L'infezione da HIV causa disfunzione immunitaria anche in individui sottoposti a terapia antiretrovirale senza virus rilevabile. Questo metodo consente lo studio della funzione dei monociti che sono regolatori chiave della risposta immunitaria. Abbiamo ottimizzato questa tecnica per l'isolamento, la cultura e la trasfezione dei monociti primari umani.
Usiamo questo metodo per comprendere i meccanismi molecolari della disfunzione immunitaria negli individui infetti da HIV, ma può essere applicato a qualsiasi altro studio immunitario che coinvolga i monociti. Se è la prima volta che lavori con il sangue umano, ricorda di seguire i protocolli di biosicurezza appropriati e di trattare tutti i campioni come materiale possibilmente infettivo. Dopo aver raccolto 40 millilitri di sangue intero umano fresco in quattro tubi a vuoto EDTA da 10 millilitri, utilizzare una tecnica sterile per trasferire tutto il sangue in un singolo tubo di propilene conico da 50 millilitri in un armadio di biosicurezza.
Seguendo le istruzioni del produttore da un kit di isolamento monocito umano selezionato, aggiungere due millilitri di cocktail di isolamento monocita dal kit al tubo di sangue e vortice le perline magnetiche dal kit per 30 secondi. Aggiungere due millilitri di perline al sangue e utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per mescolare accuratamente le perline con il sangue. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, dividere il sangue equamente tra quattro tubi da 50 millilitri e aggiungere 30 millilitri di PBS sterile integrati con un EDTA millimolare ad ogni tubo.
Mescolare nuovamente con una pipetta sierologica in plastica da 25 millilitri e posizionare i tubi in supporti magnetici. Dopo 10 minuti, utilizzare una pipetta per disegnare il contenuto dal centro di ogni tubo facendo attenzione a non aspirare più di un millilitro di globuli rossi e distribuire il contenuto del tubo in uno dei quattro nuovi tubi da 50 millilitri. Aggiungere altri 500 microlitri delle perline magnetiche vorticose a ciascun tubo e mescolare delicatamente la soluzione cellulare.
Riposizionare i tubi nei supporti magnetici per cinque minuti prima di trasferire attentamente il contenuto dal centro di ciascun tubo in uno dei quattro nuovi tubi da 50 millilitri. Una volta trasferite tutte le sospensioni cellulari, posizionare ogni nuovo tubo da 50 millilitri nei supporti del magnete per cinque minuti prima di trasferire attentamente il contenuto del tubo in un terzo set di quattro nuovi tubi da 50 millilitri. Quindi raccogliere le cellule per centrifugazione e rimosogliere tutti e quattro i pellet cellulari in un totale di 10 millilitri di PBS sterile per il conteggio.
Dopo il conteggio, rimescolare i monociti isolati a una volta 10 alla sesta cellule per millilitro di 37 gradi Celsius mezzo RPMI 1640 privo di siero integrato con antibiotici e placcare un millilitro di cellule rimescolate in piastre di 35 millimetri in un armadio di biosicurezza. Quindi posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per 30-60 minuti per consentire alle cellule di aderire ai fondi del pozzo. Per prime per i macrofagi con un fenotipo simile a M1, aggiungere 100 microlitri di siero bovino fetale contenenti 25 nanogrammi per millilitro di GM-CSF a ciascuna piastra.
Per innescare macrofagi con un fenotipo simile a M2, aggiungere 100 microlitri di bovini fetali contenenti 50 nanogrammi per millilitro di M-CSF a ciascuna piastra. Per la trasfezione di monociti con imitazioni di microRNA, inibitori o un piccolo RNA interferente, seguendo il protocollo del produttore per il kit di trasfezione, diluire gli RNA selezionati nel buffer a una concentrazione finale di 1,83 micromolare in 10 microlitri di imitazione diluita o inibitore per trasfezione di una per 10 alla quinta quantità di cellule. Per preparare il reagente di trasfezione, aggiungere un microliter del polimero fornito a un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e aggiungere immediatamente 90 microlitri del tampone fornito dal kit per ottenere un totale di 91 microlitri di reagente per trasfezione.
Vortice il reggente per tre o cinque secondi e pipetta 90 microlitri della soluzione di trasfezione nel tubo contenente 10 microlitri di RNA diluito. Dopo una miscelazione delicata, incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere 100 microlitri di complesso di trasfezione a un pozzo di cellule. Dopo quattro ore a 37 gradi Celsius, sostituire il mezzo con tre millilitri di mezzo completo contenente il fattore di crescita appropriato.
Il sesto giorno di coltura, sostituire i supernatanti di coltura delle colture M1 con tre millilitri di mezzo integrati con siero bovino fetale, antibiotici, lipopolysaccaride e gamma di interferone e sostituire i supernatanti delle colture M2 con mezzo integrato con siero bovino fetale, antibiotici, M-CSF e interleuchina-4. Dopo 24 ore di coltura, lavare ogni piatto di macrofagi attivati due volte con PBS fresco per lavaggio. Per le analisi dell'RNA e delle proteine, lesinare le cellule attaccate direttamente nelle piastre per consentire la raccolta del contenuto cellulare rilasciato per la loro analisi.
Per l'analisi citometrica del flusso, staccare le cellule con due EDTA millimolare in PBS per 10 minuti a 37 gradi Celsius prima di raschiare delicatamente le cellule dai fondi della piastra per consentire la loro raccolta in tubi microcentrifuge da 1,5 millilitri per la loro analisi. Qui vengono mostrati istogrammi rappresentativi di cellule di controllo attivate da M1 e derivate dal paziente con livelli aumentati di cellule attivate da CD80 e CD83 e M2 con livelli aumentati di CD163 e CD209 rispetto alle cellule T0 non attivate. È interessante notare che CD80 e CD83 sembravano essere più espressi nelle cellule derivate dal controllo rispetto alle cellule derivate dall'HIV.
La trasfezione di monociti appena raccolti con un microRNA criptato al vicino infrarosso si traduce in un'efficienza di trasfezione superiore al 90% determinata dalla citometria a flusso e dalla microscopia confocale. Inoltre, la trasfezione non riduce significativamente la vitalità delle cellule derivate dal paziente o di controllo indipendentemente dallo stadio di maturazione cellulare o dalle condizioni di trasfezione. La trasfezione si traduce in un'efficace downregolazione del gene bersaglio durante la trasfezione con il piccolo RNA interferente specifico sia al primo giorno che al quarto giorno dopo l'isolamento.
Inoltre, le cellule trasfette con imitazione del microRNA dimostrano un aumento da 48 a 72 volte dell'espressione del microRNA rispetto alle cellule non trasfette, mentre tutti i controlli di trasfezione non mostrano cambiamenti apprezzabili. Il numero di cellule placcate è fondamentale per la sopravvivenza. Consigliamo un milione di cellule per piatto da 35 millimetri.
La placcatura in mezzo privo di siero migliorerà notevolmente anche l'attacco cellulare. Le cellule ottenute con questo metodo possono essere trattate con citochine o fattori di crescita per studiare risposte differenziali in pazienti di interesse e controlli sani.
