Questo studio utilizza un modello animale consolidato per ricercare il recupero e le fasi sequele dell'ischemia cerebrale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è stabile, affidabile e relativamente semplice. Inizia posizionando un topo anestetizzato su un tavolo di fissaggio chirurgico.
Durante l'intervento chirurgico, mantenere la temperatura corporea del topo a 37 gradi Celsius in un piccolo termostato animale. Collegare la bocca alla maschera della macchina per anestesia e confermare l'anestesia profonda per mancanza di tensione alle estremità, riflessi corneali e dolore. Fissare gli arti del topo al tavolo operatorio usando bende di carta.
Con un rasoio elettrico, rimuovere il collo e sterilizzare il collo con il 75% di alcol. Utilizzare forbici oftalmiche per tagliare da due a tre centimetri lungo la forma longitudinale centrale del collo. E poi con le forcep oftalmiche, separare il muscolo sottocutaneo.
Usa il riavvolgitore fatto in casa per esporre completamente il campo visivo. Occorre fare attenzione a presentare un'adeguata tecnica aseptica per tutte le procedure chirurgiche di sopravvivenza. La tecnica illustrata più avanti nel video dovrebbe essere praticata attraverso l'intera procedura.
Utilizzare i micro forcep per isolare l'arteria carotide comune, l'arteria carotide esterna e l'arteria carotide interna. Lavorando al microscopio, utilizzare 8-0 suture per legare la comune arteria carotide con nodo duro, arteria carotide esterna lontano dall'estremità del cuore con nodo duro, arteria carotide interna con nodo sciolto e poi per allineare l'arteria carotide esterna vicino all'estremità del cuore. Utilizzando micro forbici, tagliare una piccola apertura nell'arteria carotide esterna e inserire delicatamente un bullone del filo.
Legare la sutura dell'arteria carotide esterna che è nodo sottile e sciolto e tagliare l'arteria carotide esterna. Allentare il nodo sciolto dell'arteria carotide interna e continuare a inserire il bullone del filo all'inizio dell'arteria cerebrale centrale contrassegnata con la sutura e tagliare il bullone del filo esposto. Dopo aver raggiunto il tempo ischemico dopo due o tre ore, fissare la frattura dell'arteria carotide esterna utilizzando micro forcep ed estrarre delicatamente il bullone del filo con altri micro forcep.
Dopo aver completamente ritirato l'estremità anteriore del bullone del filo dall'arteria carotide interna, ligate l'arteria carotide esterna che è stata rivestita con 8-0 sutura e quindi rimuovere completamente il bullone del filo. Dopo aver allentato la comune arteria carotide, tamponare circa 50.000 unità di polvere di sodio penicillina sulla superficie della ferita per prevenire l'infezione. Usa quattro suture per suturare muscoli e pelle sottocutanei.
Dopo aver riposizionare il topo nella gabbia, utilizzare una siringa millilitro per dare circa 0,2 millilitri di acqua al ratto per via orale per prevenire la disidratazione postoperatoria. Scegli gli animali in base al punteggio più lungo per la colorazione TTC o gli studi motori sensoriali. Dopo aver incubato il cervello isolato per la colorazione TTC a meno 20 gradi Celsius di 30 minuti, posizionarlo in uno stampo a fette cerebrali del topo pre-raffreddato.
Usando una lama pre-raffreddata, tagliare il cervello in sei sezioni consecutive spesse due millimetri. Macchiare le sezioni con 2%TTC in una piastra di coltura a sei pozzi e incubare per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius mentre si trema. Ogni 10 minuti, capovolgere le sezioni fino a quando l'ischemia cerebrale e le aree non colpite sono visibilmente bianche e rosse.
Allineare le fette cerebrali verticalmente sul cartone nero in ordine dal retro alla parte anteriore del cervello usando un righello per assicurarsi che la lunghezza totale di ogni linea sia la stessa e scattare foto. Importa la foto e seleziona le fette cerebrali. Selezionare il primo piano nero e digitare Alt Elimina per riempire il colore di sfondo e quindi Ctrl D da deselezionare.
Infine, salva l'immagine sul desktop. Per analizzare il volume infarto, aprire prima il software e importare la foto. Per evitare modifiche, regolare la luminosità con lo strumento di miglioramento del contrasto in modo che lo sfondo sia nero.
Nel filtro, utilizzare lo strumento mediana per rimuovere le evidenziazioni. Per calcolare l'area cerebrale normale sinistra, selezionare il colore utilizzando la segmentazione e regolare il valore di H, S e I per separare le fette cerebrali dallo sfondo nero. Tornare alla dimensione del conteggio e fare clic sul conteggio.
Clicca su oggetti divisi in modifica per separare il cervello dalla linea mediana che distinguerà automaticamente le aree cerebrali sinistra e destra. Per calcolare l'area cerebrale infaritta destra, importare l'immagine, regolare lo sfondo e rimuovere le evidenziazioni come fatto in precedenza. Selezionare le dimensioni del conteggio e fare clic sullo strumento Disegna oggetti unione in modifica.
Selezionare manualmente l'area ischemica e fare clic sul conteggio per calcolare l'area ischemica. Per calcolare l'area cerebrale sana giusta, importare prima l'immagine, regolare lo sfondo e rimuovere le evidenziazioni come fatto in precedenza. Selezionare il colore utilizzando la segmentazione e regolare il valore di H, S e I per separare le fette cerebrali sane dallo sfondo nero.
Tornare alla dimensione del conteggio e fare clic sul conteggio per calcolare quest'area. Clicca su oggetti divisi in modifica per separare il cervello dalla linea mediana che distinguerà automaticamente le aree cerebrali sinistra e destra. Prendere ratti scelti per studi motori sensoriali e per test bilaterali di assimetria e nastro di carta avvolgente sulla parte safenosa di ogni artiglio tre volte utilizzando la stessa pressione.
Per ogni topo, registrare con la fotocamera il numero di volte in cui ogni artiglio anteriore contatta e rimuove il nastro entro cinque minuti, inclusi i tempi delle zampe non influenzati e interessati. Ripetere il wrapping e la registrazione dopo 30 minuti e quindi calcolare i valori. Per il test di camminata a griglia, posizionare il ratto al centro di una piattaforma di superficie della griglia elevata con aperture di 2,5 centimetri quadrati.
Spingere leggermente i fianchi del topo per incoraggiarlo a muoversi attraverso la superficie. Utilizzando la fotocamera, registrare il numero di guasti al piede effettuati dagli arti destro non influenzato e sinistro interessato e il numero totale del passo in un minuto con la fotocamera. Per la prova dell'asta del rotore, impostare l'apparato di fatica a barra rotante del ratto a una velocità di 13 RPM per un periodo di cinque minuti utilizzando il software di supporto.
Avviare il programma per computer e posizionare il topo sugli anelli dell'asta del rotore contemporaneamente. Terminare la prova se il topo cade dall'anello o dopo cinque minuti e registrare il tempo di rotazione. Lasciare riposare il ratto per 30 minuti, quindi ripetere il test altre due volte e scegliere il valore massimo come ultimo tempo di rotazione.
Per la prova della fune di sollevamento, posizionare lo strumento della corda di sollevamento su una scrivania. Fai afferrare la corda al topo con gli arti anteriori e lasciala appendere. Registrare l'ora di sospensione e calcolare i punteggi.
Quando è stata studiata una lesione ischemica cerebrale indotta dall'occlusione dell'arteria cerebrale media e dalla riperfusione, il bullone del filo da 300 grammi di peso 3040 e il tempo di infarto cerebrale di tre ore si sono rivelati i più adatti con il più grande infarto cerebrale, il punteggio più alto più lungo e il più grande rapporto di successo del modello. Questo è stato significativamente migliorato rispetto al trattamento convenzionale di peso di 275 grammi, bullone del filo 2636 e tempo di infarto cerebrale di due ore. Per studiare lo stato di recupero dell'ischemia cerebrale, è stata eseguita la colorazione TTC e ha rivelato il volume infarto e restringimento al 23,4% il primo giorno dopo l'occlusione e la riperfusione dell'arteria cerebrale media, il 19,6% il 35 ° giorno, il 16,1% il 60 ° e il 15,7% il 90 ° .
Dopo un giorno di occlusione e riperfusione dell'arteria cerebrale media, la distorsione sensoriale del motore nel test bilaterale di assimetria, i tempi di errore di camminata della griglia nella prova di camminata della griglia e il punteggio della corda di sollevamento nella prova della corda di sollevamento sono tutti aumentati mentre il tempo dell'asta del rotore nella prova dell'asta del rotore è diminuito indicando l'importanza di questi test nello studio dell'ischemia cerebrale acuta. Solo la distorsione motoria sensoriale ha mantenuto grandi disturbi funzionali con un modo dipendente dal tempo dopo 35, 60 e 90 giorni di occlusione e riperfusione dell'arteria cerebrale media. Per il test di camminata in griglia, ci sono state differenze significative dei tempi di errore di camminata della griglia per 35 e 60 giorni.
Questi risultati hanno indicato che queste due prove potrebbero essere idonee a testare il recupero nei ratti. Al fine di garantire il successo, l'azione dovrebbe essere delicata e l'operazione dovrebbe essere costante. Altri test comportamentali come il rilevamento dell'andatura possono essere adatti anche per questo modello.
Lo sviluppo di questo modello potrebbe spianare la strada ai ricercatori per esplorare l'ischemia cerebrale nelle fasi di recupero e sequele.
