Questo lavoro è stato supportato da 115.347-RSG-08-271-01-GMC da ACS, e da CA138631 borsa di studio NIH.

Il protocollo è stato originariamente adattato da B. Ren, 2001. Esso rappresenta una leggera modifica del protocollo da parte Odom et al. 5 che sono disponibili all&#39;indirizzo <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pre-blocco e vincolante di anticorpi sfere magnetiche (deve essere eseguita la sera prima del punto successivo) <ol><li> Lavare 100 l di Dynabeads proteina G (per IP, si combinano per IP multipli) in 1 ml di fresca BSA / PBS soluzione (50 mg in 10 ml di BSA PBS-Questa soluzione durerà una settimana). </li><li> Raccogliere le perle utilizzando un supporto magnetico e ripetere la procedura di lavaggio altre due volte. </li><li> Successivamente, aggiungere 10 mg di anticorpo a 250 microlitri della sospensione sfere in PBS / BSA soluzione (per IP) e incubare una notte su una piattaforma rotante a 4 ° C. </li><li> Al termine, lavare le perle tre volte in 1 ml di PBS / BSA soluzione e quindi risospendere in 10 ml di PBS / BSA soluzione (per IP). </li></ol> 2. Cellula di cross-linking <ol><li> Per iniziare questa procedura, crescono di circa 10 8 cellule per immunoprecipitazione, o IP. Qui, diffusa istiocitica cellule U937 linfoma vengono utilizzati e indotto per la differenziazione monocitica con TPA per 96 ore. </li><li> In seguito la crescita cellulare, aggiungere soluzione di formaldeide direttamente sul supporto ad una concentrazione finale di 1%. Poi, agitare brevemente fiaschi e permettere loro di stare a temperatura ambiente per 10 minuti. Poi, aspirare i media e lavare le cellule con 15 ml di PBS ghiacciato. Ripetere questa lavare una volta. </li><li> Successivamente, aggiungere 6 ml di Lysis Buffer 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0.5% NP-40, 0,25% Triton X-100, contenente inibitori della proteasi) ad ogni dei flaconi sul ghiaccio. Poi, il rock i palloni per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Infine, raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare e trasferirli a 15 mL conica. A questo punto le cellule possono essere conservati a -80 ° C. </li></ol> 3. Cellula sonicazione <ol><li> Se le cellule sono state congelate, li disgelo fuori. Una volta scongelato, girare le celle in basso a 3.000 giri per 10 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Poi, risospendere le cellule in 6 ml di Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, contenenti inibitori della proteasi). Roccia delicatamente le provette a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ripetere centrifugazione e risospendere le cellule in 2,5 ml di Lysis Buffer 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, deossicolato di sodio 0,1%, 0,5% N-lauroylsarcosine, contenenti inibitori della proteasi) . </li><li> Quindi, preparare la sospensione per sonicazione mettendo in un bicchiere di acqua ghiacciata con l&#39;microtip di un 450 Branson Sonifier impostata tra il 50 e il 60% di ampiezza. </li><li> Sonicare la soluzione per 30 secondi una raffica costante e freddo in ghiaccio per 1 minuto. Ripetere questi impulsi 10 a 15 volte. Poi, pipetta il contenuto della provetta su e giù e trasferirli in una nuova provetta. Continuare a impulsi e raffreddare la soluzione di un ulteriore 5 volte. </li><li> A seguito di sonicazione, aggiungere il 10% Triton X-100 a 1 / 10 il volume della soluzione. Trasferire i lisati ai tubi da 1,5 ml per centrifuga, e spin i detriti in microcentrifuga. Poi trasferire il lisato cellulare in una nuova provetta. </li></ol> 4. Immunoprecipitazione della cromatina <ol><li> Prima di immunoprecipitazione della cromatina, o chip, risparmiare 50 ml di lisato cellulare come il campione di ingresso. Poi, unire il lisato cellulare cancellato con Dynabeads pre-legato all&#39;anticorpo che sono stati precedentemente preparato come descritto sopra. Roccia il composto, oltre al campione di ingresso di 50 microlitri, a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare le perline con 1 ml di tampone di lavaggio (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1mM EDTA, sodio desossicolato 0,7%, 1% NP-40). Quindi, utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante. Ripetere questa lavare 6 a 8 volte. </li><li> Eseguire un lavaggio finale con 1 ml TE-più-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Spin le perle in una microcentrifuga a 3.000 rpm per 2 minuti a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, aspirare ogni residuo di tampone TE. </li><li> Poi, aggiungere 100 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) per i campioni. Immediatamente dopo, incubare i campioni a 65 ° C per 10 a 15 minuti. Graffiare i tubi contro un rack tubo 1,5 ml ogni 2 minuti per mantenere le microsfere in sospensione. </li><li> Raccogliere le perline mediante centrifugazione e il supporto magnetico, e trasferire il surnatante in una provetta da PCR. Poi, recuperare il campione di input precedentemente salvato e aggiungere 3 volumi di tampone di eluizione. </li><li> Infine, posizionare i campioni di IP e di ingresso nel termociclatore notte a 65 ° Cinvertire la cross-legami. </li><li> Il giorno seguente, aggiungere 1 volume di tampone TE ai campioni. Quindi, aggiungere RNase A per una concentrazione finale di 0,2 mg / mL. Incubare i campioni nel termociclatore per 1 o 2 ore a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere proteinasi K alla concentrazione finale di 0,2 mg / mL. Poi, incubare campioni nel termociclatore a 55 ° C per 2 ore. </li><li> Successivamente, estrarre i campioni di una volta con un volume di fenolo. Estrarre i campioni per la seconda volta con un volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico. Infine, estrarre i campioni ancora una volta con un volume di cloroformio: alcool isoamilico. </li><li> Poi, aggiungere 30 mg di glicogeno per ogni campione. Inoltre, aggiungere NaCl ad una concentrazione finale di 0,2 volumi molari e due di etanolo ai campioni. Incubare per 30 minuti a -80 ° C. Dopo l&#39;incubazione, spin i campioni e decantare il surnatante. Lavare il pellet con 500 ml di etanolo 75%. Poi, asciugare il pellet e li risospendere in 40 ml di acqua. </li><li> Per controllare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di sonicazione, carico 5 mg del campione in ingresso purificato in un gel di agarosio 1,8% ed eseguire il gel. La procedura di sonicazione dovrebbe produrre frammenti nel range di 150-350 paia di basi. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere regolata variando il numero di scoppi e l&#39;ampiezza. </li><li> Per controllare la robustezza e la specificità di ChIP, l&#39;arricchimento nelle regioni di controllo vincolanti eseguendo gene-specifico PCR con 1 ml di campioni IP e una serie di diluizioni del campione in ingresso. Due o tre &quot;legato&quot; le regioni e una regione controllo non associato devono essere selezionati in modo da testare la qualità dei campioni di IP e di ingresso. </li></ol> 5. Amplificazione del DNA genomico <ol><li> A partire con 34 ml di campione IP o 200 ng di campione di input, effettuare la riparazione fine, &#39;A&#39; aggiunta la coda e la legatura di adattatori per frammenti di DNA utilizzando DNA genomico Sample Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li><li> Purificare il DNA con un MinElute PCR Purification Kit e poi eluire nel buffer EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) che è stato pre-riscaldato a 50 ° C. Ad esempio, utilizzare 23 microlitri e 46 microlitri per l&#39;eluizione finale di IP e di campioni di DNA di ingresso, rispettivamente. </li><li> Fai la reazione di PCR utilizzando 23 ml di DNA con adattatori, e 25 microlitri DNA polimerasi Phusion dal kit, 1 ml di 20 mM Sol_PCR_1 e 1 ml di 20 mM Sol_PCR_2. Eseguire la reazione di PCR come segue: 1) 30 secondi a 98 ° C; 2) 10 secondi a 98 ° C; 3) 30 secondi a 65 ° C; 4) 30 secondi a 72 ° C, ripetendo i passaggi passo 2-4 18 volte e poi 5 minuti a 72 ° C, infine, tenendo a 4 ° C. </li><li> A seguito di amplificazione PCR, purificare il DNA con il kit di purificazione QIAGEN MinElute PCR. Preriscaldare 15 ml di tampone EB a 50 ° C ed eluire il DNA. Diluire 0,5 ml di campione 1:4 e di eseguire una lettura NanoDrop. </li></ol> 6. Purificazione gel di prodotti amplificati <ol><li> Per purificare i prodotti amplificati, preparare un gel di agarosio 1,8% di 50 ml utilizzando HPLC acqua. Aggiungi TAE e bromuro di etidio dopo l&#39;agarosio si è sciolto. Poi, versare il gel. Caricare il gel dopo l&#39;aggiunta di 4 ml di tampone di caricamento per l&#39;ingresso e campioni IP. Quindi, eseguire il gel a 120 volt per 45 minuti. </li><li> Analizzare il gel dopo la sua esecuzione. Il gel dovrebbe rivelare che i frammenti della gamma sono prodotti tra 150 e 350 paia di basi. Essi rappresentano frammenti di DNA genomico tra 50 e 250 paia di basi di lunghezza e un adattatore. </li><li> Accise della regione di gel contenente il materiale nella 350 150 serie di coppie di basi con un bisturi. Fate attenzione a non asportare l&#39;adattatore adattatore fascia, che corre a circa 120 paia di basi. Recuperare il DNA utilizzando un kit di Gel QIAquick estrazione secondo le istruzioni del produttore. In particolare, utilizzare una colonna del kit di estrazione Gel QIAquick per una fetta di gel di 400 mg o meno. Per iniziare il processo di estrazione, aggiungere 3 volumi di tampone QG di 1 volume di gel. Aggiungere 1 volume di isopropanolo e caricare il composto sulla colonna. L&#39;uso 0,5 ml di QG per lavare la colonna, seguita da procedura standard descritta in kit manuale. Usare H 2 O pre-riscaldato a 50 ° C per eluire il DNA. Incubare la colonna con 30 ml di H 2 O per 5 minuti a 37 ° C prima della filatura verso il basso. </li><li> Secco il campione fino a 11 microlitri con precisione in un Speedvac senza calore. Togliere 1 ml di campione e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. </li><li> Infine, identificare i prodotti genici arricchito usando il AnalyzerIIe Illumina genoma come descritto in <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. L&#39;obiettivo generale del seguente esperimento è quello di identificare bersagli genomici di KDM5A/JARID1A/RBP2 demetilasi istoni. (P1) Questo risultato è ottenuto dalla preparazione di cross-linked cromatina che è sonicato per la produzione di frammenti di DNA di dimensioni adeguate. (P2) In una seconda fase, RBP2 frammenti di DNA legato RBP2 sono immunoprecipitati con anticorpi. (P3) Successivamente, i frammenti di DNA recuperato vengono riparati alle estremità e gli adattatori sono legatura alle estremità del DNA genomico per preparare librerie di DNA genomico per l&#39;analisi sulle cellule del flusso nella stazione Cluster Illumina. Le librerie di DNA sono amplificati mediante PCR utilizzando basso numero di cicli. (P4), infine, illumina in sequenza breve legge sono unicamente allineati al genoma umano, picchi significativi sono identificati e annotati al più vicino geni in modo da identificare RBP2 regioni arricchito. (P5) i risultati sono ottenuti che mostrano le funzioni molecolari associati RBP2 geni bersaglio sulla base genoma identificazione di RBP2 regioni arricchito. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Verifica dei risultati di sonicazione cromatina Per controllare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di sonicazione, 5 mg (1 / 10) del campione in ingresso purificato è stato caricato su gel di agarosio 1,8%. Come previsto, la nostra procedura di sonicazione prodotta frammenti nel range di 150-350 bp. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere adeguato di conseguenza, variando il numero di scoppi e l&#39;ampiezza. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Purificazione gel di prodotti amplificati. I prodotti della PCR vengono eseguiti su un gel per rimuovere gli adattatori e selezionare un intervallo di dimensioni di template per la piattaforma generazione cluster. Questo gel mostra che i frammenti nel range tra 150 e 350 paia di basi sono state prodotte. Essi rappresentano frammenti di DNA genomico tra 50 e 250 paia di basi di lunghezza e un adattatore. Noi accise della regione selezionata del gel con un bisturi. Si deve prestare attenzione per evitare l&#39;adattatore adattatore fascia, che corre a circa 120 paia di basi. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Isoforma-specifici anticorpi isoforme permette di distinguere tra grandi e piccoli di RBP2. RBP2 struttura della proteina è presentata in vista del dominio. RBP2 contiene numerosi domini: il catalizzatore degli istoni demetilazione JmjC dominio e associati JmjN dominio, un dominio ARIDE capace di sequenza-specifico legame con il DNA, un dito di zinco C5HC2 che potenzialmente possono interagire con il DNA o di altre proteine, e più domini PHD. I due anti-RBP2 anticorpi che permettono di distinguere tra RBP2 isoforme sono stati ottenuti contro i RBP2 frammenti indicata da linee spesse. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Figura 5a" /> Figura 5 bis. Panoramica delle regioni RBP2 vincolante insieme dei cromosomi e geni Ensembl. Coordinate genomiche dei identificato arricchito RBP2 (tutte le isoforme e isoforma grandi) le regioni vincolanti sono presentati cromosoma saggio. Occupances di geni Ensembl (versione 54; hg18) nei cromosomi (cromosoma 10 in questa foto) si presentano come bande nere (pannello superiore). Ogni regione RBP2 legame è rappresentato come una linea verticale, in cui il pannello centrale mostra tutte le isoforme RBP2 regioni vincolante sul cromosoma 10, e il pannello inferiore mostra RBP2 regioni isoforma grandi vincolanti. La parte centrale e dei pannelli in basso danno panoramica di sovrapposizione e di occupazione specifico di RBP2 isoforme sul cromosoma 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Figura 5b" /> Figura 5b. Analisi di arricchimento funzionale di RBP2 geni bersaglio. Heatmap mostrando FDR corretto in modo significativo (p-value ≤ 0,05) arricchito GO categorie Funzione molecolare tra i geni legati (più vicini i geni per la regione RBP2 vincolante) da RBP2 (isoforme tutti e grande). Colori verso il rosso indicano alto significato statistico, giallo indica scarsa importanza statistica, e grigio indica alcuna rilevanza statistica. Analisi di arricchimento mostra le funzioni specifiche sovrapposizioni e isoforma molecolare di RBP2 geni bersaglio.

<ol>
	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Differenze funzionali tra isoforme RBP2 non sono stati determinati. Abbiamo usato un approccio globale per identificare regioni genomiche vincolato da RBP2 isoforme e definire le categorie funzionali che queste regioni rappresentano. Ciò è stato realizzato da Chip-Seq analisi seguita da analisi bioinformatica di sequenze ottenute legge. RBP2 modifica metilato residui di lisina in code degli istoni. Abbiamo scoperto che RBP2 isoforma grande contenente il modulo di riconoscimento per metilata dell&#39;istone isoforma lisina e RBP2 piccoli privi di questo modulo si legano alle diverse regioni nel genoma umano (Figura 5A). Importante, isoforma-specifici e regioni sovrapposte appartengono a geni con diverse funzioni molecolare (Figura 5B). Ad esempio, &quot;cromatina vincolante&quot; e &quot;fattore di trascrizione vincolante&quot; funzioni possono essere attribuite agli obiettivi gene di RBP2 isoforma piccola ma non di RBP2 isoforma di grandi dimensioni (Figura 5B). Confrontando gene attuale set generati per tutte le isoforme e RBP2 isoforma di grandi dimensioni (dati non riportati), si può anche definire se l&#39;isoforma di grandi dimensioni è specificamente reclutato alcuni geni.

Sequenze oligonucleotidiche 2006 Illumina, Inc. Tutti i diritti riservati. <ul><li> Sol_PCR_1 Sequenza 5&#39;-GAT AAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Sequenza 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

Reclutamento di fattori trascrizionali ed epigenetici ai loro obiettivi è un passo fondamentale nella loro regolazione. Prominente nel reclutamento sono i domini di proteine ​​che si legano a specifiche modificazioni degli istoni. Un dominio tale è la omeodominio pianta (PHD), che si trova in diversi cromatina proteine ​​leganti. Il RBP2 fattore epigenetico è più domini PHD, tuttavia, essi hanno funzioni diverse (Figura 4). In particolare, il C-terminale del dominio PHD, che si trova in una fusione RBP2 oncogeno nella leucemia umana, si lega a trimetilato lisina 4 di H3 (H3K4me3) 1. La trascrizione corrispondente alla isoforma RBP2 contenente il C-terminale PHD accumula durante la differenziazione di promonocytic, linfoma di derivazione, U937 in monociti 2. Coerentemente con due serie di dati, genoma analisi ha mostrato che in cellule U937 differenziate, la proteina RBP2 viene localizzata alle regioni genomiche altamente arricchito per H3K4me3 3. Localizzazione di RBP2 ai suoi obiettivi è correlato con una diminuzione a causa di H3K4me3 RBP2 attività demetilasi istoniche e una diminuzione dell&#39;attività trascrizionale. Al contrario, gli altri due dottorati di RBP2 non sono in grado di legare H3K4me3. In particolare, il C-terminale del dominio PHD RBP2 è assente nel RBP2 piccoli isoforma 4. È ipotizzabile che l&#39;isoforma piccolo RBP2, a cui manca l&#39;interazione con H3K4me3, differisce dalla isoforma più grande in posizione genomica. La differenza di posizione genomica di RBP2 isoforme potrebbe spiegare le diversità osservate in RBP2 funzione. In particolare, RBP2 è un giocatore fondamentale nella differenziazione cellulare mediata dalla proteina retinoblastoma (pRB). Coerentemente con questi dati, precedenti analisi genome-wide, senza distinzione tra isoforme, identificati due gruppi distinti di RBP2 geni bersaglio: 1) i geni legati da RBP2 in un modo che è indipendente dalla differenziazione; 2) i geni legati da RBP2 in una differenziazione- modo dipendente. Per identificare le differenze nella localizzazione tra le isoforme abbiamo effettuato analisi genome-wide posizione di Chip-Seq. Utilizzando anticorpi che rilevano entrambe le isoforme RBP2 abbiamo localizzato tutti RBP2 obiettivi. Inoltre abbiamo gli anticorpi che si legano solo di grandi dimensioni, e non piccolo RBP2 isoforma (Figura 4). Dopo aver identificato gli obiettivi isoforma di grandi dimensioni, si può poi sottrarre da tutte le RBP2 obiettivi per rivelare gli obiettivi della isoforma di piccole dimensioni. Questi dati mostrano il contributo della cromatina interagenti dominio nel reclutamento di proteine ​​per la sua siti di legame nel genoma.

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Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine ​​che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Views.  University of Illinois Chicago - UIC. Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine ​​che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Genoma Analisi dei Aminoacylation (carica) I livelli di tRNA usando i microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel bayesiano Cambia punto di Algoritmo per Genome-wide analisi di diversi tipi di dati ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

DNA purificato per affinità Chip (DAP-chip) metodo per determinare obiettivi del gene per batterica, due sistemi di regolamentazione dei componenti

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).