Ringraziamo un fondo interno presso la University of Oklahoma (a BZ) e una borsa di NSF (IOS-1025556, a BZ e RAB) per il sostegno della Fondazione, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, e questa ricerca. Una sovvenzione NIH (RO1 NS060878, a BZ) parzialmente supportato RAB. RAB riconosce un NRSA NIH (T32 NS07292) formazione sovvenzione concessa a Brandeis University, e una sovvenzione del NIH (RO1 GM21473) assegnato a Jeffrey Hall Brandeis, per supportare le prime fasi di questo studio. Ringraziamo Jeffrey Hall per il suo continuo incoraggiamento per questo progetto. Ringraziamo il dottor Kristin Scott per averci fornito la vasca P&gt; Gal80 ceppo&gt;.

1. Ceppi di Drosophila <ol><li> GAL4 driver: GMR-GAL4, che esprime GAL4 in cellule visive. </li><li> UAS linee SUP-MJD78Q (o UAS-polyQ), che causa la degenerazione neurale in GAL4 cellule che esprimono. UAS-GFP, che esprime GFP in GAL4 cellule che esprimono. </li><li> FLP linee Ey-FLP, che esprime FLP di fotorecettori e in sottogruppi di regioni del cervello. ET-FLPx2 linee, che sono enhancer-trap righe che contengono due copie della FLP (FLP-IRES-FLP). Abbiamo generato ~ 1.000 ET-FLP linee (Bohm et al., 2010), la cui espressione modelli devono ancora essere caratterizzati. Qui, descriviamo la caratterizzazione del pattern di espressione di selezionare ET-FLPx2 nel larvale e adulto volare sistema nervoso centrale (SNC). </li><li> FLP giornalista yw, actina P&gt; CD2&gt; GAL4; SUP-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), che riporta il pattern di espressione di ET-FLPx2 attraverso actina P&gt; GAL4; UAS-GFP su FLP-mediata escissione ricombinazione di&gt; CD2. </li><li> Due complementari Gal80 di conversione strumenti Vasca P&gt; Gal80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), il flip-out costruire, che esprime costitutivamente Gal80 in tutti i tessuti guidata da un promotore forte tubulina. Su FLP-mediata ricombinazione,&gt; Gal80 viene girato fuori e Gal80 espressione è risolto solo in ET-FLPx2 che esprimono tessuti. Vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 (Bohm et al., 2010), il flip-in costruzione, che non esprime Gal80 in condizioni normali. Gal80 espressione è attivato dal promotore tubulina solo in ET-FLPx2 che esprimono i tessuti in cui FLP ribalta fuori fermare&gt; e lanci in Gal80. </li><li> Vola per testare l&#39;attività FLP in un occhio composto GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 (Bohm et al, 2010.), Che è degenerata e gli occhi depigmentati. In FLP cellule che esprimono fotorecettori, espressione polyQ è spento dopo Gal80 flip-in. GMR-GAL4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) vasca P&gt; Gal80&gt;, che ha occhi normali. In FLP cellule che esprimono fotorecettori, espressione polyQ è attivato a seguito Gal80 flip-out. </li></ol> 2. Reagenti PBS (PBS, 1X), pH 7,4. 4% paraformaldeide (PFA), diluito in PBS dal 16% PFA, EM grado (Cat # 15710, Scienze Microscopia Elettronica, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS contenente 0,1% Triton X-100 (Sigma) Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Ibridoma Banca, Università di Iowa), macchie di tutti i neuroni in Drosophila. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Ibridoma Banca, Università di Iowa), macchie di cellule gliali in Drosophila. Alexa 594 pollo contro anticorpo secondario del mouse (Invitrogen) 3. Mappatura del pattern di espressione di enhancer-trap linee FLPx2 (* passaggi critici) <ol><li> Raccogliere le femmine vergini dal yw, actina P&gt; CD2&gt; GAL4; UAS GFP-line e croce per i maschi di singoli ET-FLPx2 linee. La prima serve come reporter GFP per l&#39;espressione del tessuto di ET-FLP. </li><li> * Dissect vagare 3 ° instar larve F1, mantenere il sistema nervoso centrale (cioè il cervello e il cordone nervoso ventrale, VNC) e la parete del corpo, fissare per 1 ora nel 4% PFA su ghiaccio, lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio seguito da lava 3X con PBT. Dissezione <ol><li> Rimuovere vagare 3 ° instar larve F1 e metterli in un piatto pulito Sylgard (35 mm x 10 mm piastra di Petri riempita con 2 grammi di Sylgard - misti secondo per la produzione di istruzioni). <ol><li> Rimuovere residui di cibo con pennello </li></ol></li><li> Riempire il piatto con gelida 1XPBS e posto sul ghiaccio per anestetizzare le larve </li><li> Tenere la bocca ganci di una larva con un paio di pinze e prendete la cuticola vicino lo spiraglio estensione anteriore con un altro paio di pinze e sbucciate le cuticole verso la fine posteriore. La CNS sarà allegata alla bocca ganci con le ghiandole salivari, intestino, e dischi immaginale. </li><li> Rimuovere il tessuto in eccesso e dischi immaginale che circondano il sistema nervoso centrale. </li><li> Trasferire il sistema nervoso centrale in un PBS pieno di ben 3 pirofila. <ol><li> Un siliconato P200 punta della pipetta può essere utilizzata per evitare l&#39;essiccamento dei tessuti. </li></ol></li><li> Fix per 1 ora in 200 ml di PFA 4% su ghiaccio. <ol><li> Assicurarsi che il sistema nervoso centrale è completamente immersa nel PFA. <ol><li> Se il sistema nervoso centrale galleggianti, questo suggerisce in genere che il CNS non è adeguatamente puliti dal tessuto circostante. </li></ol></li></ol></li><li> Lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio seguito da lavaggi 3X con PBT. </li></ol></li><li> * Dissect del sistema nervoso centrale di mosche F1 adulti. <ol><li> Anestetizzare le mosche con la CO 2 o posto le mosche contenute all&#39;interno di una fiala vuota in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Adulto luogo vola in un 95% EtOH pieno di piatto di vetro in ghiaccio per 30 sec. </li><li> Trasferire la mosche adulte in un piatto di vetro riempito 1XPBS sul ghiaccio. <ol><li> Lavare 3X con ghiacciata 1X PBS per rimuovere residui di EtOH </li></ol></li><li> Mettere una mosca in una Sylga 35 millimetri° piatto pieno di ghiaccio, freddo PBS 1X </li><li> Posizionare il lato ventrale rivolto verso l&#39;alto e inserire una penna piccolo insetto (pin minutiens 0,1 mm) a metà strada attraverso l&#39;addome. <ol><li> Usando un paio di pinze tenere la base delle gambe e rimuovere le gambe con un altro paio di pinze. </li></ol></li><li> Rimuovere la cuticola testa <ol><li> Mentre afferra la proboscide con un paio di pinze, un altro luogo sotto l&#39;occhio e la buccia la cuticola verso la linea mediana dorsale della testa volare. </li><li> Prendete l&#39;altro occhio e togliere la cuticola rimanente dall&#39;altra parte. </li><li> Uso di pinze taglienti e / o l&#39;ago di tungsteno affilato, rimuovere il tessuto tracheale che circonda il cervello <ol><li> Pulizia impropria della trachea si tradurrà in una forte auto-fluorescenza, ostruendo espressione GFP, e permettere al cervello di galleggiare durante fissaggio </li></ol></li></ol></li><li> VNC Dissection <ol><li> Rimuovere la cuticola toracica <ol><li> A partire dalla fine posteriore del torace, posto due pinze su ogni lato della preepisternum 3 ° (cioè, afferrando la base delle zampe posteriori). </li><li> Separare delicatamente la cuticola dalla linea mediana ventrale, ripetere questo fino a raggiungere la base del collo. </li><li> Allargare delicatamente le due metà della cuticola toracica esporre il VNC </li></ol></li><li> Avanti rimuovere l&#39;addome dal torace. Durante l&#39;utilizzo di una pinza per tenere il torace alla base seconda tappa, utilizzare un altro paio di pinze per afferrare l&#39;addome in prossimità del primo sternite addominale e tirare fuori l&#39;addome. </li><li> Per rimuovere il VNC dal tessuto circostante toracica. Tenere la zona omerale con un paio di pinze e con un altro paio di pinze dolce lacrima di distanza la maggior parte della carcassa toracica. </li><li> A questo punto ci dovrebbe essere un anello di tessuto connettivo che circonda il connettivo cervicale (collo). Utilizzando due pinze strappare l&#39;anello a parte. </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso toracica che circonda il VNC </li></ol></li><li> Trasferire il cervello e VNC per ben 9-pirofila contenente PBS 1X sul ghiaccio <ol><li> Un siliconato P200 punta della pipetta può essere utilizzata per evitare l&#39;essiccamento del tessuto </li></ol></li></ol></li><li> * Fissare il sistema nervoso centrale adulto per 1 ora nel 4% PFA su ghiaccio e lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio e 3 volte con PBT. </li><li> Incubare la preparazione adulti SNC o del sistema nervoso centrale larvale e la parete del corpo a 4 ° C per una notte con gli anticorpi di entrambi i neuroni (anti-Elav, 1:10) o glia (anti-Repo. 1:10). Lavare la preparazione 5X con PBT. </li><li> Incubare con una preparazione adulto o larvale con Alexa 594 pollo contro anticorpo secondario del mouse (1:100) a temperatura ambiente per 2 ore, e lavare la preparazione con PBS. </li><li> Montare il sistema nervoso centrale larvale o adulto in una diapositiva. Per conservare la forma naturale del sistema nervoso centrale, utilizzare un a forma di O anello di plastica (Label Rinforzo chiaro, Avery Dennison Office Products, Brea, CA) sulla diapositiva come un mini-ponte di sospendere la polizza di copertura. </li><li> Esaminare la preparazione di pattern di espressione GFP e Elav (o pronti contro termine) sotto un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 4. L&#39;applicazione di due complementari Gal80 di conversione strumenti di repressione GAL4 in fotorecettori <ol><li> Flipping Gal80 per il tramite di vasca P&gt; Gal80&gt; (Figura 5A). <ol><li> Raccogliere i maschi dalla GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca P&gt; Gal80 line&gt;. Si noti che gli occhi composti sono normali in queste mosche. </li><li> Accoppiarsi con Ey-FLP vergini. </li><li> Raccogliere le mosche F1 e esaminare il fenotipo occhi. </li></ol></li><li> Flipping Gal80 in via vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 (Figura 5B). <ol><li> Raccogliere GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 mosche maschio e esaminare il fenotipo occhi. Nota il degenerato e gli occhi depigmentati in queste mosche rispetto ai ceppi wild-type (Canton-S) </li><li> Accoppiarsi con Ey-FLP vergini; </li><li> Raccogliere le mosche F1 e esaminare il fenotipo occhi. </li></ol></li><li> Seleziona ET-FLPx2 linee con espressione nelle cellule dei fotorecettori </li></ol> Passi 4.1 e 4.2 può essere ripetuta con ET-FLPx2 linee che esprimono FLP in un sottogruppo di cellule visive. In alternativa, o il GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 mosche o la GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca P&gt; Gal80&gt; vola può essere attraversato a singoli ET-FLPx2 linee a schermo per le linee che esprimono FLP di cellule visive. Prezioso ET-FLPx2 linee sono quelle che solo FLP esprimere in un sottoinsieme o fotorecettori singola (Figura 6). 5. Rappresentante risultati Il pattern di espressione di uno specifico ET-FLPx2 linea può essere prontamente esaminati e documentati nelle larve F1 o adulto vola derivato dalla croce tra yw, actina P&gt; CD2&gt; GAL4; UAS-GFP vergini e ET-FLPx2 maschi (Figura 1) . Tipicamente, 04:57 replica degli animali sezionati e F1 sono esaminati per determinare la riproducibilità del pattern di espressione FLP (Bohm et al., 2010). <strong&gt; La figura 2 mostra il pattern di espressione di FLP di ET-173A FLPx2 linea nel SNC larvale e adulto. Il modello FLP può essere ulteriormente analizzati utilizzando un marker neuronale o gliale (Figura 3 e 4). I risultati mostrati nella Figura 7 illustrare l&#39;efficacia del Gal80 flip-in e flip-out dei sistemi di repressione intersezionale di GAL4 seguenti FLP-mediata ricombinazione. La vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 costruire non sembra avere alcuna espressione che perde di Gal80 (in base alla degenerazione uniforme e depigmentazione dei fotorecettori), e tuttavia è efficace al 100% in flipping Gal80 con l&#39;aiuto di eyFLP per reprimere GMR- GAL4 e ripristinare l&#39;occhio alle apparenze normali (Fig. 7A). Al contrario, vasca P&gt; Gal80&gt; completamente reprime GMR-GAL4 prima dell&#39;introduzione di eyFLP. A seguito di Gal80 flip-out, GMR-GAL4 unità UAS-polyQ espressione, portando a degenerare e gli occhi depigmentati (Fig. 7B). In questo esempio abbiamo usato un pan-photorecetor FLP per mappare &#39;circuiti&#39; il fotorecettore, ma non esaminare le conseguenze comportamentali. Utilizzando approcci simili con comportamentale rilevante GAL4 linee, abbiamo mappato parte del CCAP-GAL4 circuito che regolano l&#39;espansione alare nei moscerini adulti (Bohm et al., 2010). Crediamo che il metodo FINGR saranno utili per aiutare la nostra comprensione delle basi neuronali del comportamento. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. . Esaminato il pattern di espressione di una linea-FLPx2 ET Il modello di espressione FLP (ovali blu) da un ET-FLPx2 linea può essere determinata attraversando un ET-FLPx2 maschio (in alto a sinistra) con un actina P&gt; CD2&gt; GAL4; UAS- GFP vergine (in alto a destra). Ubiquitous Actina P&gt; GAL4 espressione nella femmina genitori è ostacolato da l&#39;inserimento del (triangoli grigi) sequenza FRT affiancato CD2. Nella progenie F1, FLP sarà accise la sequenza CD2, permettendo actina P&gt; GAL4 di guidare UAS-GFP espressione. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Pattern di espressione di un ET-FLPx2 linea nel larvale e adulto sistema nervoso centrale. Queste immagini ritraggono il sistema nervoso centrale (cervello e dei nervi del midollo ventrale, VNC) sezionato dalla prole prodotta da accoppiamento yw, actina P&gt; CD2&gt; GAL4; UAS-GFP genitori di ET-173A FLPx2 linea. Ricombinando il&gt; CD2 cassetta&gt;, FLP attiva actina P&gt; GAL4 espressione (l&#39;espressione conseguente della SUP-GFP). Quindi, il modello GFP rapporti FLP cellule che esprimono. Un pannello mostra il pattern di espressione larvale FLP che, pannello B mostra il modello di adulto espressione in linea 173A. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Caratterizzazione di tipi di cellule che esprimono flippase a ET-FLPx2 Linea # 688A. A, A immagine composita di una larva fisso F1 3 ° instar colorati con anti-REPO da un incrocio tra ET-FLPx2 linea # 688A e un reporting GFP Flippase linea. BD, un alto ingrandimento (Plan-Apochromat Zeiss 63x olio) tesi a partire dalla fine posteriore di un VNC da una larve di 3 ° stadio. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Caratterizzazione di tipi di cellule all&#39;interno del corpo fungo di ET-FLPx2 Linea # 150. AC, A ad alto ingrandimento dell&#39;immagine (63x immersione olio) del corpo dei funghi da un fisso larva F1 3 instar colorati con anti-REPO. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Illustrazione di Gal80 Strategie Flip-in e flip-out. R. Nel flip-out strategia, tubulina promotore-driven Gal80 (Vasca P&gt; Gal80&gt;) è costitutivamente attivo, con la conseguente repressione di GMR-GAL4 e una wild-type fenotipo occhi (occhi rossi). Questa repressione è stato rimosso con l&#39;introduzione di FLP (viola), che si capovolgerà Gal80 fuori (al centro, rosso) e permettere GMR-GAL4 a guidare UAS-polyQ espressione. Ciò si traduce in degenerazione cellulare dei fotorecettori (illustrato da puntini bianchi negli occhi). B. Nel reciproco del precedente strategia, tubulina promotore-driven Gal80 espressione è interrotto da FRT (grigio triangolo) affiancato codone di &quot;stop&quot;. In assenza di Gal80, GMR-GAL4 lega alla UAS-polyQ che causano la degenerazione neuronale in fotorecettori (illustrato da puntini bianchi negli occhi). Attraversando il GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca P&gt; fermare&gt; GAL80 maschi con femmine vergini che esprimono FLP nelle cellule dei fotorecettori, FLP (viola) catalizzerà ricombinazione nei siti FRT, ablazione del codone &quot;stop&quot; (al centro, rosso), consentendo così Gal80 espressione e la repressione di GMR-GAL4. Questa riserva il neurodegenerazione nelle cellule dei fotorecettori (illustrato dalla mancanza di wpunti Hite negli occhi). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. L&#39;applicazione del metodo FINGR in flipping Gal80 con l&#39;ausilio di ET-FLPx2 Linea # 688A progenie F1 da un incrocio tra ET-FLPx2 linea # 688A vergine di GMR-GAL4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 maschile. La mancanza di pigmento al centro della ommatidi dell&#39;occhio rappresenta l&#39;espressione FLP in linea # 688A. In questa zona Gal80 soppressione della GMR-GAL4 è stato sollevato permettendo al GAL4 di guidare UAS-polyQ. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. L&#39;applicazione del metodo FINGR in flipping Gal80 dentro o fuori da intersecare GAL4 in fotorecettori. A. La vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 flip-nel sistema limita GAL4 espressione in una FLP-dipendente. In GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca P&gt; fermare&gt; GAL80 le mosche, le cellule sono fotorecettori degenerano e depigmentati (mosca a sinistra). Dopo l&#39;introduzione di eyFLP, Gal80 è espressa nelle cellule dei fotorecettori, con conseguente repressione pieno di GMR-GAL4, che a sua volta si spegne il polyQ espressione e produce le mosche con occhi normali (volare a destra). B. La vasca P&gt; Gal80&gt; capovolgere Partenza sistema funziona in modo opposto, come la vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 flip-nel sistema. Vasca P&gt; Gal80&gt; costitutivamente GAL4 reprime e sopprime l&#39;espressione di polyQ (a sinistra volare, con occhi normali). Dopo l&#39;introduzione di eyFLP, Gal80 è lanciato verso l&#39;esterno a partire da cellule dei fotorecettori, alleviando la soppressione della GMR-GAL4 e accendere il polyQ espressione. Questo porta a degenerare e mosche con occhi depigmentati (volare a destra).

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	<li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila.">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila.">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li><li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4.">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema Gal4/UAS è stata ampiamente e usato con successo da Drosophilists per vari studi biologici (Brand &amp; Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Ad oggi, la comunità mosca ha generato migliaia di promotore-driven e enhancer-trap GAL4 linee. Un punto di forza del metodo FINGR è che è compatibile con il sistema Gal4/UAS, che consente di ampliare significativamente il potere di GAL4 negli studi di Drosophila. Una importante applicazione del metodo FINGR è quello di ottimizzare i circuiti neurali alla base del comportamento attraverso Gal4/Gal80 incrocio. Questi comportamenti possono includere, ma non sono limitati a, apprendimento e memoria, corteggiamento, il sonno, e il ritmo circadiano. Il metodo FINGR può anche essere utilizzato per mappare i neuroni critiche che tendono a neurodegenerazione nella modellazione umana malattie neurodegenerative come l&#39;Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e di Parkinson. Allo stesso modo, foci di neuroni o circuiti neurali che mediano cruciale per la cocaina, l&#39;alcol e dipendenza da altre sostanze possono essere mappati con il metodo FINGR. Va notato che Gal4s condizionale (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) potrebbero essere utilizzati con il metodo FINGR al fine di ottenere il controllo temporale dei circuiti neurali e comportamenti. Modifica del Gal80 strumenti di conversione tramite un sensibile alla temperatura Gal80 (Gal80 ts, McGuire et al., 2003) in grado di produrre vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 ts o vasca P&gt; Gal80 ts&gt;, aggiungendo un&#39;ulteriore flessibilità temporale nella manipolazione circuito. Al di là del sistema nervoso, il metodo FINGR è ugualmente applicabile a limitare GAL4 espressione in sottoinsiemi di cellule se è l&#39;ala o la gamba. L&#39;ET-FLPx2 linee saranno una risorsa preziosa per tutti i biologi Drosophila interessati FRT / FLP a base di analisi clonale (Xu &amp; Rubin, 1993), tra cui MARCM (Lee &amp; Luo, 1999). Si prevede inoltre che alcuni-FLPx2 ET linee può sostituire heatshock-FLP per la produzione di cloni riproducibile e per ripetute analisi morfologiche e comportamentali. Come enhancer-trap GAL4 linee, la maggior parte ET-FLPx2 linee è improbabile che siano espresse specificamente nelle cellule del proprio interesse. La maggior parte delle linee esprimerà FLP nelle cellule di interesse e in altre cellule o tessuti pure. Tuttavia, la mancanza di &#39;specificità del tessuto&#39; di entrambi i GAL4 e ET-FLPx2 non sarà una grande preoccupazione per il metodo FINGR finché la loro regione di sovrapposizione è auspicabile per un particolare esperimento. FINGR è progettato per girare due &#39;grandi&#39; sistemi in un raffinato. I metodi illustrati in questi protocolli sono piuttosto standard e dovrebbe essere riproducibile. I passi principali cautelativa, che richiedono l&#39;attenzione sono la scelta e l&#39;utilizzo del fissativo. Fissativi diversi PFA dovrebbero essere evitati in quanto spegnerà il segnale GFP. Abbiamo anche notato che il piatto dissezione non deve essere utilizzato per il fissaggio in PFA per evitare la possibilità che l&#39;espressione FLP non sarà affidabile riportato da GFP.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

Il GAL4 / SUP metodo binario è potente per la manipolazione dei geni e circuiti neurali in Drosophila. Per la maggior parte degli studi neurobiologici, tuttavia, è raramente GAL4 espressione tessuto-specifica da consentire di correlazione precisa del circuito con letture comportamentali. Per superare questo grande ostacolo, abbiamo recentemente sviluppato il metodo FINGR per ottenere una più restrittiva GAL4 espressione nel tessuto di interesse. Il metodo FINGR ha tre componenti: 1) il sistema tradizionale Gal4/UAS, 2) una serie di FLP / FRT-mediata Gal80 strumenti di conversione e 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). GAL4 viene utilizzato per definire i circuiti neurali primarie di interesse. Confrontando i GAL4 con un UAS-effector, come UAS-MJD78Q o UAS-Shi ts, regola l&#39;attività neuronale, che a sua volta si manifesta con alterazioni del comportamento volare. Con un ulteriore UAS-reporter come UAS-GFP, il circuito neurale coinvolta nel comportamento specifico può essere contemporaneamente mappati per l&#39;analisi morfologica. Per GAL4 linee con espressione ampia, GAL4 espressione può essere limitato utilizzando due complementari Gal80 strumenti di conversione: vasca P&gt; Gal80&gt; (&#39;flip out&#39;) e vasca P&gt; fermare&gt; Gal80 (&#39;flip&#39;). Infine, gli investigatori Gal80 possibile attivare o disattivare, rispettivamente, con l&#39;aiuto di tessuto-specifici ET-FLP. Nel flip-in modalità, Gal80 sarà reprimere GAL4 espressione ovunque GAL4 e ET-FLP si intersecano. Nel flip-out modalità Gal80 allevia GAL4 repressione nelle cellule in cui si sovrappongono GAL4 e FLP. Entrambi gli approcci consentono la limitazione del numero di cellule nel GAL4 definiti circuiti, ma in un modello inverso. Il metodo FINGR è compatibile con la vasta collezione di GAL4 linee nella comunità mosca e altamente versatile per le tradizionali analisi clonale e per la mappatura dei circuiti neurali. In questo protocollo, dimostriamo la mappatura dei pattern di espressione FLP di selezionare ET-FLPx2 linee e l&#39;efficacia del metodo FINGR in cellule visive. Il principio del metodo FINGR dovrebbe essere applicabile anche ad altri organismi modello genetico in cui vengono utilizzate Gal4/UAS, Gal80, e FLP / FRT.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Descriviamo un Flippase indotta intersezionale Gal80/Gal4 repressione (FINGR) metodo, che consente tessuto-specifici FLP per determinare Gal80 pattern di espressione. Ovunque GAL4 e si sovrappongono FLP, GAL4 espressione è attivata (Gal80 lanciato verso l&#39;esterno) o disattivare (Gal80 capovolte). Il metodo FINGR è versatile per l&#39;analisi clonale e la mappatura del circuito neurale.

Mappatura e applicazione di Enhancer-trappola Espressione Flippase in larvali e adulti Drosophila SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

mapping-application-enhancer-trap-flippase-expression-larval-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K Views.  University of Oklahoma - Norman. Descriviamo un Flippase indotta intersezionale Gal80/Gal4 repressione (FINGR) metodo, che consente tessuto-specifici FLP per determinare Gal80 pattern di espressione. Ovunque GAL4 e si sovrappongono FLP, GAL4 espressione è attivata (Gal80 lanciato verso l'esterno) o disattivare (Gal80 capovolte). Il metodo FINGR è versatile per l'analisi clonale e la mappatura del circuito neurale.

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

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Neuroscienze

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imaging funzionale di Auditory Cortex in gatti adulti utilizzando ad alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Acquisizione di alta qualità video digitale di<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamenti larvali e adulti da una prospettiva laterale

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larvale Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...