Ringraziamo Anne de Jong e Sigieri Holsappel aiuto per la produzione slitta DNA microarray. Il supporto di Anne de Jong per l&#39;analisi bioinformatica è anche apprezzato. Ringraziamo anche Jelle Slager per la revisione della carta. Muhammad Afzal e Irfan Manzoor sono supportati dall&#39;Università GC, Faisalabad, Pakistan nell&#39;ambito del programma di sviluppo della facoltà di HEC Pakistan.

1. Preparazione di Media e Cultura cellulare <ol><li> Grow S. pneumoniae D39 ceppo selvatico 21 come descritto in precedenza 11. Inoculare cellule stoccati a -80 ° C in 10% glicerolo (con rapporto di 1/100 in 50 ml provette sterili) in 50 ml chimica definita Medium (CDM) con un pH finale di 6,4 15, ma omettere L-serina dal amminoacido miscela. Nota: sono stati utilizzati due diversi CDM; uno contenente una concentrazione minima di L-serina (150 mM) e l&#39;altra contenente una concentrazione massima di L-serina (10 mM). Questa concentrazione minima è fondamentalmente la concentrazione di L-serina nel plasma del sangue umano e l&#39;obiettivo è quello di confrontare l&#39;espressione genica di S. pneumoniae ceppo D39 in queste due condizioni. </li></ol> 2. Isolamento di RNA totale <ol><li> Materiale <ol><li> Utilizzare fenolo acido, grado RNA per l&#39;isolamento di RNA totale. </li><li> Macaloid: <ol><li> Sospendere 2 grammi dimacaloid in 100 ml TE e far bollire per 5 min. Raffreddare a RT e sonicare fino macaloid gels.Centrifuge la soluzione a 2.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, risospendere in 50 ml TE pH 8 e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Soluzioni: <ol><li> Trattare tutte le soluzioni con etere pirocarbonato (DEPC). Aggiungere 100 microlitri DEPC / 100 ml di soluzione, incubare O / N a 37 ° C e autoclave per 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> Metodologia <ol><li> Crescere 50 ml di S. coltura cellulare pneumoniae D39 in 50 ml provette a 37 ° C (senza scuotimento) fino a metà fase esponenziale (OD ~ 0,3). Culture centrifugare a 4 ° C su 10.000 × g per 2 minuti. Eliminare i media e congelare immediatamente il pellet di cellule in azoto liquido. </li><li> Premix 300 ml di cloroformio: IAA (24: 1) e 300 ml di fenolo (fenolo acido, grado RNA). Utilizzare 500 microlitri della fase organica nel passaggio 2.2.3. </li><li> Preparare la seguente miscela in anticipo in tubi con tappo a vite senza RNA: 0.5 G perle di vetro, 50 ml 10% SDS, 500 microlitri fenolo / cloroformio: IAA (come preparato al punto 2.2.2), strato macaloid (150-175 ml, non è esatto in quanto è molto viscoso). Risospendere il pellet di cellule in 400 microlitri TE (DEPC) e aggiungere le cellule risospese nei tubi con tappo a vite. </li><li> Per rompere le cellule, posizionare i tubi con tappo a vite in un battitore tallone per impulsi 2x 60 &quot;(&#39;omogeneizzare&#39;) con 1 min intervallo in ghiaccio. Centrifugare i campioni per 10 min a 10.000 xg (4 ° C). </li><li> Trasferire la fase superiore in una nuova provetta, aggiungere 500 microlitri di cloroformio: IAA (24: 1) e centrifugare per 5 min a 10.000 xg (4 ° C). </li><li> Trasferire 500 microlitri della fase superiore ai tubi freschi, aggiungere 2 volumi (1 ml) di lisi / tampone di legame e mescolare pipettando su e giù. Isolare RNA totale utilizzando il kit di isolamento dell&#39;RNA e seguire il produttore protocollo raccomandato. </li></ol></li></ol> 3. RNA Cleanup &lt;<html> ol&gt; <li> Per rimuovere la contaminazione del DNA da RNA totale, aggiungere 100 microlitri mix DNAseI (buffer DNAse 90 microlitri e 10μl DNAseI) e incubare per 20-30 minuti a 15-25 ºC. </li><li> Lavare pulito RNA utilizzando il kit RNAse. Ottenere 50 ml di volume di eluizione. </li></ol> 4. Analisi di RNA <ol><li> Determinare la concentrazione di RNA su uno spettrofotometro. Determinare la qualità di RNA utilizzando un test come segue (Figura 2). <ol><li> Diluire 1 ml di campione con 50 ml di acqua DEPC per ottenere una concentrazione di 20-200 ng / ml. </li><li> Usare 1 ml campione di RNA diluito per verificare la qualità sulla Bioanalyser secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Nota: un rapporto di 23S: 16S di circa 2.0 è considerata buona unità 1 A260 RNA corrispondente a 40 mg / ml.. Una quantità raccomandata per l&#39;etichettatura è 10-20 mg. </li></ol> 5. cDNA Preparazione ed etichettatura S copi &quot;&gt; NOTA: Il seguente protocollo è stato seguito per la preparazione e l&#39;etichettatura cDNA. <ol><li> Ricottura <ol><li> Eseguire reazione ricottura in 300 provette PCR microlitri, mantenendo la concentrazione di RNA totale 10-15 mg per diapositive fatti in casa o 5 mg per le diapositive made-aziendali. Mescolare RNA con 2 nonamers microlitri casuali (1,6 mg / mL) e aggiungere acqua priva di nucleasi se necessario, per mantenere il volume finale della miscela ricottura a 18 ml. </li><li> Mantenere la miscela annealing a 70 ° C per 5 min. Dopo di che, raffreddare la miscela a temperatura ambiente per 10 min (annealing) e, se necessario, centrifugare le reazioni al fondo della provetta. Mettere le provette di reazione in ghiaccio per almeno 1 min. </li></ol></li><li> Trascrizione inversa <ol><li> Preparare il mix trascrittasi inversa come segue: a 18 microlitri mix ricottura, aggiungere 12 ml mix Master (composto da 6 microlitri di buffer 5x First Strand, 3 ml 0.1 M DDT, 1,2 ml 25x AA-dUTP / nucleotide mix e 1,8 microlitri inversione transcriptase (1 ml per le diapositive made-aziendali). Tenere il mix di reazione per 2-16 ore a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Degrado di mRNA e Purificazione di cDNA <ol><li> Per degradare il mRNA dalla miscela di reazione, aggiungere 3 ml di 2,5 M NaOH e posto a 37 ° C per circa 15 min. Successivamente, aggiungere 15 ml di 2M Hepes acido libero per neutralizzare il NaOH. </li><li> Purificare la miscela cDNA utilizzando PCR colonne clean-up e seguire il protocollo del produttore. </li></ol> 7. Misura di cDNA Concentrazione <ol><li> Misurare le concentrazioni di cDNA su uno spettrofotometro. Per continuare con l&#39;etichettatura, verificare che la concentrazione di cDNA è di almeno 60 ng / ml (slides fatte in casa) o 20 ng / ml (slides made-aziendali). </li></ol> 8. Etichettatura del cDNA con Amine-reattiva Dye e Purificazione <ol><li> Utilizzare ammina reattiva tintura per etichettare il cDNA. Direttamente mescolare il cDNA con un&#39;aliquota (5 ml) diammina-reattiva tintura. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente, al buio, per 60 a 90 minuti e procedere direttamente alla purificazione di colorante marcato cDNA. Purificare cDNA dye-marcato utilizzando PCR colonne clean-up e seguendo il protocollo del produttore. Eluire cDNA in 50 ml di tampone di eluizione. </li></ol> 9. Misura di Labelled cDNA <ol><li> Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l&#39;incorporazione di coloranti ammina reattiva nel cDNA. Verificare che la concentrazione di coloranti ammina reattiva è almeno 0,5 pmol / ml in un volume totale di 50 microlitri. </li></ol> 10. La miscelazione di Labelled cDNA Campioni <ol><li> Per scivoli fatti in casa, utilizzare tutto il cDNA marcato per l&#39;ibridazione con la differenza di non più del 30% della concentrazione di cDNA. Per diapositive made-aziendali, utilizzare cDNA con non più di 2 volte differenza di concentrazione cDNA. Nota: normalmente, è necessaria circa 300 ng di cDNA per le diapositive made-società, che è molto poco rispetto al reqquantità di cDNA uired per diapositive fatti in casa. </li></ol> 11. ibridazione e di lavaggio <ol><li> Utilizzare i seguenti reagenti: acqua demineralizzata, etanolo 99%, TIMIDO Buffer (fatta in casa, con 40 microlitri lievito RNA). Preparare massimo 1 ml di SHY. </li><li> Apparecchiatura e soluzioni di preparazione <ol><li> Accendere concentratori di vuoto e di riscaldamento di almeno 1 ora prima dell&#39;essiccazione. Accendere ibridazione del forno, con set point impostato alla temperatura di ibridazione corretta (per S. pneumoniae DNA microarray, utilizzare 45 ° C). Allo stesso modo, preriscaldare cassette ibridazione e forno per 30-60 minuti. </li><li> Preriscaldare tampone SHY a 68 ° C per almeno 30 minuti. </li></ol></li><li> Preparazione del campione (contrassegnato cDNA) <ol><li> Combinare uguali quantità di cDNAs etichettati (max differenza 30%). Essiccare il campione usando i concentratori sotto vuoto ad alta temperatura (circa 40 min.) Fino a che il volume è inferiore a 7 microlitri. </li></ol></li><li> Lifter-slip <ol><li> Utilizzare pulite sollevatore-scivola.Nota: ± 30 ml possono essere caricati sulla diapositiva. </li><li> Pulire il sollevatore-scivola con sapone, un sacco di acqua di rubinetto e il 100% di etanolo. Nota: scivola sollevatore sporchi danno fondo elevato. </li><li> Asciugare il sollevatore-scivola con pistola ad aria compressa per soffiare via le particelle di polvere. Posizionare un pulito sollevatore-scivolo sulla trasparenza con il rivestimento in teflon bianco ai lati rivolti verso il basso. </li></ol></li><li> L&#39;aggiunta di tampone di ibridazione (per l&#39;etichetta cDNA) <ol><li> Sciogliere i campioni essiccati colorante in 7 ml H 2 O e incubare a 94 ° C per 2 min. </li><li> Immediatamente, aggiungere 35 microlitri preriscaldato tampone SHY (68 ° C), mescolare delicatamente e girare alla massima velocità per 1 minuto per sbarazzarsi di precipitati. Preriscaldare la sonda a 68 ° C per circa 5 minuti fino a quando il carico. </li></ol></li><li> Slide-sollevatore-slip assemblaggio e preriscaldamento. <ol><li> Collocare il supporto per ibridazione di diapositive su un calore-blocco a 50 ° C. Collocare i vetrini microarray DNA con il sollevatore-scivolo sul supporto ibridazione diapositive riscaldata e priscaldare il vetrino con sollevatore-scivolo per un minuto. Eseguire i passi successivi il più rapidamente possibile. </li><li> Aggiungere 40 ml di destinazione campione alla fine della diapositiva. Consentire il passaggio del fluido tra le superfici di vetro con la forza capillare. Eseguire tutte pipettaggio lentamente e con attenzione. </li><li> Tenere i vetrini con sollevatore-slip orizzontale in ogni momento e muoversi lentamente per assicurarsi che il sollevatore antiscivolo non si mosse. </li><li> Prendere la cassetta ibridazione preriscaldata dal forno ibridazione e chiudere la macchina. Luogo filtro di carta imbevuto con 3 ml 2x SSC (citrato salina standard) nel cassetto ibridazione. </li><li> Posizionare delicatamente il supporto per diapositive ibridazione con scivoli nel cassetto ibridazione. Chiudere la cassetta ibridazione e mettere in forno di ibridazione di nuovo (per circa 16-18 ore). </li></ol></li><li> Lavaggio diapositive <ol><li> Preparare freschi di lavaggio-buffers I, II e III (750 ml per la fase di lavaggio). Per 500 ml di wash-buffer di I, usare 2 x SSC / 0.5% SDS. Per 500 ml di wash-appassionatoer II, utilizzare 1 x SSC / 0,25% SDS. Per 500 ml lavare-buffer III, utilizzare 1 x SSC / 0.1% SDS (optional) </li><li> Posizionare i lavatoi buffer a 30 ° C (per essere sicuri SDS è sciolto). </li><li> Immergere i vetrini più rapidamente possibile, ma molto lentamente, in un tubo Falcon riempito con 50 ml di tampone di lavaggio I finché il vetro poggia sul fondo conico del tubo. </li><li> Dopo pochi secondi, quando i lavandini sollevatore scivolamento sul fondo della provetta, estrarre il vetrino con le pinzette senza graffiare la matrice e mettono nel rack della stazione di lavaggio. Continuare con il lavaggio senza intervallo di tempo. </li><li> Lavare i vetrini per 5 min in 500 ml lavare-buffer I (in una stazione di lavaggio). Dategli un secondo lavaggio per 20-30 minuti a 500 ml lavare-buffer II (in una stazione di lavaggio). Analogamente, lavare i vetrini per 5 min in 500 ml lavare-buffer III (opzionale) (in una stazione di lavaggio). </li><li> Asciugare le diapositive per 2 min a 2.000 giri. </li></ol></li></ol> 12. Microarray Analysis <ol><li> Scansione di immaginicon rispettive lunghezze d&#39;onda in scanner e salvarli in una cartella &quot;Giove Progetto&quot;. </li><li> Utilizzare software per analizzare i file scansionati inizialmente come descritto in precedenza 22. Dopo l&#39;esecuzione di questo software, selezionare la scheda &quot;Apri immagine&quot; per caricare il file di immagine rosso (-.550) come &quot;Red&quot; e file di immagine verde (-.635) come &quot;Green&quot;. Carica il file gal (.gal) con lista di array S. pneumoniae il file di immagine selezionando &quot;Load List Array&quot; scheda 22. Nota: questa lista di array composto da 48 reti, in ogni griglia c&#39;erano 16 righe e 15 colonne. Ogni posto in griglia rappresenta un singolo gene e informazioni posto compreso il nome del gene viene aggiunto attraverso un file di descrizione spot. I numeri piatte sono dati da sinistra a destra e dall&#39;alto verso il basso. </li><li> Dopo individuare accuratamente le griglie, selezionare la scheda &quot;Trova Array, Trova blocchi, Allinea Funzioni&quot; per allineare i punti. Dopo l&#39;allineamento di tutte le funzioni, analizzare l&#39;immagine selezionando l&#39;opzione &quot;Analisi&quot; tab. Creare un nuovo file con i risultati, istogramma e diagramma a dispersione. Salvare il file dalla scheda &quot;Salva risultati come&quot; come file .gpr per ulteriori analisi. </li><li> Eseguire un&#39;ulteriore normalizzazione e l&#39;elaborazione dei dati con sviluppato in-house software Microprep descritti 9. </li><li> Utilizzare repliche biologiche indipendenti per dati microarray DNA che sono dye-swap. Eseguire implementazione CyberT di una variante di t-test1 e calcolare i tassi di scoperta di falsi (FDR), come descritto 9. </li><li> Per geni differenzialmente espressi, prendere p &lt;0,001 e FDR &lt;0.05 come standard. </li><li> Carica DNA microarray dati sulla pagina di presentazione NCBI per ottenere un GEO (Gene Expression Omnibus) numero di accesso. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Descriviamo un protocollo di facile uso che può essere applicato per eseguire tutta l&#39;analisi trascrittoma di batteri. Il punto chiave su questa particolare tecnica è che la condizione in cui le cellule vengono raccolte varierà. Dopo la raccolta delle cellule e RNA isolamento, questa tecnica diventa uguale per tutti i tipi di campioni batterici e segue i passi esattamente uguali, pertanto, può essere applicato a qualsiasi tipo di coltura batterica. Il protocollo è molto semplice e conveniente e parte da isolame...

Lo studio di tutta la serie di mRNA abbondanza (trascrittoma) codificata dal genoma di un organismo unicellulare o una cellula eucariotica in un momento specifico o in una condizione specifica, tra cui sovraespressione del gene o knock-out, si chiama trascrittomica. Trascrittomica ci permette di osservare in che misura i geni sono espressi in una particolare condizione in un punto di tempo X e ci dà informazioni su come fortemente i geni sono espressi rispetto a un riferimento. Un microarray è un array bidimensionale su un supporto solido (solitamente un vetrino o silicio cella a film sottile) che può essere utilizzato per saggiare grandi quantità di materiale biologico utilizzando screening ad alto rendimento, e miniaturizzato, trasformazione multiplex e paralleli e rilevazione metodi. Microarrays sono disponibili in varie tipologie, tra cui DNA microarrays, microarrays della proteina, microarrays peptide, microarray di tessuti, microarrays dell&#39;anticorpo, microarrays cellulari e altri. Un DNA microarray èfondamentalmente un insieme di punti di DNA microscopici fissato ad una superficie solida, di solito vetro. DNA microarray sono utilizzati per misurare i livelli di espressione di un gene o di una serie di geni simultaneamente o di genotipizzare più regioni del genoma 2,3. Picomoli (10 -12 moli) di una sonda sono presenti all&#39;interno di ogni spot DNA che rappresenta una specifica sequenza di DNA, noto anche come reporter. Le molecole di mRNA etichettati dai campioni vengono chiamati gli «obiettivi». Fluorofori sono utilizzati per misurare ibridazione sonda-target e rivelazione di bersagli fluoroforo marcata determina la relativa abbondanza di sequenze di acido nucleico nel target. Un esperimento microarray può compiere più test genetici in parallelo perché un array può contenere decine di migliaia di sonde. Il layout di un esperimento microarray semplice è mostrato in figura 1. Recentemente, è stato stabilito nei nostri laboratori ed altri che queste matrici sono riutilizzabili, il che rende questa tecnica molto conveniente effective. Diverse tecniche di isolamento di RNA e di depurazione sono stati sviluppati nel corso degli anni, tra cui C-TAB, SDS e metodi GT 4-8. Inoltre, diversi kit commerciali sono inoltre disponibili. Per l&#39;espressione genica RNA di alta qualità è molto importante. Pertanto, i metodi di isolamento dell&#39;RNA vengono modificati per ottenere una quantità massima di RNA. Allo stesso modo, sono ridotti al minimo i passaggi per la preparazione cDNA e l&#39;etichettatura di cDNA. Normalizzazione dei dati dopo la scansione viene eseguita anche in modo efficiente utilizzando in-house costruita pacchetti e strumenti 9 software. Streptococcus pneumoniae è un patogeno umano Gram-positivi che colonizza il rinofaringe ed è la causa di infezioni multiple come la polmonite, la sepsi, otite media e la meningite 10. Il batterio può utilizzare un&#39;ampia varietà di nutrienti necessari per la crescita e la sopravvivenza 11,12. Numerosi studi sono stati effettuati sullametabolismo dell&#39;azoto pneumococco e regolazione sottolineando l&#39;importanza di aminoacidi e il loro ruolo nella virulenza 13,14. In questo studio, la risposta transcriptomic di S. pneumoniae alle mutevoli concentrazioni di L-serina, un acido abbondantemente presente nel plasma del sangue umano amino, è notificato mediante DNA microarray. La risposta trascrittomica di S. pneumoniae cresciuto in una concentrazione minima di L-serina (150 mM) è stato confrontato con quello coltivato in una concentrazione massima (10 mM) di serina. Mezzo chimicamente definito (CDM o terreno minimo) 15 è stato utilizzato per questo studio per controllare la concentrazione di serina. Il focus di questo studio è quello di rendere facile da usare questa tecnica e di fornire diversi strumenti per la normalizzazione e l&#39;analisi dei dati. Pertanto, una serie di strumenti sono stati sviluppati per l&#39;analisi e l&#39;interpretazione dei dati. FIVA (Functional Information Viewer e Analyzer) fornisce una piattaforma per il trattamento delle informazioni contenute in gruppi di geni che hannomodelli di espressione genica simili e per la costruzione di profili funzionali 16. PROCURATORE è un altro pacchetto software che facilita l&#39;individuazione delle funzioni putativi e annotazioni di geni 17. Facendo uso di metodi di clustering, divulgare fornisce un algoritmo di rilevamento sito DNA di legame. Motivi Cis -regulatory di geni possono essere proiettati usando questo algoritmo 18. Genome2D offre una piattaforma basata su Windows per la visualizzazione e l&#39;analisi dei dati trascrittoma offrendo diverse gamme di colori per caratterizzare i cambiamenti nei livelli di espressione genica su una mappa del genoma 19. Il webserver Pepe offre, oltre al metodo di all-in-one di analisi, una serie di strumenti per l&#39;industria mineraria per regulons, promotori e fattore di trascrizione siti di legame di 20. Annotazione completa delle regioni intergeniche in un genoma batterico può essere ottenuto utilizzando questo pacchetto. I biologi possono trarre grandi vantaggi da pepe quanto offre loro una piattaforma per la progettazione dell&#39;esperimentos in modo che le informazioni ipotizzata può essere confermata in vitro 20. Questi pacchetti software contribuiscono in modo significativo all&#39;analisi microarray come la maggior parte di loro sono liberamente disponibili e rendere la normalizzazione dei dati e di analisi molto affidabile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid phenol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche RNA isolation kit</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td></td>
			<td>105015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Boom</td>
			<td>92013505.1000.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA</td>
			<td></td>
			<td>106630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioAnalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA-dUTP</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>AM8439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDT</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Strand buffer</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-550</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-650</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHY Buffer</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H7033-125ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>RUGNE3140</td>
			<td>Speedvac concentrator plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Grant Boekel</td>
			<td>Iso-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifter-slips</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>25x60I-M-5439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>L3771-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genpix autoloader 4200A1</td>
			<td>MSD analytical technologies</td>
			<td></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>104766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

Espressione genica e la sua regolazione sono molto importanti per capire il comportamento delle cellule in condizioni diverse. Varie tecniche sono usate oggi per studiare l&#39;espressione genica, ma la maggior parte sono limitati in termini di fornire una visione globale dell&#39;espressione dell&#39;intero trascrittoma. DNA microarrays offrire una tecnologia di ricerca rapida ed economica, che offre una panoramica completa di espressione genica globale e hanno un gran numero di applicazioni, tra cui l&#39;identificazione di nuovi geni e fattori di trascrizione siti, caratterizzazione delle attività trascrizionale di cellule e vincolante anche aiutare ad analizzare migliaia di geni (in un singolo esperimento). In questo studio, sono stati ottimizzati i presupposti per l&#39;analisi del trascrittoma batterica dalla raccolta delle cellule per l&#39;analisi del DNA microarray. Tenendo conto del tempo, i costi e la precisione degli esperimenti, la piattaforma tecnologica si rivela molto utile e universalmente applicabale per studiare transcripto battericames. Qui, eseguiamo analisi del DNA microarray con Streptococcus pneumoniae come caso-studio confrontando le risposte trascrizionali di S. pneumoniae coltivate in presenza di concentrazioni variabili L-serina nel terreno. RNA totale è stato isolato mediante un metodo Macaloid utilizzando un kit di isolamento di RNA e la qualità dell&#39;RNA è stata verificata utilizzando un kit di controllo qualità dell&#39;RNA. cDNA è stato redatto utilizzando trascrittasi inversa e campioni di cDNA sono stati etichettati utilizzando uno dei due coloranti fluorescenti ammine-reattiva. DNA microarray diapositive in casa sono stati utilizzati per l&#39;ibridazione dei campioni di cDNA etichettati e dati di microarray sono stati analizzati utilizzando un framework pre-elaborazione dei dati cDNA microarray (Microprep). Infine, Cyber-T è stato utilizzato per analizzare i dati generati utilizzando Microprep per l&#39;identificazione di statisticamente significative geni differenzialmente espressi. Pacchetti software, inoltre, costruito in-house (pepe, FIVA, divulgare, MINISTERO, Genome2D) sono stati utilizzati per analizzaredati.

RNA, isolamenti e analisi di cDNA L-serina è uno degli amminoacidi essenziali e la sua concentrazione nel plasma del sangue umano varia 60-150 mM in bambini e adulti. Il suo ruolo nella biosintesi delle purine e pirimidine sottolinea la sua importanza nel metabolismo ed è un precursore di diversi aminoacidi (glicina, cisteina e triptofano). Per studiare l&#39;effetto di L-serina nel complesso trascrittoma di S. pneumoniae D39 ceppo selvatico, analisi microarray de...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un&#39;analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K Views.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

Una pipeline bioinformatica per lo studio dell'evoluzione molecolare e dell'espressione genica usando RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...