni RMS a 59 Pascal nei monostrati trattati con calcone a basse dosi e una diminuzione quasi doppia delle trazioni RMS a 18 Pascal in monostrati trattati con calcone ad alta dose rispetto al controllo. Il trattamento con Chalcone ha aumentato la magnitudine media normale dello stress intercellulare con bassa dose, ma ha diminuito significativamente la magnitudine media normale dello stress intercellulare con dose elevata rispetto al controllo.
Il trattamento concalcono ha anche diminuito le sollecitazioni intercellulari massime a bassa e alta concentrazione di calcone rispetto al controllo. L'impatto del trattamento con calcone è statisticamente significativo sulla base sia dei test T che del test ANOVA a fattore singolo. Durante il posizionamento dello stencil PDMS sopra il gel, assicurarsi che il gel sia abbastanza asciutto da garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e il gel.
Questo protocollo può anche essere applicato per sondare il contributo biomeccanico di una varietà di giunzioni cellulari, proteine citoscheletriche, molecole di adesione a matrice cellulare o molecole extracellulari con imaging vivo. Con questo protocollo in vitro, i ricercatori possono ora indagare con successo una serie di proprietà biomeccaniche, così come biochimiche durante la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite o metastasi tumorali senza modello animale. Consigliamo ai nostri spettatori di stare molto attenti durante la gestione del calcone e del DMSO poiché l'inalazione di questi farmaci è segnalata come dannosa.
