Gli autori desiderano ringraziare la signora Meike Schaffrinski per lei sempre eccellente assistenza tecnica durante gli ultimi anni. Questo lavoro è stato finanziato attraverso il Consiglio tedesco per la ricerca (DFG) all&#39;interno del gruppo di ricerca congiunto 942 (FOR942) e dal Programma di Ricerca della Facoltà di Medicina, Georg-August-Universität Göttingen.

1 Preparazione del Sterile umano AB Serum <ol><li> Raccogliere 4-5 sacchetti di plasma fresco congelato (FFP). Conservare borse a -20 ° C fino a quando sono stati raccolti abbastanza borse. </li><li> Scongelare borse e incubare per 30 minuti a 56 ° C in un bagno d&#39;acqua per inattivare il complemento e rimuovere fibrina. </li><li> Disinfettare accuratamente l&#39;esterno dei sacchi e trasferire il plasma a provette da 50 ml. </li><li> Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti a temperatura ambiente per sbarazzarsi di precipitati e piastrine residue. </li><li> Piscina tutto surnatanti e scartare il pellet. </li><li> Campioni di siero aliquota in provette da 15 ml e conservare a -20 ° C. NOTA: In alternativa, normale siero umano AB inattivato al calore disponibile in commercio può essere utilizzato. </li></ol> 2 Isolamento dei monociti Per facilitare il bilanciamento della centrifuga, si raccomanda di elaborare due buffy coats in parallelo. Tuttavia, prendere cari di utilizzare materiali diversi per ogni donatore e non mescolare le cellule. In caso buffy coats non possono essere ottenuti facilmente, 400 ml di sangue periferico in eparina possono essere utilizzati al posto. <ol><li> Disinfettare accuratamente i sacchetti di plastica contenenti le buffy coats e trasferire il contenuto di ogni buffy coat a due tubi da 50 ml. </li><li> Per ogni buffy coat riempire tre provette da 50 ml con 15 ml di soluzione Ficoll (1.077 g / ml). Il Ficoll deve essere a temperatura ambiente per la preparazione. </li><li> Strato 30-35 ml di sangue buffy coat sul top della soluzione Ficoll per primo gradiente di densità. Fare attenzione a farlo lentamente e con attenzione al fine di evitare la miscelazione entrambi gli strati. </li><li> Centrifugare a 400 xg senza freno per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Per ogni sfumatura raccogliere l&#39;anello bianco di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) che si trova tra le due fasi con una pipetta Pasteur di plastica e trasferimento in un tubo da 50 ml. </li><li> Riempire ogni tubo con PBS-EDTA (1 mM) fino a 40 ml in totale. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 10 min senza freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare di nuovo pellet con 40 ml di PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Per ciascun pool di donatori i pellet in 20 ml di RPMI-1640 senza rosso fenolo + 10% FCS. </li><li> Preparare la soluzione di Percoll iso-osmotica per il secondo gradiente di densità: Per due donatori mescolano 23,13 ml di soluzione di Percoll (densità 1,131 g / ml) in una provetta da 50 ml con 1,87 ml di 10 volte PBS. Poi trasferire 23 ml di questa soluzione in un tubo da 50 ml e aggiungere 27 ml di RPMI-1640 con rosso fenolo + 10% FCS per ottenere una soluzione 46% iso-osmotica Percoll. Il Percoll deve essere a temperatura ambiente per la preparazione. </li><li> Per ogni trasferimento donatore 25 ml della soluzione preparata Percoll in una provetta da 50 ml e sovrapporre la soluzione preparata in PBMC 2.9) sulla parte superiore della soluzione Percoll. Fare attenzione a fare questo molto lentamente und attentamente, entrambi gli strati tendono a mescolare facilmente. Se fatto correttamente le due fasi possono essere distinte a causa della loro differenza di colore. </li><li> Centrifugare a 550 xg senza freno per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Per ogni sfumatura raccogliere l&#39;anello bianco di monociti che si trova tra le due fasi con una pipetta Pasteur di plastica e trasferimento in un tubo da 50 ml. </li><li> Riempire ogni tubo con PBS-EDTA (1 mM) fino a 50 ml in totale. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 10 min senza freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 20 ml di RPMI-1640 con rosso fenolo + 10% FCS. </li></ol> 3. differenziazione dei monociti a macrofagi <ol><li> Determinare il numero di monociti isolati in una diluizione 1:10 in blu trypan. Contare solo i grandi, cellule a forma irregolare, spesso, che sono monociti. Non contare le cellule più piccole, di forma rotonda, che sono i linfociti. NOTA: numeri monociti non devono essere determinate con precisione anche perché solo dare un suggerimento a quanti e quali FEP rivestiti in teflon borse (piccole o grandi) devono essere utilizzati per la differenziazione delle cellule. </li><li> Per 1,0-1,5 x 10 8 monociti provenienti da un donatore, seminare le cellule in un sacchetto di coltura cellulare grande FEP rivestito di Teflon. Per ogni borsa preparare il terreno di coltura costituito da 174 ml di RPMI-1640, siero umano AB 2% (come preparato al punto 1), 1% di penicillina / streptomicina, e 2,5 ng / ml M-CSF (volume totale: 180 ml). <ol><li> Per 3,0-5,0 x 10 7 monociti provenienti da un donatore, seminare le cellule in un piccolo sacchetto di coltura cellulare rivestita in teflon. Per ogni borsa preparare il terreno di coltura costituito da 28,5 ml RPMI-1640, siero umano AB 2% (come preparato al punto 1), 1% di penicillina / streptomicina, e 2,5 ng / ml M-CSF (volume totale: 30 ml). NOTA: Se per esempio, 8,0 x 10 7 monociti sono ottenuti, si consiglia di loro seme in two borse di volume più piccoli con 4,0 x 10 7 cellule ciascuno. Invece di M-CSF, monociti possono in alternativa essere differenziati con granulociti e macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) alla stessa concentrazione (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Aggiungere la sospensione cellulare (20 ml) al mezzo preparato e miscelare accuratamente. Se due borse sono preparati da un donatore, aggiungere 20 ml di RPMI-1640 alla sospensione cellulare e poi aggiungere metà della sospensione di ciascun preparato medie. </li><li> Opzionale: Per determinare se la preparazione dei monociti è rimasta sterile, strappare una goccia di sospensione cellulare su una piastra di agar sangue ed incubare per tutta la notte a 37 ° C. </li><li> Serrare il fodero di un 50 ml perfusione sul tappo della borsa coltura cellulare FEP rivestito di teflon e riempirlo con la sospensione cellulare preparata. </li><li> Scollegare la siringa e spingere l&#39;aria residua dal sacchetto. Chiudere il sacchetto con un cono di chiusura. </li><li> Incubare le borse per 6-7 giorni a 3776, C con il 5% di CO 2. </li></ol> 4. Macrofagi Harvest <ol><li> Mettere i sacchetti di coltura cellulare FEP rivestiti in teflon con i macrofagi differenziati in ghiaccio per almeno 1 ora per facilitare il distacco delle cellule (un&#39;incubazione fino a 3 ore è possibile). Assicurarsi che tutta la superficie del sacchetto è ricoperto di ghiaccio. </li><li> Estrarre il sacchetto con una minima pressione 10x sopra il bordo di una scrivania / bordo. </li><li> Disinfettare accuratamente la parte esterna del sacchetto e rimuovere il cono di chiusura. </li><li> Serrare una siringa da 50 ml sul tappo della borsa, rimuovere la sospensione cellulare, e trasferirla a 50 mL. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 10 min a temperatura ambiente per centrifugare le cellule. </li><li> Aspirare il surnatante e piscina il pellet da un sacchetto in 10 ml di RPMI-1640 + 10% FCS in totale. </li><li> Determinare il numero di cellule in un emocitometro (1: 4-1: 10 diluizione in blu trypan). Contare Solo le cellule rotonde grandi. NOTA: Dopo differenziare i macrofagi nei sacchi FEP rivestiti in teflon, ci possono essere cellule residue ad esempio, linfociti, a seconda del donatore e la qualità dell&#39;isolamento monociti. </li><li> Per riutilizzare i sacchetti FEP rivestiti in teflon, lavarli due volte con etanolo al 70% per rimuovere le cellule residue. Riempire con 50 ml di etanolo al 70% e incubare una notte. Lavare le borse 3x con PBS sterile, li avvolgono in carta sterilizzazione, e sterilizzare in autoclave utilizzando procedure standard. NOTA: Le borse di coltura cellulare possono essere riutilizzati più volte senza alcuna perdita dei rendimenti macrofagi. Tuttavia, abbiamo deciso di eliminare le borse dopo 10 utilizzi prima di iniziare a perdere. </li><li> Per le successive macrofagi cultura esperimenti in RPMI-1640 + 10% FCS. Se sono necessarie concentrazioni sieriche inferiori, coltura in RPMI-1640 con 1% FCS è anche possibile. Seed e le cellule incubare per 3-4 ore. Dopo questo periodo, si noti che i macrofagi attaccano alla superficie della coltura cellulare piatto mentreeventuali cellule contaminanti (cioè eritrociti, linfociti e cellule dendritiche) rimangono in sospensione. Lavare le cellule almeno due volte con PBS per rimuovere le cellule non aderenti. </li><li> Per staccare macrofagi in coltura dal piatto di coltura cellulare per ulteriori esperimenti, li raschiare accuratamente dalla superficie. In alternativa, incubare piatti per 20 min in ghiaccio, aspirare il terreno di coltura, e aggiungere 1 ml di tampone di dissociazione cella-enzima. Dopo 5 minuti di incubazione a 37 ° C, aggiungere 4 ml di PBS, e staccare le cellule pipettando su e giù per almeno 3 minuti. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare in quanto non esiste alcun conflitto di interessi.

I macrofagi sono importanti cellule effettrici del sistema immunitario innato e visualizzare funzioni importanti nel immunomodulazione, presentazione dell&#39;antigene e l&#39;omeostasi tissutale. Grazie alla loro notevole plasticità, sono in grado di rispondere a stimoli diversi con variazioni del loro fenotipo. Tuttavia, finora molti dati riguardanti macrofagi polarizzazione si ottengono nel sistema murino, anche se ci sono rapporti che mostrano che solo circa il 50% dei marcatori di polarizzazione dei macrofagi può essere tradotto direttamente dal mouse umana 16. Pertanto, presentiamo qui un metodo per ottenere macrofagi umani primari in numero e purezza sufficiente senza la necessità di materiali costosi, ad esempio, MACS biglie magnetiche o un dispositivo elutriazione centrifuga controcorrente. Sacchi di coltura cellulare nostro metodo si basa sul l&#39;isolamento di monociti da PBMC e la loro successiva differenziazione di macrofagi nel FEP teflonato in presenza di bassa concentrations di M-CSF 11-13. Mentre monociti costituiscono meno del 5 al 10% dei leucociti del sangue periferico negli esseri umani, in seguito a stimolazione vengono reclutati per siti periferici dove si differenziano a macrofagi tissutali residenti o cellule dendritiche 17. La citochina M-CSF è importante per la sopravvivenza dei monociti e guida la loro differenziazione a macrofagi 18,19. Finora, le concentrazioni M-CSF, che sono stati scelti per la differenziazione dei monociti variava fino a 100 ng / ml, però, nel nostro protocollo, siamo in grado di ottenere un numero sufficiente di macrofagi maturi con una concentrazione M-CSF di soli 2,5 ng / ml 12 , 20. Inoltre, le cellule sono coltivate in FEP rivestiti in teflon sacchi di coltura cellulare che facilitano il distacco dei macrofagi e la loro successiva semina nel numero di cellule definite. Poiché i sacchetti possono essere riutilizzati più volte, ciò riduce ulteriormente i costi per il processo di isolamento. I macrofagi ottenuti con tale procedurasono molto positivo per CD45, CD14, CD11b, CD11c e mostra espressione del CD206 recettore del mannosio, che sostiene la necessità di una popolazione di puri, macrofagi maturi 21,22. Particolarmente elevata espressione CD14 è tipico di macrofagi differenziati in presenza di M-CSF 23. Dopo la semina delle cellule, mostrano un facile aderenza alle superfici di plastica con alcune cellule mostrano una tipica morfologia mandrino-simili, mentre altri mostrano un fenotipo uovo fritto. Ciò è in accordo con le osservazioni da altri autori 18,22,24. E &#39;stato riferito che la differenziazione dei monociti in presenza di M-CSF porta a macrofagi M2-polarizzati 16,25. Tuttavia, i macrofagi isolati dal nostro protocollo sono ancora in grado di rispondere ad una vasta gamma di stimoli, tra cui l&#39;esposizione a microvescicole derivati ​​dalle cellule tumorali e di co-coltura con cellule tumorali 26,27 o l&#39;esposizione a LPS a cui reagiscono con induzione di pro geni infiammatorie come IL-1 &amp;# 946 ;, TNFa, Wnt5a, o varie metalloproteinasi della matrice che sono considerati tipici per i macrofagi M1-polarizzati 3,5,28. In conclusione, l&#39;isolamento di monociti di doppio gradiente di densità centrifugazione e successiva differenziazione verso macrofagi in FEP rivestiti in teflon coltura cellulare sacchetti risultati in un alto numero di macrofagi, senza la necessità di procedure tecnicamente difficile o costoso. I macrofagi ottenuti possono essere utilizzati per la successiva analisi vanno dalla classica attivazione tramite LPS alla co-coltura con cellule tumorali.

Le cellule del lignaggio monociti e loro terminalmente differenziate derivati ​​- macrofagi - mostrano una plasticità sorprendente in relazione alla loro funzione biologica, che porta alla loro coinvolgimento in tali processi diversi come lo sviluppo, la riparazione dei tessuti, e l&#39;immunità 1. Quest&#39;ultima è dovuta alla loro fagocitosi e la capacità presentanti l&#39;antigene che pone i macrofagi al crocevia tra la risposta immunitaria innata e adattiva 2. Tuttavia, la loro capacità di secernere citochine, chemochine, fattori di crescita e altre molecole di segnalazione 1 aumenta non solo la loro funzione immuno-modulante, ma serve anche come base per le loro funzioni aggiuntive. I tentativi di rispecchiare questi passaggi di attivazione diversi nel contesto di non-microbiche condizioni mediate hanno provocato la M1 e M2 categorie 3. Anche se questa classificazione non è completa, permette una comprensione di base di biologia dei macrofagi. A causa di queste capacità poliedriche si tratta come nessuna sorpresa che i macrofagi sono associati a molte condizioni che in qualche modo coinvolgono rimodellamento tissutale o infiammazione. Accanto al loro ruolo fondamentale nel riconoscimento e liquidazione dei patogeni invasori 4-6, i macrofagi hanno dato ampio risalto in aterosclerosi, fibrosi, obesità, cancro e 7-10. Un metodo riproducibile per la generazione di macrofagi umani è pertanto essenziale per la comprensione di queste patologie. Presentiamo qui un metodo basato sull&#39;isolamento di monociti umani da sangue periferico di donatori sani da una doppia tecnica di centrifugazione in gradiente di densità come descritto in precedenza 11. Per facilitare la differenziazione verso macrofagi, le cellule monociti isolati vengono incubate in presenza di basse concentrazioni di M-CSF e siero umano normale 12. Per facilitare ulteriormente la movimentazione e la raccolta delle cellule, differenziazione avviene in gas permeabile FEPBorse di coltura cellulare in teflon rivestito con una superficie idrofoba 12-15. Le risultanti macrofagi riposo possono essere sottoposti ad una vasta gamma di analisi in quanto sono ancora in grado di rispondere in maniera sia M1 o M2-like. Metodi alternativi di isolamento monociti e la successiva differenziazione quali magnetica delle cellule attivate smistamento (MACS) o controcorrente elutriazione centrifuga (CCE) hanno alcune limitazioni per quanto riguarda la resa, costi e tempi necessari. Il protocollo qui descritto offre il vantaggio di poter essere effettuata con apparecchiature di laboratorio standard senza la necessità di reagenti speciali (per esempio, MACS sfere magnetiche) o dispositivi (ad esempio, apparecchi CCE) e permette l&#39;elaborazione di grandi quantità di cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Macrofagi umani sono coinvolti in una miriade di processi patologici che vanno dalle malattie infettive al cancro. Così essi rappresentano un valido strumento per comprendere i meccanismi alla base di queste malattie. Pertanto presentiamo un protocollo semplice per l&#39;isolamento di monociti umani da buffy coat, seguita da una procedura di differenziazione che si traduce in rese elevate macrofagi. La tecnica si basa principalmente su apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili e, quindi, fornisce un modo conveniente e tempo effettivo di ottenere grandi quantità di macrofagi umani. Brevemente, buffy coat di donatori di sangue sani sono sottoposti ad un doppio gradiente di densità centrifugazione per raccogliere monociti dal sangue periferico. Questi monociti sono poi coltivate in fluorurati etilene propilene (FEP) teflonato borse di colture cellulari in presenza di macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF). I macrofagi differenziati possono essere facilmente raccolti e utilizzati per successivi studi e funzionaledice. Metodi importanti per il controllo della qualità e la convalida dei passi isolamento e la differenziazione verranno evidenziate all&#39;interno del protocollo. In sintesi, il protocollo qui descritto consente agli scienziati di isolare routine e riproducibile macrofagi umani senza la necessità di utensili cost intensiva. Inoltre, modelli di malattia possono essere studiati in un sistema umano singenico eludere l&#39;uso di macrofagi murini.

La prima centrifugazione in gradiente di densità con Ficoll produce un interfase bianco contenente il PBMC (Figura 1A) cioè linfociti e monociti. Questo può essere confermato attraverso una colorazione May-Gruenwald (Figure 1B e C) delle cellule raccolte, che mostra sia un alto nucleo / citoplasma rapporto (tipici dei linfociti) e bean- o nuclei a forma di anello (tipica dei monociti). Quando queste cellule vengono poi caricati su un secondo gradiente di densità utilizzando Percoll, i monociti possono essere ulteriormente separati dai linfociti e ancora apparire come un interfase bianco (Figure 1D-F). Per ogni mano buffy l&#39;descritta doppia densità centrifugazione in gradiente produce ordinariamente 150 ± 40 x 10 6 monociti, che possono essere differenziati a 70 ± 30 x 10 6 macrofagi (Figura 2) per buffy coat. La resa media da macrofagi20 preparazioni indipendenti era 47 ± 14% del totale dei monociti isolati. Dopo la centrifugazione in gradiente di Percoll ci potrebbe essere ancora alcune cellule non monocitica residui presenti nel preparato che dipende il donatore di sangue, nonché sulla precisione del processo di isolamento. Tuttavia, dopo la fase di differenziazione di 6-7 giorni, la preparazione è costituito principalmente da macrofagi maturi (Figura 3) che possono essere ulteriormente arricchiti grazie alla loro aderenza alle superfici di plastica, una caratteristica che non è condivisa dalle cellule contaminanti casuali (Figure 4A e B). Una volta placcato, la maggior parte dei macrofagi mostrano un classico &quot;uovo fritto&quot; morfologia mentre ci sono anche cellule con un fenotipo mandrino allungato simile (Figure 4C e D). Questo si riflette nel loro distribuzione F-actina all&#39;interno del citoplasma e adesione cluster. Le cellule differenziatesi caratterizzano per l&#39;espressione di CD45, CD14, CD16, CD206 (recettore del mannosio), CD11b e CD11c che sono i marcatori tipici di macrofagi maturi (Figura 5). La presenza di CD11b argomenta contro una differenziazione prevalentemente dendritico che è supportato dal fatto che le cellule sono negative per il marcatore CD209 cellule dendritiche (DC-SIGN). Dopo il processo di differenziazione le cellule rimangono funzionalmente e metabolicamente attiva per circa 5-7 giorni (Figura 6), in quanto può essere visualizzato da calceina AM colorazione e la loro capacità di prendere vescicole extracellulari versato dalle cellule tumorali. Inoltre, le cellule possono ancora essere attivati ​​come mostrato ad esempio, per la stimolazione con lipopolisaccaride (LPS) che comporta l&#39;espressione di diversi geni pro-infiammatori (Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 Aspetto e composizione del PBMC- e monociti-strato dopo gradiente di doppia densità centrifugazione. Fotografia che illustra (A) il PBMC-band dopo il gradiente Ficoll e (D) la monociti-fase dopo l&#39;iso-osmotica Percoll centrifugazione. May-Gruenwald colorazioni di preparati cytospin di (B, C) ​​Frazione PBMC e per il restante (E, F) monociti. Barra della scala = 200 micron di B ed E, = 50 micron di C e F. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2 Resa dei monociti e macrofagi. Conteggi cellulari rappresentativi di monociti e macrofagi isolati di 20 buffy coat preparations. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Micrografie e misurazione delle dimensioni delle cellule di monociti e macrofagi. Microscopio a contrasto di fase di sospensione cellulare monocitica prima (A) e dopo (B) differenziazione dei macrofagi. Corrispondenti istogrammi dimensioni delle cellule di monociti (C) e macrofagi (D). Barra della scala = 100 micron. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4 Morfologia e l&#39;organizzazione del citoscheletro dei macrofagi aderenti. Microscopio a contrasto di fase dei macrofagi aderenti prima (A) e dopo (B) rimozione delle non-adherencellule T. (C, D) falloidina-TRITC colorazione di actina filamentosa in aderenti, macrofagi non stimolati. Barra della scala = 100 micron in AC, 20 micron di D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Immunofenotipo di macrofagi differenziati. Citometria a flusso analisi dei macrofagi dopo 6 giorni di differenziazione in FEP rivestiti in teflon sacchetti di colture cellulari (indicata in rosso). I relativi controlli isotipici sono mostrati in grigio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 6 La diffusione delle microvescicole cellulari tumorali da parte dei macrofagi. Micrografie di macrofagi aderenti a seguito di esposizione a PKH26-etichettati microvescicole derivati ​​dalle cellule (rosso fluorescente) tumorali. Le immagini vengono sovrapposti alla corrispondente (A) campo chiaro o (B) colorazione citoplasmatica con l&#39;AM vitalità colorante calceina. Bar scale = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7 Upregulation di IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, e MT1-MMP dopo stimuzione dei macrofagi con LPS (100 ng / ml) per 24 ore. L&#39;espressione genica è stata misurata mediante RT-PCR quantitativa di campioni di RNA totale (A) e normalizzato sull&#39;espressione HPRT1 e GNB2L1. I valori indicati sono cambiamenti volte rispetto al controllo non trattato (significa ± SD, n = 5, * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). TNFa e IL-6 induzione sotto stimolazione con LPS sono stati ulteriormente confermata mediante ELISA (B) (media ± SD, * p &lt;0,05).

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Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.3K Views.  University Medical Center Göttingen.  Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi. 

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

Differenziazione indotta di cellule M in monostrati Enteroidi Ileal Imbecilli derivati da cellule staminali umane

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...