Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Famiglia Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

1. Anterograda Etichettatura di RGC presinaptici ingressi Nota: Tutti gli esperimenti che comportano l&#39;uso di animali sono stati esaminati e supervisionate dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale (IACUC) in conformità a tutte le direttive NIH. <ol><li> Sterilizzare campo e gli strumenti. </li><li> Anestetizzare mouse con 4 vol% isoflurano in una camera di induzione plexiglas (questa vol% isoflurano lavora per topi neonati-adulti). Osservare i topi strettamente per evitare un eccesso di anestetizzante. ATTENZIONE: Evitare l&#39;inalazione con una evacuazione dei gas di scarico sotto vuoto. </li><li> Dopo 1-3 minuti, (topi anziani richiedono meno tempo) garantire un adeguato livello di anestesia viene ottenuta pizzicando la coda (senza reazione dovrebbe essere osservato) e osservando la frequenza respiratoria (tasso dovrebbe essere lento e costante). </li><li> Posizionare il mouse sotto il microscopio stereo su un lato e posto ogiva consegna 3-4 vol% isoflurano sul muso (neonati &lt;giorno postnatale 10 (P10) ~ 4% vol;&gt; P10 ~ 3% vol). </li><li> Esporre la sclera. Per l&#39;iniezione dei neonati prima di aprire gli occhi, usare un paio di piccole forbici a molla per aprire la palpebra e tirare indietro la pelle per esporre la sclera. Per i topi più anziani, usare le dita per tirare indietro la pelle che circonda l&#39;occhio per esporre la sclera. ATTENZIONE: Nei neonati, a volte un altro taglio perpendicolare all&#39;angolo dell&#39;occhio è necessario. Fate attenzione quando si taglia l&#39;angolo della palpebra in quanto vi è un vaso sanguigno che, se tagliato, si sanguinare eccessivamente. </li><li> Utilizzare una sterile 30,5 G dell&#39;ago per perforare un piccolo foro nel lato dell&#39;occhio nella riga dove inizia la sclera. Fate attenzione a non danneggiare la lente inserendo l&#39;ago quanto basta che lo smusso va nell&#39;occhio. </li><li> Lasciare il vitreo di fuoriuscire dal foro e utilizzare un applicatore con punta di cotone sterile per assorbire il liquido. </li><li> Una volta che il vitreo si è smesso di scorrere fuori dal buco, inserire un ago ended smussato attaccato ad una siringa Hamilton precaricato con anterograda tracciamento colorantenel foro. Attenzione: inserire l&#39;ago lentamente per evitare la puntura all&#39;altro lato dell&#39;occhio o danneggiare la lente. </li><li> Lentamente iniettare colorante nell&#39;occhio. Tipicamente, tossina colerica subunità β coniugato con Alexa 594, 647, o 488 (CTB-594, CTB-647, o CTB-488, 5-6 mg / mL) viene utilizzato per anterogradely ingressi RGC traccia. Per i neonati (≤ P10) 1-2 microlitri è sufficiente e per i topi&gt; P10 ~ 3 ml è sufficiente. Nota: coloranti Alexa sono particolarmente resistenti alla degradazione lisosomiale </li><li> Lasciare l&#39;ago nel foro per alcuni secondi e poi rimuovere lentamente. </li><li> Usare un applicatore con punta di cotone per assorbire il liquido in eccesso e prevenire la tintura di fuoriuscire. </li><li> Applicare una piccola quantità di pomata antibiotica per l&#39;occhio. Se l&#39;occhio è stato aperto chirurgicamente, riposizionare delicatamente le palpebre insieme. </li><li> Se l&#39;iniezione entrambi gli occhi, ripetere la procedura su altro occhio. </li><li> Dopo iniezione (s), lasciare mouse sotto una lampada di calore o su un tappetino di calore fino a quando non comincia a recuperare dal AnesthESIA. </li><li> Ritorno mouse per una gabbia casa pulita e controllare per assicurarsi che sia completamente sveglio prima di tornare alla colonia. </li></ol> 2. Preparare Tissue Imaging Questo protocollo di preparazione dei tessuti viene utilizzato per topi transgenici in cui i fagociti sono etichettati con marcatori fluorescenti (ad esempio, CX3CR1-EGFP per microglia). Se una linea giornalista non è disponibile, il ricercatore può immunostain sezioni di tessuto (vedi discussione). <ol><li> ~ 24 ore dopo l&#39;iniezione, sacrificare il mouse e sezionare il cervello. </li><li> Goccia fissare il cervello in un tubo Falcon riempito con 4% paraformaldeide (PFA) notte a 4 ° C. ATTENZIONE: PFA è tossico. Evitare l&#39;inalazione e l&#39;esposizione della pelle utilizzando in una cappa aspirante o su un tavolo downdraft e indossare dispositivi di protezione individuale. Note: Fissazione può essere più breve (≥ 4 ore). Inoltre, invece di fissaggio goccia, 4% PFA perfusione può essere utilizzata seguito da una correzione 2-24 hr goccia. Tuttavia, il confronto di nei profumid far cadere il cervello neonatale e adulti fissi rivelato alcuna differenza nella qualità dell&#39;immagine o la quantificazione. </li><li> Sciacquare i 3x cerebrali in tampone fosfato (PBS). <ol><li> Versare il cervello e PFA in un peso barca vuota. </li><li> Utilizzare una spatola per trasferire il cervello ad un altro pesare barca piena di PBS. </li><li> Lavare cervello altre due volte in PBS (cervello trasferimento ad altri due pesare barche piene di PBS). </li></ol></li><li> Trasferire il cervello di un tubo Falcon riempito con una soluzione di saccarosio al 30%. Lasciare il cervello in saccarosio a 4 ° C fino al cervello scende sul fondo della provetta (24-48). </li><li> Una volta che il cervello affonda, preparare il cervello per il sezionamento. Le seguenti operazioni sono la preparazione di 40 sezioni micron mobile usando un microtomo a slitta con una fase di congelamento (un criostato può anche essere utilizzato). <ol><li> Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere le parti del cervello che non sono necessari (per la dLGN, rimuovere le parti rostrale e caudale del cervello). </li><li> Congelare il reggisenoin su un foglio di alluminio in ghiaccio secco. Durante questo tempo, congelare la fase microtomo e riempire ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti con 0,5 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB). </li></ol></li><li> Montare il cervello congelato (dovrebbe apparire opaco) sul palco di congelamento. <ol><li> Applicare una piccola quantità di mescola ottimale temperatura di taglio (OCT) per lo stadio. </li><li> Una volta che l&#39;ottobre comincia a congelare, porre il cervello in ottobre La fine del cervello che sarà tagliata deve essere rivolto verso l&#39;alto (ad esempio, per il dLGN, rivolta verso la parte caudale up). </li><li> Coprire il cervello e ottobre con ghiaccio secco molto finemente tritato. </li><li> Lascia ghiaccio secco sul cervello / ottobre per ~ 30 sec. </li><li> Utilizzare un grande pennello per rimuovere il ghiaccio secco. Il cervello e ottobre devono essere congelati allo stadio. </li></ol></li><li> Iniziare sezionamento attraverso il tessuto fino a raggiungere la regione di interesse (ROI). </li><li> Una volta raggiunta la ROI, utilizzare un piccolo pennello per rimuovere sezioni dalla lama e trasferirli alla piattaforma 24 pozzettie contenente 0,1 M PB (passo 2.5.2). Mantenere il pennello umido bagnando nel 0,1 M PB prima di rimuovere sezioni dalla lama. Nota: Le sezioni possono essere lasciati in 0.1 M PB notte a 4 ° C. </li><li> Una volta che le sezioni sono stati raccolti, visualizzare l&#39;etichettatura anterograda sotto un microscopio a fluorescenza dissezione e scegliere le sezioni che contengono il ROI. </li><li> Montare le sezioni su un vetrino con un piccolo pennello. <ol><li> Applicare una piccola piscina di 0,1 M PB ad un vetrino da microscopio carica. </li><li> Trasferire la sezione di tessuto al pool di PB. </li><li> Utilizzare il PB e pennello per orientare e diffondere il tessuto. </li><li> Utilizzare un Kimwipe per favorire l&#39;eccesso PB. Fare attenzione ad evitare traspirazione fuori la sezione. </li><li> Lasciare asciugare completamente. </li><li> Applicare una piccola goccia di soluzione di montaggio per ogni sezione e montare un coprioggetto sulla parte superiore (22 x 50 mm, No. 1.5). </li><li> Sigillare i bordi di scorrimento con smalto e conservare a -20 ° C fino sessione di imaging. Nota: Anche se di imaging conin una settimana di preparazione è consigliata, vetrini possono essere mantenuti a -20 ° C per diverse settimane prima di imaging. </li></ol></li></ol> 3. Tissue Imaging Tutte le immagini sono acquisite su un disco rotante microscopio confocale (UltraView Vox disco rotante microscopio confocale equipaggiato con laser a diodi (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm e 640 nm)). Le immagini possono anche essere acquisite su qualsiasi microscopio con la capacità di acquisire ad alta risoluzione Z-stack (ad esempio, scansione laser microscopio confocale, microscopio epifluorescente seguita da deconvoluzione, ecc). Dimensione del frame è tipicamente 1.000 x 1.000 pixel. <ol><li> Trova ROI a 10X di ingrandimento e di acquisire un&#39;immagine. Per l&#39;imaging microglia nel sistema retinogeniculate, il ROI è sezioni dLGN più mediale. </li><li> Passaggio a più alto ingrandimento (obiettivo 60X Plan Apo, NA = 1.4, viene di solito utilizzato). </li><li> Acquisire primo campo visivo contenente fagociti utilizzando 0,2 micron z-passos. </li><li> Acquisire 15-19 più campi contenenti fagociti per animale. </li></ol> 4. Preparare Immagini per Quantificazione (ImageJ) <ol><li> Aperto z-stack in ImageJ. </li><li> Vai al menu Immagine, selezionare il colore e canali di Spalato. </li><li> Sottrarre sfondo dal canale (s) contenente il materiale inghiottito. <ol><li> Selezionare la finestra del canale contenente il materiale inghiottito (ad esempio, ingressi presinaptici). </li><li> Vai al menu Processo e selezionare Sfondo Sottrai. Utilizzare un raggio palla di 10 pixel per anterograda tracciamento degli ingressi presinaptici nel dLGN. Nota: Il raggio palla viene determinata empiricamente. Tuttavia, dovrebbe generalmente essere grande come il raggio del più grande oggetto nell&#39;immagine che non fa parte dello sfondo. </li></ol></li><li> Smooth il canale contenente la fagociti. <ol><li> Selezionare la finestra contenente il canale fagociti (ad esempio, microglia). </li><li> Vai al menu Processo e select Filtri, intendo. Utilizzare un filtro medio di 1,5 (questa leviga l&#39;immagine per il rendering di superficie in fasi successive). </li></ol></li><li> Sottrarre da sfondo il canale contenente la fagociti. <ol><li> Selezionare la finestra contenente il canale fagociti (ad esempio, microglia). </li><li> Vai al menu Process, selezionare sfondo sottrarre (impostazioni dovranno essere empiricamente determinato). Utilizzare un raggio palla di 50 pixel per microglia EGFP-positivi. </li></ol></li><li> Unisci canali andando al menu Immagine e selezionando colori, unione Canali. </li><li> ROI Crop contenente fagocita da file unito (questo rende la superficie di rendering più veloce, punto 5). <ol><li> Tracciare un riquadro intorno al ROI utilizzando lo strumento di selezione rettangolare nella barra degli strumenti. </li><li> Vai al menu Image e selezionare Ritaglia. </li></ol></li><li> Split nuovamente i canali (vedi punto 4.2). </li><li> Salvare ogni canale come file TIFF. </li></ol> 5. Preparare Immagine per la quantificazionein Imaris <ol><li> Aprire Imaris e fare in modo che l&#39;icona del volume è selezionato nel menu in alto a sinistra (Figura 2). </li><li> Aperto primo canale immagine ritagliata di (uno qualsiasi dei canali può essere aperto prima, basta essere coerenti). </li><li> Aggiungere l&#39;altro canale (s). Vai al menu Modifica, selezionare Aggiungi canali e selezionare il canale successivo nel file. (Ripetere questo passaggio per tutti i rimanenti canali). Nota: Per cambiare il colore, andare alla finestra di regolazione del display e fare clic sul nome del canale (Figura 3A). Si aprirà una finestra di dialogo per regolare il colore. Se la finestra di regolazione del display non è visibile, andare al menu Modifica e selezionare Regolazione visualizzazione. </li><li> Regolare i valori dei pixel. Vai al menu Modifica e selezionare Proprietà immagine. In questa finestra, regolare x, y, z ed i valori dei pixel (Questi valori dipendono dal microscopio, obiettivo, fotocamera e acquisizione z-passo e possono essere trovati nel software utilizzato per acquisire l&#39;immagine). </li><li> Fase 5.5 si tradurrà in unpiccola. Per ridimensionare, fare clic sull&#39;icona Fit nell&#39;angolo in basso a destra (Figura 2). </li><li> Nella finestra di regolazione del display, regolare la luminosità e il contrasto per ciascun canale utilizzando i triangoli sinistro e centrale. </li></ol> 6. 3 dimensioni (3D) Rendering Superficie del Fagocita <ol><li> Nella barra degli strumenti in alto, assicurarsi che la modalità Superare è selezionato (Figura 3C). </li><li> Nella finestra di Regolazione visualizzazione, deselezionare tutti i canali eccetto il canale fagociti. Questo rimuoverli dal campo visivo. </li><li> Fare clic sull&#39;icona di rendering di superficie (Figura 2). </li><li> Una finestra creare verrà visualizzata nella parte sinistra in basso (Figura 4A), assicurarsi di settore ROI è deselezionata in questa prima finestra. Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso. </li><li> Regolare il livellamento. <ol><li> Nella finestra successiva, scegliere il canale phagocyte dal menu a discesa (Figura 4B). Consente di regolare laquantità di dettagli che verranno a galla e dovrebbe essere determinato in modo empirico (0,1 micron smoothing viene in genere utilizzato per microglia). </li><li> Selezionare soglia assoluta. </li><li> Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso. </li></ol></li><li> Threshold l&#39;immagine. <ol><li> Clicca su istogramma e trascinare fino immagine è emerso in modo appropriato (Figura 4C). Questo è determinato empiricamente ruotando l&#39;immagine di garantire le superfici grigie sovrapposta all&#39;immagine fluorescente sono una rappresentazione accurata superficie. Note: Per ruotare, selezionare Naviga nel menu puntatore sul lato superiore destro dello schermo (Figura 3B), cliccare e tenere premuto l&#39;immagine da ruotare. Per tornare sull&#39;immagine per orientamento originale, selezionare Fondo Origine sinistra dal menu Visualizza. </li><li> Fare clic sul pulsante blu in avanti in basso. </li></ol></li><li> Nella finestra successiva, c&#39;è la possibilità di filtrare tutte le superfici in base alle dimensioni, ecc Se l&#39;immagine è molto rumoroso, non filtrare ed eliminare unI filtri y che appaiono automaticamente. Fare clic sulla freccia verde in basso per terminare superficie rendering del fagociti. Apparirà una nuova serie di schede (Figura 5) </li><li> Se necessario, eliminare eventuali superfici che non fanno parte del fagociti di interesse. <ol><li> Assicurarsi che l&#39;opzione Select è selezionato nel menu Pointer (Figura 3B). </li><li> Clicca su qualsiasi superficie da eliminare in modo che diventa giallo. Per eliminare più superfici, fare clic sulle superfici tenendo premuto il pulsante di controllo. </li><li> Fare clic su Elimina nella scheda Pencil. </li></ol></li><li> Selezionare e unire tutte le superfici del fagocita in una superficie. <ol><li> Clicca sul Funnel (ie scheda Filtro, Figura 5C). </li><li> Fare clic su Aggiungi. </li><li> Scegliere qualsiasi filtro, trascinare l&#39;istogramma all&#39;estrema sinistra (tutte le superfici devono essere di colore giallo). </li><li> Torna alla scheda Matita e fare clic su Unify. </li></ol></li><li> Vai alla scheda grafico (Figura 5A </strong&gt;) e fare clic su Dettagli e selezionare i parametri da visualizzare. Selezionare il volume (Figura 5D). Per la visualizzazione di più parametri, andare sull&#39;icona della chiave inglese in basso a sinistra (Figura 2) e di selezionare i parametri da registrare. </li><li> Registrare il volume del phagocyte e salvare il file prima di continuare. </li></ol> 7. Rendering 3D Surface di Engulfed Materiale <ol><li> Creare un nuovo canale per il materiale che è stato travolto dal fagociti. <ol><li> Mentre è selezionata la superficie dei fagociti, fare clic sulla scheda matita. </li><li> Fare clic su Maschera tutto. </li><li> Nella finestra di dialogo che appare, selezionare il canale corrispondente al materiale inghiottito (ad esempio, anterograda tracciamento degli ingressi presinaptici; la figura 5B). </li><li> Controllare canale duplicato prima di applicare la maschera e premere OK. </li><li> Un nuovo canale apparirà nella finestra di regolazione del display che contiene solo il materiale che è stato travolto ed è all&#39;interno delphagocyte. </li></ol></li><li> Rendere la superficie del canale che contiene materiale Engulfed e nonengulfed totale. <ol><li> Deselezionare tutti i canali nella finestra di regolazione del display, tranne per il canale da asfaltata e deselezionare la superficie creata per il phagocyte. </li><li> Fare clic sull&#39;icona di rendering di superficie di nuovo (vedi punto 6.3) e creare una superficie per il canale utilizzando gli stessi passi descritti per la fagociti (passaggi 6,4-6,11). Note: Assicurarsi di selezionare il canale corretto prima di rasare e soglia (punto 6.5, figura 4B). Prendere nota del valore di soglia (vedere il punto 6.6; Figura 4C). Questo valore può essere ottenuto anche dopo il rendering superficie è completa (scheda bacchetta; Figura 5A). </li></ol></li><li> Registrare il volume del materiale totale inghiottito e non travolto e salvare il file prima di continuare. </li><li> Render superficie del materiale fagocitato (materiale all&#39;interno del fagociti). <ol><li> Visualizza fluorescenza soloil nuovo canale di materiale travolto (vedi punto 7.2.1). </li><li> Seguire la stessa procedura come sopra (passi 7,2-7,3). Note: Assicurarsi di selezionare il canale corretto dal menu a discesa prima di rasare (scegliere il nuovo canale creato nel passaggio 7.1). Nella finestra di soglia, immettere manualmente il valore di soglia che è stato impostato per il rendering del materiale totale inghiottito e non travolto (vedi punto 7.2.2). </li></ol></li><li> Registrare il volume del materiale inghiottito e salvare il file prima di continuare. </li></ol> 8. Calcola il volume totale del campo visivo <ol><li> Creare una nuova superficie per ogni canale. </li><li> Nella finestra thresholding (passo 6.6), far scorrere l&#39;istogramma completamente verso sinistra in modo che l&#39;intero campo è emerso. </li><li> Termina emersione l&#39;intero campo e registrare il volume (passaggi 6,7-6,11). </li><li> Salvare il file. </li></ol> 9. Calcolare la quantità di materiale fagocitati <ol><li> Calcolare la densità deltotale canale materiale inghiottito e non inghiottito utilizzando il seguente algoritmo: Volume di Total Engulfed e non Engulfed Material (punto 7.3) / Volume del campo (punto 8). </li><li> Calcola% fagocitazione per cella utilizzando il seguente algoritmo: (Volume di Engulfed Material (punto 7.5) / Volume totale Fagocita (punto 6.11)) x 100 Note: per tenere conto di variazioni nelle dimensioni delle cellule, i dati vengono normalizzati per il volume totale della fagociti. Se i numeri di passo 9.1 sono molto variabili tra i campi, può essere necessario normalizzare i dati dal punto 9.2 al calcolo in 9.1. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;quad-partite&amp;#34;+synapse:+Microglia-synapse+interactions+in+the+developing+and+mature+CNS.">The &amp;#34;quad-partite&amp;#34; synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS.</a> Glia. 61 (1), 24-36 (2013).</li><li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-induced+trafficking+and+turnover+of+the+cis-Golgi+glycoprotein+GPP130.">Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130.</a> Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Knobloch, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+loss+and+synaptic+alterations+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease.</a> Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).</li><li>Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+synaptic+pathophysiology+in+neurodegeneration:+insights+from+Huntington's+disease.">Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease.</a> Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).</li><li>Noda, M., Suzumura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweepers+in+the+CNS:+Microglial+Migration+and+Phagocytosis+in+the+Alzheimer+Disease+Pathogenesis.">Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2012).</li><li>Rotshenker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophage+activation+and+the+regulation+of+complement-receptor-3+(CR3/MAC-1)-mediated+myelin+phagocytosis+in+injury+and+disease.">Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease.</a> J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).</li><li>Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+myelin+in+demyelinative+disease:+a+review.">Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review.</a> Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Al fine di misurare con precisione la fagocitosi, materiale inghiottito deve essere etichettato in modo tale che il ricercatore può visualizzare una volta è verificato degradazione lisosomiale. Inoltre, è necessaria imaging ad alta risoluzione, seguito dall&#39;uso di software che permetterà al ricercatore di visualizzare il volume dell&#39;intera cella e quantificare il contenuto. In questo protocollo, si descrive un metodo altamente affidabile e quantitativo per la misurazione fagocitazione phagocyte-mediata con C...

<html> Circuiti sinaptici rimodellare tutta la vita di un animale. Nel cervello in via di sviluppo, le sinapsi si formano in eccesso e devono subire la potatura sinaptica che comporta la rimozione selettiva di un sottoinsieme di sinapsi e la manutenzione e il potenziamento di quelle sinapsi che rimangono 8-10. Questo processo è necessario per conseguire la connettività precisa caratteristica del sistema nervoso adulto. Nell&#39;adulto, sinapsi possono anche essere di plastica, in particolare nel contesto di apprendimento e memoria. Le correlazioni strutturali di questa plasticità si pensa di includere l&#39;aggiunta e / o l&#39;eliminazione delle spine dendritiche e boutons presinaptici 11-13. Oltre a questi ruoli nel sistema nervoso sano, rimodellamento sinaptico è anche coinvolto nella nervoso 12,14,15 malattia del sistema / infortunio. Ad esempio, a seguito di lesioni del midollo spinale, gli assoni mozzate successivamente devono rimodellare e formare nuove sinapsi per raggiungere funzionale 16-19 recupero. nt &quot;&gt; Emergendo come un aspetto importante della plasticità sinaptica è il processo di fagocitosi o fagocitazione delle sinapsi destinati per la rimozione 3,5,20. Abbiamo recentemente dimostrato questo fenomeno nel contesto della potatura sinaptica nel sano, postnatale cervello di topo 7. particolare , microglia, i residenti del SNC cellule immunitarie e fagociti, sono stati mostrati per inghiottire ingressi presinaptici nel corso di un periodo di picco e in una regione di sviluppo di potatura sinaptica, la postnatale dorsale nucleo genicolato laterale (dLGN) del talamo. blocco genetica o farmacologica di questa fagocitazione portato a disavanzi sostenuti nella connettività sinaptica. In questo protocollo, si descrive un test affidabile e altamente quantitativo per misurare fagociti-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici. Ai fini del presente articolo, questo saggio sarà presentato nel contesto del sistema di sviluppo retinogeniculate, che comprende le cellule gangliari retiniche (RGC) residenti nella retina cheproiettare ingressi presinaptici al dLGN (Figura 1A). Per iniziare, un anterograda strategia etichettatura degradazione resistente lisosomiale sarà descritto, che viene utilizzato per visualizzare RGC-specifici ingressi presinaptici nel dLGN (Figura 1) 7,21. A seguito di questa descrizione, una metodologia dettagliata per l&#39;imaging e misurare quantitativamente fagocitazione usando la microscopia confocale in combinazione con 3 dimensioni (3D) della superficie volume rendering sarà dato. Questa metodologia si basa sulla preparazione del tessuto fisso, ma può anche essere adattato per l&#39;utilizzo in studi di imaging dal vivo. È importante sottolineare che, mentre il test è stato convalidato nel contesto del sistema retinogeniculate sano, postnatale, si potrebbe applicare le stesse tecniche per valutare altre interazioni fagociti neuroni in tutto il cervello e durante la malattia, così come la funzione dei fagociti in altri organi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="533">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Vet Equip, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">965500&#160;</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:144px;">Warm water source for heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:168px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:144px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:159px;">DSC Optical</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:144px;">Sliding microtome with freezing stage</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:168px;">SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:168px;">14021607100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td style="width:159px;">Nikon</td>
			<td style="width:168px;">SMZ800 with Epi-fluorescence attachment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Spinning disk confocal microscope</td>
			<td style="width:159px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:168px;">UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">10 &#181;l Hamilton gas tight syringes</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">80030</td>
			<td style="width:144px;">Use a different syringe for each color dye/tracer</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Hamilton needles</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">7803-05, specifications: blunt, 1.5&#34;</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="54" rowspan="3" style="height:54px;width:131px;">Alexa-conjugated cholera toxin &#946; subunit (CTB)</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">488: C22841</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;">Reconstitute in sterile saline, 80 &#181;l (488), 100 &#181;l (594), 20 &#181;l (647)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">594: C22842</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">647: C34778</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Phosphate Buffered Saline&#160;(PBS)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:131px;">Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment)</td>
			<td style="width:131px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:116px;">24208-780-55</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">30.5 gauge needle</td>
			<td style="width:131px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:116px;">305106</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5630</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:116px;">23-400-125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="104" rowspan="2" style="height:104px;width:131px;">Paraformaldeyde (PFA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">15710</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use&#160; in a fume hood and wear personal protective equipment.</td>
		</tr>
		<tr height="83">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="138" rowspan="4" style="height:138px;width:131px;">Dissection tools &#8211; scissors, forceps, spatula</td>
			<td style="width:131px;">Small scissors: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">Small scissors:14370-22</td>
			<td rowspan="4" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Large scissors: Roboz</td>
			<td style="width:116px;">Large scissors: RS-6820</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">#55 forceps: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">#55 forceps: 11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Spatula: Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:116px;">Spatula: 13504</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:131px;">Sucrose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S8501-5KG</td>
			<td style="width:144px;">Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">25608-930</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Weigh boat</td>
			<td style="width:131px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:116px;">2347-1426</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">24-well plates</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:116px;">353047</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S6566-500G</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20.&#160; To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:131px;">Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48393 194</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Charged microscope slide</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48311-703</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Vectasheild</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:116px;">H-1200</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons

La fagocitosi è un processo in cui una cellula avvolge materiale (intera cella, parti di una cellula, detriti, ecc) nel suo ambiente extracellulare circostante e successivamente digerisce questo materiale, comunemente mediante degradazione lisosomiale. Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) la cui funzione fagocitica è stata descritta in una vasta gamma di condizioni di malattia neurodegenerativa (es. pallone beta-amiloide nella malattia di Alzheimer) allo sviluppo del cervello sano (ad esempio, sinaptica potature) 1-6. Il protocollo che segue è un test fagocitazione sviluppato per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate topo in via di sviluppo 7. Mentre questo test è stato utilizzato per valutare la funzione microglia in questo particolare contesto, un approccio simile può essere utilizzato per valutare altri fagociti tutto il cervello (ad esempio, astrociti) e il resto del corpo(ad esempio, macrofagi periferici) nonché altri contesti in cui avviene il rimodellamento sinaptico (ad esempio, il trauma cranico / malattia).

Recentemente, abbiamo utilizzato questo test fagocitazione per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate in via di sviluppo (Figura 1) 7. RGC da CX3CR1-EGFP topi eterozigoti sono stati rintracciati anterogradely con CTB-594 e CTB-647 negli occhi sinistro e destro rispettivamente. A seguito di tale tracciato, microglia EGFP-positivi all&#39;interno del dLGN sono stati ripresi. Queste immagini sono state successivamente ...

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An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto.

Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

an-engulfment-assay-protocol-to-assess-interactions-between-cns

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.1K Views.  Boston Children's Hospital, Harvard Medical School.  Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto. 

Video: An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Ricerca

Neuroscienze

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Mappatura e applicazione di Enhancer-trappola Espressione Flippase in larvali e adulti Drosophila SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modello preclinico per valutare il recupero del cervello dopo l'ictus acuto nei ratti

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...