Ringraziamo Amy Chen per il suo aiuto nella preparazione per le riprese video e per dimostrare la tecnica. Questo lavoro condotto da ENIGMA: Ecosistemi e reti integrate con i geni e assembly molecolari (http://enigma.lbl.gov), un programma di messa a fuoco Scientifico Area presso il Lawrence Berkeley National Laboratory, è stato supportato da Office of Science, Ufficio biologiche e ricerca ambientale, del Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti nell&#39;ambito del contratto n ° DE-AC02-05CH11231.

Nota: Il protocollo seguito è su misura per la determinazione degli obiettivi del gene della DVU3023 RR dal batterio Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Può essere adattata a qualsiasi altro regolatore trascrizionale di interesse. 1. Clone e Purify RR <ol><li> Clonare il gene RR, in particolare DVU3023, da D. vulgaris Hildenborough in un Escherichia coli vettore di espressione tale che il gene è C-terminale His-tag e di espressione è sotto il controllo di un promotore T7. Nota: Diversi metodi di clonazione possono essere utilizzati e sono determinati dal ricercatore. Si possono utilizzare anche i tag di affinità alternativi. </li><li> Trasforma l&#39;espressione costrutto in E. coli BL21 (DE3) ceppo espressione. </li><li> Crescere 1 L di ceppo espressione BL21 a 37 ° C. Alla fase mid-log, aggiungere IPTG 0,5 mM per indurre l&#39;espressione della proteina. Continua crescita a temperatura ambiente per 24 ore. </li><li> Centrifugare le cellule a 5.000 xg per 10 kmn a 4 ° C. Risospendere le cellule in tampone di lisi (20 mM sodio fosfato, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazolo 40 mM, 1 mg / ml lisozima, 1x benzonasi nucleasi). Cellule Lisare utilizzando una pressa francese a 4 ° C. </li><li> Centrifugare lisato a 15.000 xg per 30 min a 4 ° C. Filtrare con un filtro siringa da 0,45 micron. </li><li> Lavare la colonna 1 ml Ni Sepharose su uno strumento FPLC utilizzando 10 ml di tampone di lavaggio (fosfato di sodio 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazolo 40 mM). </li><li> Caricare lisato sulla colonna. Lavare colonna con 20 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Eluire DVU3023 utilizzando un gradiente di 0-100% tampone di eluizione (20 mM fosfato di sodio, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazolo 500 mM). </li><li> Caricare frazioni eluite su una colonna desalificazione, e lavare con un tampone di dissalazione (20 mM sodio fosfato pH 7,4, 100 mM NaCl). </li><li> Centrifugare campione di proteine ​​in un peso di taglio del filtro alta centrifuga molecolare di concentrare la proteina. Aggiungere DTT 0,1 mM e glicerolo al 50% e proteine ​​conservare a -20 ° C. Nota: I metodi di purificazione dovranno essere ottimizzati singolarmente per ogni proteina studiata. </li></ol> 2. Determinare gene target per RR Uso Electrophoretic Mobility Maiusc Assay (EMSA) <ol><li> PCR amplifica 400 bp regione a monte del DVU3025 candidato gene bersaglio, utilizzando D. vulgaris Hildenborough DNA genomico come modello, e un primer marcato in avanti e una retromarcia 5&#39;-biotina marcata con primer. Nota: Consigli per scegliere un candidato gene bersaglio: Spesso RR legano le regioni a monte del proprio gene / operone, oppure possono regolare i geni prossimale codificati. Se la RR ha ortologhi in altre specie, per cercare i geni che sono conservati nel quartiere. Metodi alternativi comprendono la scelta di geni candidati sulla base di previsioni regulone (ad esempio, RegPrecise 5), o previsione promotori sigma54-dipendente per 6 RR che sono essi stessi sigma54-dipendente. </li><li> Eseguire il prodotto di PCR su un gel di agarosio 1%, tagliare il 400 bprodotto di dimensioni p, e purificare il DNA utilizzando un gel di estrazione ripulire kit. </li><li> Mescolare proteina DVU3023 (0,5 pmol) con 100 fmol di substrato DNA biotinilato in 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25% glicerolo e 1 mg / ml poly dI.dC (non -specifico concorrente DNA) in un volume totale di 20 microlitri. Anche impostare una reazione senza alcuna proteina come controllo. Incubare le reazioni a temperatura in panchina ambiente per 20 min. </li><li> Nota: Queste sono condizioni standard elencati e gli altri componenti di reazione possono essere aggiunti a seconda della RR di interesse. Se l&#39;attivazione è desiderato, aggiungere 50 mM fosfato acetil alla reazione (spesso RR legheranno DNA in vitro senza attivazione). </li><li> Pre-eseguire un prefabbricato mini 6% poliacrilammide-TBE 0.5x gel in tampone TBE 0,5 x a 100 V per 30 min. Aggiungere 5 ml di tampone 5x carico (0,1% blu di bromofenolo, 0,1% xilene cyanol, 30% glicerolo in 1x TBE) per le reazioni di legame e di carico di 18 ml di reazioni accede al gel. Eseguire a 100 V per 2 ore. Nota: Per evitare il surriscaldamento, che può portare alla dissociazione dei complessi proteina-DNA, riempire la camera di transito esterno nel sistema di elettroforesi con tampone di corsa tale che la maggior parte del gel è isolato dal tampone. In alternativa, il gel può essere eseguito a 4 ° C. </li><li> Tagliare una membrana di nylon caricata alla dimensione del gel e immergerlo in 0,5 x TBE per almeno dieci minuti. Rimuovere il gel dalla cassetta. Tagliare tutte le creste il gel e panino il gel e la membrana tra due filtri di carta spessa imbevuti di 0,5 x TBE, e posto all&#39;interno di un apparato di blotting semi-dry e correre a 20 V per 30 min. </li><li> Posizionare la membrana all&#39;interno di uno strumento di luce UV reticolante commerciali e impostare il tempo di 3 min. Nota: La membrana può ora essere conservato asciutto a temperatura ambiente per alcuni giorni prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Utilizzare un kit di rivelazione chemiluminescente disponibile in commercio che impiega una streptavidina-rafano perossidazionese coniugato a sviluppare il blot secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Immagine blot utilizzando un computer collegato a una telecamera CCD attrezzato e cercare un cambiamento nella mobilità substrato DNA in presenza del RR, che indica che il RR lega il DNA in esame. Nota: La specificità del turno proteina-DNA può essere testato includendo nella reazione un eccesso di DNA non marcato concorrente, che dovrebbe eliminare o ridurre lo spostamento visto. </li></ol> 3. Verificare arricchimento target dopo la DNA-proteina Genomic Binding <ol><li> Genomic DNA-proteina reazione di legame <ol><li> Shear DNA genomico ad una dimensione media di 500 bp da sonicating 100 microlitri di DNA genomico (a concentrazioni 100-200 ng / mL) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga utilizzando un micropunte con 9 bassi impulsi con ampiezza di 1 sec, con 2 sec divario tra ciascuno. Nota: Se gli schizzi di DNA ai lati del tubo, rallentano il contenuto dopo ogni 3 impulsi. Le condizioni esatte usatevarierà con lo strumento utilizzato sonicatore. I frammenti di DNA tranciati possono variano da 100-1000 bp, ma la dimensione media dovrebbero essere all&#39;interno di 400-600 bp. Troppo taglio può comportare un minor numero di siti di legame intatti, e troppo o troppo poco taglio interesserà preparazione biblioteca durante l&#39;intera procedura di amplificazione del genoma a valle. </li><li> Mescolare 2-3 ug di DNA genomico tranciata con proteine ​​RR (0,5 pmol di DVU3023) in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 25% glicerolo, 50 mM e acetil fosfato. Incubare le reazioni a 25 ° C per 30 min. Trasferire 10 ml di questa reazione in una provetta da 1,5 ml ed etichetta come DNA ingresso. Nota: acetil fosfato viene aggiunto per attivare la proteina mediante fosforilazione in vitro. La fosforilazione stimola legame al DNA, ma molti RR legano anche il DNA in vitro senza attivazione 7. La quantità di proteina aggiunto alla reazione dipenderà attività della proteina prep. L&#39;EMSA può essere utilizzato per scegliereimize questo importo. </li></ol></li><li> Affinity purificare il DNA legata alle proteine <ol><li> Aggiungere 30 ml di resina Ni-NTA agarosio in una provetta da microcentrifuga 0,6 ml. Centrifugare a 100 xg per 1 minuto per raccogliere la resina nella parte inferiore, e rimuovere il surnatante. Aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 25% glicerolo), flick provetta per miscelare e centrifugare a 100 xg per 2 minuti. Rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere i restanti 90 microlitri della reazione di legame alla resina lavata Ni-NTA e incubare in un agitatore rotante per 30 min. </li><li> Centrifugare a 100 xg per 2 minuti e rimuovere il surnatante (DNA non legato). Aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio, sfiora il tubo per miscelare il contenuto, e centrifugare a 100 xg per 2 minuti. Rimuovere il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio per altre due volte. </li><li> Aggiungere 35 ml di tampone di eluizione (tampone fosfato di sodio 20 mM pH 8, NaCl 500 mM, imidazolo 500 mm) per la resina e mescolare nel vortex. Incubare in panchina a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml ed etichetta come frazione del DNA legata alle proteine. </li><li> Anche aggiungere 35 ml di tampone di eluizione al DNA ingresso. </li><li> Purificare l&#39;ingresso e le frazioni di DNA legati alle proteine ​​utilizzando un kit di purificazione PCR. </li></ol></li><li> Intero genoma amplificare l&#39;input e campioni di DNA legati alle proteine. <ol><li> Aggiungere 10 ml di ingresso e legata alle proteine ​​DNA per separare provette PCR. Aggiungere 1 ml di 10x tampone di frammentazione, 2 ml di tampone Biblioteca Preparazione e 1 ml di soluzione Biblioteca di stabilizzazione per ogni campione. Mescolare bene nel vortex. Calore in un termociclatore a 95 ° C per 2 min, e freddo su ghiaccio. Nota: La quantità di DNA di partenza dovrebbe essere di almeno 10 ng per evitare di introdurre distorsioni amplificazione. </li><li> Aggiungere 1 ml di Biblioteca preparato enzimatico, mescolare pipettando, e incubare in termociclatore a 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C per 20 min, 75 ° C / 5 min, E tenuta a 4 ° C. </li><li> Per ogni provetta, aggiungere 47,5 ml di acqua, 7,5 ml di 10x amplificazione master mix, e 5 ml di polimerasi. Mescolare bene e scaldare a 95 ° C / 3 min, seguiti da 20 cicli di 94 ° C/15 sec, 65 ° C / 5 min. Tenere reazioni a 4 ° C. </li><li> Purificare i campioni di DNA amplificati usando un kit di purificazione PCR e misurare la concentrazione di DNA spettrofotometricamente. </li></ol></li><li> Verificare arricchimento target nel DNA legata alle proteine ​​mediante qPCR <ol><li> Primer design qPCR per amplificare 200 bp della regione a monte del gene target EMSA-verificato (DVU3025) utilizzando qualsiasi software di progettazione di primer liberamente disponibile. </li><li> Impostare reazioni qPCR triplicato per ogni modello di DNA con ogni set di primer. Preparare una master mix per ogni set di primer. 1x master mix contenente 10 ml di miscela 2x SYBR Green qPCR, 0,5 mM di ciascun primer e acqua per un totale di 18 microlitri. Aliquota 18 microlitri della master mix per pozzetto di una piastra PCR da 96 pozzetti. </li><li> Dilute il amplificati e ingresso purificata e campioni di DNA legati alle proteine ​​di 5 ng / mL con acqua e utilizzare come modello il DNA. Aggiungere 2 ml di DNA templato ai pozzetti. </li><li> Sigillare la piastra con un ultra trasparente pellicola di tenuta qPCR, spin down piastra in una centrifuga a 200 xg / 1 min. Posizionare la piastra in una macchina qPCR in tempo reale. Ciclo come segue utilizzando il software associato qPCR: 95 ° C / 1 min, e 40 cicli di 95 ° C/10 sec, 59 ° C/15 sec, e 70 ° C/35 sec. </li><li> Anche istituito reazioni qPCR triplicato con primer per amplificare regioni a monte di un gene estraneo (controllo negativo). </li><li> Calcola ΔC T sottraendo C valore T di legame proteico DNA da quello del DNA ingresso. Calcola arricchimento piega di gene bersaglio nel DNA legata alle proteine ​​come 2 ΔC T. Nota: Se la regione a monte obiettivo è stato arricchito nel legata alle proteine ​​DNA rispetto al DNA ingresso, indica che le reazioni di legame e purificazione per affinità erano successful. Passare al punto 4. Se non è stato osservato un arricchimento della regione a monte di destinazione, ripetere le reazioni di legame (passo 3,1) con diverse quantità di proteine. </li></ol></li></ol> 4. Etichettatura DNA e ibridazione Array <ol><li> Etichetta DNA di ingresso con il DNA Cy3 e arricchito con Cy5 ota: Cy3 e Cy5 coloranti sono sensibili alla luce e la cura devono essere prese per mantenere l&#39;esposizione della luce al minimo. <ol><li> Mescolare 1 mg DNA con 40 microlitri Cy3/Cy5-labeled 9-mers e regolare il volume a 80 ml con acqua. </li><li> Denaturare calore a 98 ° C per 10 minuti al buio (in un termociclatore). Freddo rapido in ghiaccio per 2 min. </li><li> Aggiungere 2 microlitri Klenow polimerasi (3&#39;-5&#39;-exo -, 50.000 U / ml), 5 mM dNTPs, e 8 microlitri di acqua a ciascuna reazione, mescolare bene, e incubare a 37 ° C per 2 ore al buio (in un termociclatore). </li><li> Aggiungere 50 mM EDTA per bloccare la reazione e la soluzione di NaCl allo 0,5 M. </li><li> Campioni Trasferire 1,5 ml provette containing 0,9 volume di isopropanolo, incubare al buio per 10 minuti, e centrifugare a 12.000 xg per 10 min. Il pellet deve essere rosa per il DNA Cy3 marcato e blu per il DNA Cy5 marcato. </li><li> Lavare pellet con etanolo 80% (500 microlitri) e centrifugare a 12.000 xg per 2 min. Pellets all&#39;aria per 5-10 minuti nel buio. Nota: Le pastiglie possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Risospendere pellet in 25 microlitri di acqua. Misurare la concentrazione di DNA spettrofotometricamente. </li><li> Pool insieme 6 mg ciascuno di DNA-Cy3 e Cy5 marcato in una provetta da 1,5 ml e vuoto a secco in una centrifuga a fuoco al buio (coprire il coperchio della centrifuga se è trasparente). Nota: Le pastiglie possono essere conservati a -20 ° C fino al momento ibridazione. </li></ol></li><li> Microarray Ibridazione <ol><li> Accendere il sistema di ibridazione in 3-4 ore prima di usare e impostare la temperatura a 42 ° C. </li><li> Preparare una soluzione di ibridazione master mix tale soluzione contiene 11,8 microlitri 1x 2x Hybriditampone zione, 4,7 microlitri Ibridazione componente A, e 0,5 microlitri allineamento oligo. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di acqua. Aggiungere 13 ml di questa miscela al campione. Vortex per 15 sec, incubare a 95 ° C in un bagno a secco per 5 min. I campioni a 42 ° C nel sistema ibridazione fino pronto per il caricamento. </li><li> Preparare il microarray gruppo otturatore, mixer, secondo il protocollo del produttore. </li><li> Posizionare il gruppo miscelatore slitta all&#39;interno del sistema di ibridazione. Carico 16 ml di campione nella porta di riempimento, sigillare le porte con un film adesivo, mescolando a girare nel sistema, e ibridare per 16-20 ore a 42 ° C. </li><li> Preparare 1x I tamponi di lavaggio (250 ml), II (50 ml) e III (50 ml) diluendo i 10x buffer disponibili commercialmente in acqua, e ad ogni aggiungi DTT 1 mM. Buffer caldo I a 42 ° C. </li><li> Far scorrere il mixer-slide in uno strumento di smontaggio, e posto all&#39;interno di un recipiente contenente calda Buffer I. Sbucciare la mixer off, mentre vigorosamente shaking lo strumento di smontaggio a mano. </li><li> Mettere il vetrino in un contenitore con 50 ml di tampone di lavaggio I e agitare vigorosamente per 2 minuti a mano. </li><li> Trasferimento di scivolare in un secondo contenitore con tampone di 50 ml di lavaggio II e agitare vigorosamente per 1 min a mano. </li><li> Trasferimento diapositiva in un terzo contenitore con 50 ml di Tampone di lavaggio III, e agitare energicamente per 15 secondi a mano. </li><li> Asciugare rapidamente i bordi del vetrino su un tovagliolo di carta, e inserire in un rack scorrevole. Centrifugare a 200 xg per 2 minuti per asciugare il vetrino. Collocare all&#39;interno caso diapositiva, avvolgere con pellicola e riporre in un essiccatore. </li></ol></li><li> Scansione Array <ol><li> Posizionare la diapositiva all&#39;interno dello scanner microarray secondo le istruzioni dello strumento. </li><li> Utilizzare un software dello scanner per impostare le lunghezze d&#39;onda 532 nm = Cy3 e 635 nm = Cy5, e gli utili fotomoltiplicatori iniziali tra i 350 ei 400. </li><li> Visualizzare l&#39;anteprima della diapositiva per individuare la matrice sulla diapositiva. Selezionare la regione di matrice per la scansione. </li&gt; <li> Scansione matrice e regolare le impostazioni fotomoltiplicatori tale che le caratteristiche di matrice sono per lo più giallo. L&#39;istogramma dovrebbe mostrare le curve rosse e verdi sovrapposte o il più vicino possibile l&#39;una all&#39;altra. Le curve devono terminare sopra i 10 -5 conteggi normalizzati a saturazione. </li><li> Salvare separatamente entrambi i 532 e 635 nm immagini. </li></ol></li><li> Array Analisi dei dati <ol><li> Importare le immagini in un software di analisi serie. Utilizzando il software, creare due relazioni (coppia. Coppia) per ogni array (per le immagini Cy3 e Cy5). Crea scalate log 2 file di rapporto utilizzando i file coppia. Utilizzare log 2 file di rapporto per la ricerca di picchi utilizzando una finestra scorrevole di 500 bp. Mappa loci vetta alle regioni a monte dei geni bersaglio. </li><li> Controllare se il target positivo (determinato mediante EMSA e confermato da qPCR, DVU3025 in questo esempio) compare tra le prime vette. Nota: Se il bersaglio positivo non è tra i primi successi, è possibile che la RR in consideration ha diversi obiettivi del gene e replicare DAP-chip può essere condotta e picchi comuni a tutte le repliche può essere utilizzato per generare un elenco di destinazione. </li></ol></li></ol> 5. Binding Pronostico sito Motif e Validazione <ol><li> Recuperare sequenze per le regioni a monte (400 bp) per i target gene migliori come generato da analisi DAP-chip. Applicare MEME su queste sequenze attraverso microbi Online (meme.nbcr.net) per prevedere motivi. Nota: Enhancer proteine ​​leganti quali regolatori sigma54-dipendenti possono associare diverse centinaia di paia di basi a monte del sito di inizio. Per altri regolatori trascrizionali, una regione inferiore come 200 bp a monte sarà sufficiente. </li><li> Top Progettazione e inferiore filo oligomeri di DNA che contengono il motivo del sito di legame predetto affiancato da 10 basi su entrambe le estremità. Ordinare il filo top 5 &#39;biotinilato. </li><li> Mescolare le superiore e inferiore oligo filo in rapporto 1:1,5 in 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, NaCl e 50 mmun volume totale di reazione di 20 microlitri in tubi PCR. Riscaldare a 95 ° C per 5 minuti in un termociclatore, seguito da un raffreddamento lento a 25 ° C. Diluire dieci volte e utilizzare come wild-type substrato dsDNA per EMSA. </li><li> Preparare substrati modificati utilizzando la stessa procedura di cui sopra, ma oligomeri di progettazione per portare 4-6 sostituzioni nelle basi conservati del motivo di legame. </li><li> Impostare le reazioni di legame con la RR e il tipo selvatico o substrati modificati ed esaminare con EMSA come descritto al punto 2. </li><li> Nota: Il motivo previsto è convalidata se il RR lega il tipo di supporto di natura, ma non quello modificato. </li></ol> 6. Conservazione della Motif in altre specie batteriche correlati <ol><li> Selezionare genomi di interesse che contengono ortologhi di DVU3023. Ottenere file di sequenze e annotazioni per i genomi dal sito NCBI. </li><li> Utilizzare un linguaggio di programmazione come Perl per scrivere script che utilizzeranno le sequenze motivi dagli obiettivi DAP-chip per costruire un posmatrice pesata ition e usare la matrice di segnare motivi simili presenti in altri genomi sequenziati. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse a divulgare.

Il metodo DAP-chip qui descritto è stato utilizzato con successo per determinare gli obiettivi del gene per diversi RR in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 di cui una è indicata qui come risultato rappresentativo. Per RR DVU3023, la scelta di un obiettivo gene candidato era semplice. DVU3025 si trova immediatamente a valle del gene RR, ed i geni RR e di destinazione sono conservati in diverse specie Desulfovibrio, e inoltre DVU3025 ha un promotore sigma54-dipendente predetto. L&#39;EM...

La capacità dei batteri di sopravvivere e prosperare è criticamente dipendente da come sono in grado di percepire e rispondere alle perturbazioni nel loro ambiente, e questo a sua volta dipende dalla loro sistemi di trasduzione del segnale. Il numero dei sistemi di segnalamento un batterio codifica è stato chiamato il suo &quot;IQ microbica&quot; e può essere un&#39;indicazione di entrambi variabilità del suo ambiente e della sua capacità di percepire segnali multipli e mettere a punto la sua risposta 1. Due sistemi componenti di trasduzione del segnale (TCS) sono i sistemi di segnalazione più diffusi utilizzati dai batteri, e sono costituiti da una istidina chinasi (HK) che rileva il segnale esterno e trasmette tramite fosforilazione di un regolatore risposta effettrice (RR) 2. RR può avere una varietà di domini di uscita e quindi diverse modalità effettrici, ma la risposta più comune è la regolazione trascrizionale tramite un dominio di legame al DNA 1. I segnali rilevati e le corrispondenti funzioni dei vast maggioranza dei STC rimangono sconosciute. Sebbene i metodi in vivo come ChIP-chip sono abitualmente utilizzati per la determinazione dei siti di legame di fattori di trascrizione genomica 3, possono essere utilizzati solo per batteriche RR sistema a due componenti se sono note le condizioni attivanti o segnali. Spesso i segnali ambientali che attivano una TCS sono più difficili da determinare rispetto ai loro obiettivi del gene. Il microarray in vitro saggio basato qui descritto può essere utilizzato per determinare efficacemente e rapidamente i geni bersaglio e prevedere funzioni di STC. Questo saggio sfrutta il fatto che RR possono essere fosforilati e quindi attivate in vitro utilizzando piccoli donatori molecola come acetil fosfato 4. In questo metodo, denominato DAP-chip per DNA-affinità-chip purificata (Figura 1), il gene RR di interesse viene clonato con His-tag in E. coli, e una proteina marcata successivamente purificata è consentito bind a tranciata DNA genomico. Il DNA alle proteine ​​viene poi arricchita da affinità di purificazione, il DNA arricchito e l&#39;ingresso sono amplificati, fluorescente, in pool insieme e ibridato in una matrice di piastrelle che è su misura per l&#39;organismo di interesse (Figura 1). Esperimenti microarray sono soggette ad artefatti e quindi passaggi aggiuntivi sono impiegati per ottimizzare il dosaggio. Un passo è tentare di determinare un obiettivo per il RR sotto studio mediante saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (vedi workflow in figura 2). Poi, dopo il legame al DNA genomico e le fasi DAP, il DNA legato alle proteine ​​e di ingresso vengono esaminate da qPCR per vedere se il bersaglio positivo è arricchito nella frazione legata alle proteine ​​rispetto alla frazione di ingresso, confermando così condizioni ottimali di legame per l&#39; RR (Figura 2). Dopo matrice ibridazione, i dati vengono analizzati per individuare picchi di segnale di maggiore intensità che indicano loci genomici dove la proteina had vincolato. Le funzioni possono essere previsti per l&#39;RR base agli obiettivi genica ottenuti. I loci genomici destinazione vengono utilizzati per prevedere motivi sito di legame, che vengono poi sperimentalmente validati utilizzando EMSAs (Figura 2). Le previsioni funzionali e obiettivi del gene per la RR possono poi essere estesi alle specie che codificano RR ortologhe mediante la scansione di questi genomi per motivi di legame simili (Figura 2), strettamente legato. Il metodo DAP-chip in grado di fornire una serie di informazioni per una TCS dove prima non c&#39;era nessuno. Il metodo può anche essere usato per qualsiasi regolatore trascrizionale se la proteina può essere purificata e DNA condizioni di legame può essere determinata, e per qualsiasi organismo di interesse con una sequenza genomica disponibili. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Il chip DNA purificato per affinità (DAP-chip) strategia 7. Il gene RR dall&#39;organismo di interesse viene clonato con carbossi-terminale His-tag in un E. ceppo di espressione coli. Purificato la proteina His-tagged viene attivata dalla fosforilazione con acetil fosfato, e miscelato con tranciato DNA genomico. Un&#39;aliquota della reazione di legame viene salvato come DNA di ingresso, mentre il resto è sottoposto a purificazione per affinità utilizzando resina Ni-NTA. L&#39;ingresso e il DNA RR-bound sono intero genoma amplificato, ed etichettati con Cy3 e Cy5, rispettivamente. Il DNA marcato viene raggruppate e ibridato a una matrice piastrelle, che viene poi analizzato per determinare gli obiettivi del gene. Figura modificato e ristampato utilizzando la licenza Creative Commons da 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Sintesi dei flussi di lavoro. Per qualsiasi Protei taggato purificaton, iniziare determinando un obiettivo utilizzando EMSA. Lasciare proteina di legare il DNA genomico e poi DNA-affinità-Purify (DAP) e l&#39;intero genoma di amplificare (WGA) e il DNA ingresso arricchito. Se un gene bersaglio è noto, utilizzare qPCR per garantire che il bersaglio noto è arricchito nella frazione legata alle proteine. Se nessun obiettivo potrebbe essere determinato, procedere direttamente alla etichettatura del DNA e la matrice di ibridazione. Se non poteva essere osservato arricchimento da qPCR, quindi ripetere il legame proteina-gDNA e gradini DAP-WGA utilizzando diverse quantità di proteine. Utilizzare l&#39;analisi di matrice per individuare e mappare i picchi loro di geni bersaglio. Utilizzare le regioni a monte dei geni bersaglio per prevedere motivi sito di legame. Convalidare i motivi sperimentalmente utilizzando EMSAs. Utilizzare il motivo per eseguire la scansione del genoma di specie affini che codificano ortologhi del RR in fase di studio, e prevedere i geni mirati in quelle specie. Sulla base degli obiettivi del gene ottenuti, la funzione fisiologica della RR e suoi ortologhi può essere previsto. Figura modificato e ristampato con il c creativaommons licenza da 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:248px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog number</td>
			<td style="width:104px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5255-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Akta explorer (FPLC instrument)</td>
			<td colspan="2">GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">HiPrep 26/10 Desalting column</td>
			<td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>17-5087-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Biotin-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td>EC63652BOX</td>
			<td>Alternately, you can pour your own gel.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nylon membrane</td>
			<td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>INYC00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td>
			<td>Biorad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>170-3967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">UV crosslinker Model XL-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">11-992-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td>
			<td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td>
			<td align="right">89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Ni-NTA agarose resin</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="119">
			<td height="119" style="height:119px;width:255px;">GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>WGA2-50RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td>
			<td>For quantitation of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td>
			<td>Quanta biosciences</td>
			<td>95055-500</td>
			<td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">96 well clear low profile PCR microplate</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td colspan="2">PCR-96-LP-AB-C</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td>
			<td align="right">4376600</td>
			<td>Any real time PCR system may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td>
			<td align="right">28104</td>
			<td>Any PCR clean up kit may be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Cy3/Cy5-labeled nonamers</td>
			<td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td>
			<td colspan="2">N46-0001, N46-0002</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Klenow polymerase 50,000U/ml, 3&#39;-5&#39; exo-</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>M0212M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">Hybridization system</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Custom printed microarrays and mixers</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:255px;">Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix 4200A microarray scanner</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td>This model has been replaced by superior ones</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:255px;">GenePix Pro microarray software</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td>
			<td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

Nei metodi in vivo come ChIP-chip sono tecniche comunemente utilizzate per determinare obiettivi del gene globali per i fattori di trascrizione. Tuttavia, essi sono di uso limitato a esplorare batteriche due sistemi di regolazione dei componenti con condizioni di attivazione non caratterizzate. Tali sistemi regolano la trascrizione solo quando attivato in presenza di segnali unici. Poiché questi segnali sono spesso sconosciuti, il metodo vitro microarray basato in descritto in questo articolo video può essere utilizzata per determinare obiettivi del gene e siti di legame per i regolatori di risposta. Questo metodo-chip DNA purificato per affinità può essere utilizzato per qualsiasi regolatore purificata in qualsiasi organismo con un genoma sequenziato. Il protocollo prevede che permette la proteina taggato purificata da associare alla tosato DNA genomico e poi affinità purificazione del DNA alle proteine, seguita dalla marcatura fluorescente del DNA e ibridazione di una matrice di affiancamento personalizzato. Precedente passaggi che possono essere utilizzati per ottimizzare il dosaggio per specifiregolatori c sono anche descritti. I picchi generati dall&#39;analisi dei dati della matrice vengono utilizzati per prevedere motivi sito di legame, che vengono poi validate sperimentalmente. Le previsioni motivi possono essere ulteriormente utilizzati per determinare obiettivi del gene di regolatori di risposta ortologhi in specie strettamente correlate. Dimostriamo l&#39;applicabilità di questo metodo determinando gli obiettivi gene e vincolante motivi sito e prevedere quindi la funzione di un regolatore di risposta DVU3023 sigma54-dipendente nel batterio ambientale Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Il metodo di cui sopra è stato applicato per determinare gli obiettivi del gene globali delle RR del modello solfato riducendo batterio Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Questo organismo ha un gran numero di STC rappresentata da oltre 70 RR, indicando l&#39;ampia varietà di possibili segnali che rileva e risponde. In vivo analisi sulle funzioni di questi sistemi di segnalamento sono difficili da eseguire in quanto i loro segnali e quindi le condizioni attivanti sono sconosciute. Qui ...

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DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In questo articolo video descrive un metodo microarray basato in vitro per determinare gli obiettivi del gene e siti di legame per due regolatori di risposta del sistema dei componenti.

DNA purificato per affinità Chip (DAP-chip) metodo per determinare obiettivi del gene per batterica, due sistemi di regolamentazione dei componenti

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

16.6K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  In questo articolo video descrive un metodo microarray basato in vitro per determinare gli obiettivi del gene e siti di legame per due regolatori di risposta del sistema dei componenti. 

Video: DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell&#39;espressione genica attivata nelle cellule umane

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

L&#39;impiego di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the biliary tract in Suncus murinus (S. murinus&#160;). First, the specimen was dissected from S. murinus and fixed in 4% paraformaldehyde (PFA). Second, an enzymatic treatment and potential endogenous peroxidase inactivation were performed. The specimen was then exposed to the primary antibody, anti-neurofilament protein antibody, for 3-6 days. It was then incubated with the secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. The color reaction was revealed by reacting the specimen with a 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) substrate. This method can be applied to analyze the innervation of all visceral organs. Furthermore, this protocol can also be adapted to test other neuronal antibodies, but optimization of the antibodies should be done first. This method was originally introduced by Kuratani and Tanaka1,2,3.

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

A whole-mount immunohistochemical approach, to visualize neurofilament protein expression in the extrahepatic biliary tract in Suncus murinus. is presented here. This protocol can be used to analyze the innervation of all visceral organs in S. murinus or other species.

Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l&#39;innervazione del tratto bipolare in<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

Imaging live ad alta produttività di microcolonie per misurare l'eterogeneità nella crescita e nell'espressione genica

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Profilazione della modifica H3K4me3 negli impianti utilizzando la scissione sotto target e tagmentazione

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...