The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Questo studio è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli animali sono stati trattati secondo approvata la cura degli animali istituzionale e l&#39;uso comitato (IACUC) protocollo MO11M29 delle istituzioni mediche del Johns Hopkins. Consultare le linee guida Istituzionale cura degli animali e uso comitato per i metodi approvati di eutanasia locali. Indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza quando si maneggiano fissativi aldeide o solventi organici. 1. Preparazione dei Materiali <ol><li> Versare Piatti SYLGARD <ol><li> Seguire le istruzioni del produttore, mescolare il catalizzatore con la base, e mescolare con una bacchetta di plastica. </li><li> Deporre circa 35 ml di liquido Sylgard per 10 cm di diametro tessuto piatto di coltura. Tissue Culture piatti sono più profondo i piatti batterici standard; ciò fornisce spazio verticale per i perni di insetti. </li><li> Posizionare il dishes su una superficie orizzontale a temperatura ambiente per una notte. Bolle formatesi durante la miscelazione spariranno. </li><li> Seguendo polimerizzazione, memorizzare le piastre Sylgard a temperatura ambiente. NOTA: le piastre SYLGARD possono essere conservati a temperatura ambiente per anni e riutilizzati più volte fino a quando il Sylgard stacca dalla piastra. </li></ol></li><li> Soluzioni <ol><li> Benzil benzoato e alcool benzilico (BBBA). Mescolare 2 volumi benzile benzoato e 1 volume di alcool benzilico. Conservare al buio in una bottiglia di vetro con un tappo di vetro o teflon top. ATTENZIONE: Occasione BBBA deve essere opportunamente gestito come rifiuto solvente organico. Non permettere BBBA per contattare plastica. </li><li> Soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 4 g PFA a 80 ml di acqua, aggiungere 0,1 ml 1 N NaOH, mescolate su un piatto caldo a ~ 70 ° C per ~ 5 minuti fino a quando il PFA è completamente sciolto, quindi aggiungere 10 ml 10x PBS e portare il volume a 100 ml con acqua. ATTENZIONE: L&#39;inalazione di formaldeide / PFA e BBBA vapori dovrebbe essereminimizzato mantenendo queste soluzioni in contenitori coperti. Formaldeide / PFA è una sostanza cancerogena. </li><li> Oil Red O. Preparare uno stock di 0,5% in isopropanolo. Immediatamente prima dell&#39;uso diluire con acqua ad una concentrazione finale di 0,3% Oil Red O, quindi filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron. </li></ol></li></ol> 2. Dissezione pelle, Fissazione, e Clearing <ol><li> Dorsale pelle per Immunostaining e Melanina Imaging <ol><li> Per i più giovani topi (ad esempio, feti e giorno postnatale (PUP P) 0-P3), eutanasia il mouse per inalazione isoflurano. Euthanize topi più anziani per inalazione isoflurano o per iniezione ketamina / xylazina seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Rimuovere i capelli con un rasoio elettrico e gel per capelli rimozione. Per i topi di età inferiore P8, questo passaggio può essere saltato. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per fare un taglio orizzontale dalla base della coda lungo ogni fianco, passando sul lato dorsale della base di ciascun arto, procedendo laterale alle orecchie e finezione al naso. </li><li> Buccia delicatamente la pelle dal procedimento tessuto sottostante da posteriore ad anteriore mantenendo la pelle tra le dita guantate in modo che non venga pizzicato dalla pinza. Staccando la pelle a livello delle orecchie, tagliare le orecchie con un paio di forbici e procedere lentamente soprattutto come la pelle può strappare in questa posizione. </li><li> Da questo punto in poi, orientare la pelle con la parte interna rivolta verso l&#39;alto. Appunta la pelle per Sylgard con ~ 20 vie di insetti distribuiti uniformemente attorno alla periferia; non più di-tendere la pelle (Figura 2B). Coprire la pelle con 10-20 ml di PBS. </li><li> Sezionare il grasso della pelle e del tessuto connettivo associato con pinze inclinate o curve con l&#39;estremità appuntita della pinza fronte orizzontalmente per minimizzare il rischio che la pinza penetrino nella pelle. Estrudere eventuali bolle d&#39;aria intrappolate sotto la pelle da dolci un applicatore con punta di cotone sulla superficie cutanea. NOTA: Se la pelle sta andandoda utilizzare per appartamento immunoistochimica montaggio o istochimica, rimuovere la maggior quantità di tessuto connettivo possibile; se la pelle sta per essere utilizzato per visualizzare follicoli piliferi basato su melanina pigmentazione, rimozione meno completa del tessuto connettivo è soddisfacente. Pelle prenatale richiede una minima &quot;pulizia&quot; del tessuto connettivo aderente. </li><li> Fissare la pelle appuntato con l&#39;aggiunta di 20 ml di preparati al momento 4% PFA / PBS o il 10% formalina tamponata per 10 cm piatto Sylgard (se verrà utilizzata la pelle di melanina imaging o della fosfatasi alcalina (AP) istochimica) o 20 ml di appena preparato 2% PFA / PBS (se verrà utilizzata la pelle di immunoistochimica o visualizzare transgenico cheratina (KRT) 17-GFP 11), e ruotare delicatamente durante la notte in una stanza fredda. Il giorno dopo, lavare in PBS per&gt; 10 min. NOTA: formalina standard è 37% di formaldeide; Pertanto, &quot;il 10% di formalina&quot; è del 3,7% di formaldeide. </li><li> Per AP colorazione e immunostaining, continuare al punto 3. Per melanina imaging, disidrata la pelle attraverso una serie graduata di etanolo (70%, 95%, 100%), un giorno per ogni passo, con lieve rotazione orizzontale a temperatura ambiente. Rimuovere tessuti connettivi residue. </li><li> Con la pelle in 100% di etanolo, rimuovere i perni di insetti e, se desiderato, tagliare la pelle con forbici per rimuovere il più periferica 1-2 mm di pelle con i fori dei perni. </li><li> Trasferire la pelle per un piatto di vetro 10 cm di diametro, posizionate due vetrini da microscopio di vetro sulla pelle per evitare che il curling, e aggiungere 20 ml di BBBA. BBBA indurisce rapidamente tessuto quindi è importante per la pelle per essere appiattito sotto il peso dei vetrini prima di aggiungere il BBBA. </li><li> Nel corso dei prossimi parecchie ore, sollevare le diapositive fuori la pelle per un paio di secondi per consentire alla BBBA per lavare la pelle. NOTA: Indossare guanti quando si lavora con BBBA. A seconda dell&#39;età e della pelle ci può essere fino al 30% di ritiro in BBBA. </li></ol></li><li> La pelle del piede per l&#39;Analisi del follicolo pilifero Patterning NOTA: La gamma di età tipicamente esaminati è P1-P8. <ol><li> Dopo l&#39;eutanasia, tagliare i piedi sopra la caviglia e fare un unico taglio dritto lungo la superficie ventrale attraverso le piante dei piedi. </li><li> Staccare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante, procedendo in una direzione prossimale a distale. </li><li> Tagliare le cifre per rilasciare la pelle e il pin per Sylgard con la superficie interna rivolta verso l&#39;alto (Figura 2C). C&#39;è tessuto connettivo minimo sulla pelle del piede. </li><li> Pelle transgenica Krt17-GFP è ora pronto per l&#39;imaging. Per l&#39;imaging melanina procedere con la fissazione, disidratazione e BBBA compensazione come descritto nella sezione 2.1. </li></ol></li><li> La pelle del piede per la visualizzazione ghiandole sebacee <ol><li> Dopo l&#39;eutanasia, rimuovere i capelli sfregando gel per capelli di rimozione sulla superficie cutanea con un dito guantato e il pollice; attendere per 10 min. NOTA: non utilizzare un rasoio elettrico, che danneggia la pelle delicata del piede. </li><li> Wcenere la superficie della pelle con acqua di rubinetto, sezionare e il pin la pelle a Sylgard come descritto nella sezione 2.2. </li><li> Fissare con 1% PFA / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente e poi lavare in PBS. NOTA: Per visualizzare ghiandole sebacee sui piedi, che si sviluppano dopo la prima settimana post-natale, l&#39;età ottimale per l&#39;analisi con Oil Red O è P21, perché questo segna il nadir della pigmentazione dei capelli durante il primo ciclo del capello 12, e quindi le ghiandole sebacee si può vedere più facilmente. Con i topi albino questa analisi può essere eseguita a qualsiasi età. Per ottenere albino progenie croce pigmentato topi mutanti per una linea mutante tirosinasi come C57BL/6J-Tyr c-2J. </li></ol></li><li> Preparazione Tail pelle per l&#39;analisi di melanina Distribution, Capelli follicolo Orientamento e ghiandola sebacea visualizzazione <ol><li> Dopo eutanasia, fare un taglio circolare intorno alla base della coda, e poi una fessura longitudinale che corre la lunghezza della coda lungo la faccia ventrale. </li> &lt;li&gt; Togliere la pelle coda partendo dalla punta impugnando saldamente la punta della coda-osso e / o tessuto connettivo con una coppia di pinze e la pelle con una seconda coppia di pinze. Pin la pelle coda Sylgard. </li><li> Per l&#39;analisi della distribuzione della melanina e capelli orientamento del follicolo, correggere ed elaborare la pelle come descritto nella sezione 2.1. Per l&#39;analisi delle ghiandole sebacee, tagliare la pelle coda in una serie di segmenti ~ 0,5 a 1 cm di lunghezza prima del fissaggio e incubare i pezzi di pelle in PBS / EDTA 5 mM notte a 37 ° C per indebolire il derma-epidermide adesione 13. </li><li> Staccare delicatamente l&#39;epidermide dal derma, appuntare l&#39;epidermide a Sylgard (faccia interna verso l&#39;alto), e fissare nel 4% PFA / PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS, e macchiare con Oil Red O come descritto di seguito. NOTA: Un rasoio elettrico e / o capelli gel rimozione possono essere utilizzate prima di sezionare pelle coda anziani (es. P21), ma questo trattamento è facoltativo poiché i capelli sulla coda non èdenso come altre parti del corpo. </li></ol></li></ol> 3. Reazioni colorazione <ol><li> Umano placentare fosfatasi alcalina (AP) Istochimica per visualizzare geneticamente etichettati Axon conici 10,14,15 (Figure 3A, B) <ol><li> Dopo PFA fissazione sulla Sylgard, collocare pelli fissati in un piatto di vetro da 10 cm ed immergere in PBS / 1 mM MgCl 2. Ruotare delicatamente il piatto in un bagno d&#39;acqua a 70 ° C per 90 minuti per distruggere l&#39;attività della fosfatasi endogena. </li><li> Visualizza dell&#39;attività giornalista AP istochimica con un hr incubazione 4-48 a temperatura ambiente in 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,34 mg / ml NBT, e 0,175 mcg / ml BCIP, tipicamente usando 10-15 ml di soluzione colorante per la pelle dorsale P21. Monitorare la reazione sotto il microscopio da dissezione, facendo attenzione a non lasciarlo procedere al di là del tempo ottimale, come giudicato mediante ispezione visiva delle assone colorazione intensità rispetto al aspecifica NBT deposizione. </li&gt; <li> Arrestare la reazione mediante lavaggio con tre cambi di PBS/0.1% Tween-20 nel corso di 1 ora, ri-pin bucce al Sylgard, disidratare le bucce attraverso una serie di etanolo, e poi trasferire le bucce per un piatto di 10 centimetri con BBBA. NOTA: BBBA dissolve lentamente il precipitato NBT. Durante le prime ore di BBBA, uno sfondo multa di precipitato NBT si dissolverà; come risultato, la soluzione BBBA si scurisce, e la pelle alleggerirà. Passare alla BBBA fresca dopo poche ore. </li><li> Dopo l&#39;imaging della pelle AP-tinto, trasferirlo in etanolo per&gt; 1 ora a temperatura ambiente e poi riporla in etanolo fresco a -20 ° C. Pelli AP-colorati possono essere memorizzati in questo modo per molti mesi senza perdita di segnale. </li></ol></li><li> Oil Red O di colorazione per visualizzare ghiandole sebacee 4 (Figure 3C-F) <ol><li> Rimuovere spilli insetti e trasferire il piede fisso leggera o pelli coda dalla piastra Sylgard ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale da 6 pozzetti, confino a due campioni di pelle per pozzetto. Lavare con 60:40 isopropanolo: acqua per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Colorare con 2 ml di 0,3% Oil Red O in 60:40 isopropanolo: acqua (vedere paragrafo 1.2) a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Lavare con 60:40 isopropanolo: acqua per 5 minuti a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio con acqua. Con attenzione via i bordi della pelle, compresi i fori, con forbici sottili in modo che la superficie della pelle può essere fatta più piatta possibile. </li><li> Mettere la pelle su un vetrino con la superficie esterna rivolta verso l&#39;alto, aggiungere alcune gocce di acqua o mezzo di montaggio acquoso, coprire la pelle con un vetrino, e poi il nastro delicatamente il coprioggetto al vetrino per appiattire ulteriormente la pelle. </li></ol></li><li> Appartamento Monte Immunostaining 4,16,17 (Figure 3G, H) <ol><li> Tagliate un rettangolo di pelle PFA fisso (ad esempio uno centimetri x 0,5 cm), segnando il suo orientamento con un taglio asimmetrico (ad esempio ritagliare l&#39;angolo anteriore destro). Eseguire l&#39;incubazione elavare con passaggi lieve rotazione su una piattaforma rotante orizzontale. Nei pozzetti di un 6 - o 12-pozzetti di coltura tissutale, lavata diverse volte con PBS per rimuovere residui PFA, lavare con ~ 10 cambi di PBS con 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) oltre 5-8 ore a temperatura ambiente per permeabilize la pelle. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario a 0,3% PBST con siero di capra al 5% e 20% DMSO per cinque giorni a temperatura ambiente. Coprire i pozzetti della piastra con nastro adesivo trasparente o di plastica adesivo per eliminare le perdite per evaporazione. </li><li> Lavare con 10-15 cambiamenti di 0,3% PBST oltre 5-8 ore e incubare con l&#39;anticorpo secondario in 0,3% PBST con siero di capra al 5% e 20% DMSO per 3 giorni a temperatura ambiente. </li><li> Lavare con 10-15 cambiamenti del 0,3% PBST oltre 5-8 ore. </li><li> Disidratare in 25%, 50%, e 75% di metanolo per 5 minuti ciascuna e quindi 3x in 100% di metanolo per 20 minuti ciascuno. </li><li> Pioggia in BBBA notte a temperatura ambiente. NOTA: Appartamento montare immunoistochimica della pelle più giovane~ P1 può essere eseguita come descritto sopra ma con incubazione più breve e tempi di lavaggio. Ad esempio, la pelle P1 può essere immunostained considerando un notte di incubazione in anticorpo primario e vari ore di incubazione in anticorpo secondario, e con intervenendo lavaggi di solo 2-3 ore in 0,3% PBST. Come notato sopra, le pelli più giovani sono anche sufficientemente sottili da poter essere ripreso senza BBBA compensazione. </li></ol></li><li> Visualizzazione Merkel gruppi di cellule con Nerve fluorescente Terminal Dye assorbimento (Figure 3I-L) AMI-43 (verde) e AM4-65 (rosso) sono fissabili coloranti fluorescenti che entrano cellule via non selettivo canale cationico 18. Nella pelle vivente questi coloranti vengono selettivamente assorbiti e concentrati in cellule di Merkel. <ol><li> Sciogliere 1 mg AM1-43 o AM4-65 in 2 ml di PBS e conservare in aliquote a -80 ° C. </li><li> Iniettare cuccioli appena nati per via sottocutanea con 2-10 mg colorante per grammo di peso corporeo con un ago G 29. </li><li> Un giorno dopo, eutanasia topi e diffuCT Il pelli dorsali. </li><li> Fissare le pelli in 4% PFA / PBS a 4 ° C per una notte, lavare con PBS, e montare la pelle come descritto nella sezione 3.2. </li></ol></li></ol> 4. Imaging and Image Analysis <ol><li> Imaging follicolo pilifero Orientamento (Figura 4) <ol><li> Utilizzare un microscopio da dissezione di dorsale immagine, a piedi, o pelli di coda che sono immersi in BBBA, schiacciata sotto un vetrino, e ancora nel piatto di vetro - questo approccio minimizza la contaminazione BBBA del microscopio. </li><li> Illuminare il piatto da sotto. Per minimizzare la variazione spaziale dell&#39;intensità della luce attraverso il campo di vista, elevare il piatto di vetro ad una altezza circa 10 cm sopra il piano di lavoro standard del microscopio da dissezione e posizionare un diffusore di plastica o lastra di vetro sopra la sorgente di luce. </li><li> Ritorno alla pelle di 100% etanolo per la conservazione a lungo termine a -20 ° C. NOTA: Lasciando la pelle in BBBA per più di un giorno fa sì che i granuli di melanina per rompere unparte. Una volta che la pelle è stata trattata BBBA si indurisce e rimane piatta da quel punto in avanti. Pelli differenti possono essere codificati con una serie di tacche al loro anteriore e / o posteriore termina, in modo che possano essere conservare insieme, per risparmiare spazio nel congelatore. </li></ol></li><li> Imaging and Tracing Axon conici (Figure 3A, B) <ol><li> Posizionare AP macchiato pelle (sezione 3.1.3) tra due lastre di vetro del tipo usato per i piccoli gel proteici. Evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria tra le piastre e la pelle, e quindi favorire la attentamente tutta BBBA eccesso con un tovagliolo di carta. Posizionare il panino della piastra-pelle-piatto su un palco microscopio (Figura 2D). </li><li> Utilizzare in campo chiaro o illuminazione DIC con un obiettivo 10X e 2 micron o 5 micron Z-passi. Utilizzare una fase XY meccanizzato per catturare un montaggio di immagini XY che vengono cuciti insieme per creare un unico set di dati tridimensionali in scala di grigi. NOTA: Per un unico grande pergolato assone, questo set di dati può essere uns grande come 5 Gb. </li><li> Eseguire manuale, automatico, o tracciato semi-automatizzata delle pergole assoni con qualsiasi di una varietà di pacchetti software. NOTA: Software come neuromantico (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) è uno strumento di ricostruzione neuronale gratuito che viene eseguito in un ambiente PC ed è relativamente facile da padroneggiare 10. </li></ol></li></ol>

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	<li>Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).</li><li>Lee, J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+tale+of+signaling+in+hair+follicle+development+and+cycling.">Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+organization+of+the+retina.">The neuronal organization of the retina.</a> Neuron. 76, 266-280 (2012).</li><li>Chang, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+hair+follicle-associated+structures+to+loss+of+planar+cell+polarity+signaling.">Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+and+the+developmental+control+of+cell+behavior+in+vertebrate+embryos.">Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).</li><li>Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled6+controls+hair+patterning+in+mice.">Frizzled6 controls hair patterning in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).</li><li>Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+from+disorder:+Self-organization+in+mammalian+hair+patterning.">Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).</li><li>Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+whorls+collide:+the+development+of+hair+patterns+in+frizzled+6+mutant+mice.">When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice.</a> Development. 137, 4091-4099 (2010).</li><li>Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sensory+transduction+in+the+skin.">Mechanisms of sensory transduction in the skin.</a> Nature. 445, 858-865 (2007).</li><li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling.">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, (2012).</li><li>Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+keratin+17+gene+promoter+to+visualize+live+cells+in+epithelial+appendages+of+mice.">Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice.</a> Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hair+cycle.">The hair cycle.</a> J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 30, 5241-5255 (2003).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed,+cell+type-specific+sparse+labeling+for+the+analysis+of+neuronal+morphology.">Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Devenport, D., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+polarization+in+embryonic+epidermis+orchestrates+global+asymmetric+morphogenesis+of+hair+follicles.">Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147, 1615-1627 (2011).</li><li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+senses:+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels.">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144, 577-589 (2011).</li><li>Orsini, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+preparation,+study+and+photography+of+benzyl-benzoate+cleared+material+for+embryological+studies.">Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies.</a> J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Padronanza dei metodi di dissezione sopra descritti richiede solo pazienza, una mano ferma e un paio di buoni strumenti di dissezione. La pelle dissezione dorsale è relativamente facile, ma la coda e la pelle del piede dissezioni - soprattutto in età precoce postnatale - sono più impegnativo. In età precoce prenatale (ad esempio, prima di E15), la pelle è difficile da rimuovere senza strapparla. Opportunamente, per molti studi di crescita e patterning di strutture della pelle nei topi, gli eventi di intere...

La pelle è uno dei più grandi organi del corpo, con importanti funzioni somato-sensazione, isolamento / termoregolazione e difesa immunitaria 1. Comprensione delle basi molecolari e cellulari della pelle sviluppo e la funzione è stata di interesse di lunga data per l&#39;importanza fondamentale della pelle come un sistema biologico e la sua rilevanza per dermatologia. Pelle dei mammiferi contiene una varietà di strutture multicellulari, tra cui stratificazioni di cheratinociti, il tessuto connettivo dermico, diversi tipi di follicoli piliferi, le ghiandole sebacee, muscoli erettore del pelo, vasi sanguigni, e almeno una dozzina di classi distinte di afferenti (sensoriali) ed efferenti del nervo fibre (Figura 1). Diverse regioni del corpo sono associate caratteristicamente diversi tipi di pelle. Nella maggior parte dei mammiferi, quasi tutta la superficie corporea è coperto con la pelle che è densamente compresso con follicoli piliferi. [Gli esseri umani e talpe nude costituiscono deroghe al secoloè modello.] Capelli manca dalle superfici palmari delle mani e dei piedi, che sono anche associati con modelli specializzati epidermiche (dermatoglifi), ghiandole esocrine, e le terminazioni nervose sensoriali. Gli eventi cellulari e molecolari che controllano la crescita, la differenziazione e la disposizione spaziale delle cellule all&#39;interno del follicolo pilifero sono di particolare interesse in quanto ogni follicolo mostre, in miniatura, molte delle caratteristiche centrali della organogenesi 2. Queste funzionalità includono l&#39;esistenza delle cellule staminali e una nicchia di cellule staminali, le migrazioni cellulari coreografati con precisione, e il montaggio di strutture multicellulari dai componenti embriologicamente distinte. Questo articolo descrive i metodi per la dissezione, il fissaggio, l&#39;etichettatura, e la pelle del mouse di imaging come un foglio bidimensionale intatta, indicato come un &quot;tutto il monte&quot; o &quot;flat mount&quot; di preparazione. Poiché la pelle mouse è relativamente sottile, è possibile immagine attraverso l&#39;intero spessore di sci appiattitan usando la microscopia confocale convenzionale. L&#39;approccio piatta monte all&#39;imaging pelle del mammifero è tecnicamente vantaggioso perché evita il bisogno di sezionamento fisico, consentendo in tal modo strutture da ricostruire interamente sezionamento ottico. Poiché quasi tutta la pelle viene elaborato come un singolo oggetto, il piatto di montaggio approccio facilita anche l&#39;imaging di più regioni della superficie del corpo, preservando informazioni sulla posizione e l&#39;orientamento rispetto agli assi del corpo. Infine, le strutture all&#39;interno della pelle sono tipicamente presenti nei modelli che si ripetono a intervalli regolari, facilitando così la raccolta di immagini da più rappresentanti di una data struttura. Queste caratteristiche sono familiari a neurobiologi che lavorano sulla retina, una parte bidimensionale del sistema nervoso centrale che gode di vantaggi analoghi per studi di morfologia neuronale 3. L&#39;approccio montare piatto qui descritto è di utilit specialey per lo studio delle strutture che presentano organizzazione spaziale su scala relativamente grande sul piano bidimensionale della pelle. Un esempio di grande organizzazione spaziale è la polarità coordinata dei follicoli piliferi e delle strutture follicolo-associato capelli - gruppi di cellule di Merkel, muscoli muscolo piloerettore, ghiandole sebacee, e le terminazioni nervose 4. Follicoli piliferi sono orientate ad un angolo rispetto al piano della pelle, e la componente del vettore follicolo che sia situato sul piano 2-dimensionale della pelle generalmente esibisce un orientamento rispetto agli assi del corpo che è preciso per ciascun posizione sul corpo. Ad esempio, i follicoli dei capelli sul punto di ritorno da rostrale a caudale e capelli sulla superficie dorsale dei piedi puntano da prossimale a distale. Capelli orientamento follicolo è controllato da segnali di polarità planare delle cellule (PCP, chiamato anche la polarità del tessuto 5). Questo sistema di segnalazione è stato scoperto in Drosophila dove un piccoloinsieme di geni essenziali PCP è stata trovata per controllare l&#39;orientamento di peli e cuticolare setole. Tre orthologues mammiferi di geni fondamentali PCP - omologhi frizzled 6 (Fzd6, noto anche come FZ6), caderina EGF LAG sette-pass G-recettore tipo 1 (Celsr1), e vang-like 2 (Vangl2) - svolgono ruoli analoghi in mammiferi pelle, coordinando gli orientamenti dei follicoli dei capelli con gli assi del corpo. Studi di FZ6 topi knockout (Fzd6 tm1Nat, di seguito denominato FZ6 - / -) mostrano che il difetto primario in assenza di segnalazione PCP è una randomizzazione iniziale o disorganizzazione dell&#39;orientamento follicolo pilifero, senza alcun effetto sulla struttura intrinseca dei follicoli 6-8. Un secondo sistema non-PCP agisce successivamente per favorire l&#39;allineamento locale di follicoli vicini, che porta alla produzione di grandi schemi per capelli come spirali e ciuffi. Un secondo esempio di grande scalaorganizzazione spaziale all&#39;interno della pelle è visto nelle morfologie di pergole assoni sensoriali. Neuroni sensoriali che innervano la pelle hanno i loro corpi cellulari nella radice dorsale e gangli del trigemino. Questi neuroni rilevano temperatura, dolore, prurito, e vari tipi di deformazioni meccaniche che influiscono sulla pelle e capelli 9. Essi possono essere suddivisi in sottotipi in base diametro dell&#39;assone e velocità di conduzione, struttura terminale del nervo finale, e gli schemi di espressione dei recettori, canali e altre molecole. A causa della elevata densità di innervazione all&#39;interno della pelle, analisi che coinvolgono visualizzare tutti assoni (ad esempio, immunocolorazione anti-neurofilamenti) o anche tutti assoni di una singola classe (come visto quando un singolo tipo di cellula è marcata mediante espressione di un reporter fluorescente) generalmente rivela una fitta sovrapposizione di assoni che rende impossibile definire la morfologia di un individuo Arbor. Per aggirare questo problema, abbiamo utilizzato molto radi geneticamente diretto lAbeling per produrre campioni di pelle dorsali in cui i singoli pergole assone ben isolate sono visualizzabili da espressione di un giornalista istochimica, fosfatasi alcalina placentare umano 10. Questo approccio permette la visualizzazione inequivocabile delle singole morfologie assone pergolato e una definizione dei tipi di neuroni somatosensoriali sulla base di criteri morfologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

La pelle è un tessuto altamente eterogeneo. Strutture intra-dermiche includono follicoli piliferi, i muscoli erettore del pelo, specializzazioni epidermiche (come gruppi di cellule di Merkel), ghiandole sebacee, nervi e terminazioni nervose e capillari. La disposizione spaziale di queste strutture è strettamente controllata su scala microscopica - come si è visto, ad esempio, nella disposizione ordinata di tipi cellulari all&#39;interno di un singolo follicolo pilifero - e su scala macroscopica - come visto dagli orientamenti quasi identiche di migliaia di capelli follicoli in una regione locale di pelle. Visualizzazione queste strutture senza sezionare fisicamente la pelle è possibile a causa della geometria 2-dimensionale di questo organo. In questo protocollo, dimostriamo che la pelle del mouse può essere sezionato, fisso, permeabilizzate, macchiato, e ha chiarito come un oggetto a due dimensioni intatte, un monte piatto. Il protocollo consente una facile visualizzazione delle strutture cutanee nella loro interezza attraverso l&#39;intero spessore di grandi aree di pelle optsezionamento iCal e ricostruzione. Immagini di queste strutture possono essere integrate con le informazioni sulla posizione e l&#39;orientamento rispetto agli assi del corpo.

Brightfield imaging flatmounts pelle può essere utilizzato per immagine afferenze cutanee sensoriali (Figura 3A 10) e modelli follicolo basato su melanina pigmentazione (Figura 4). Confocale di flatmounts pelle può essere utilizzato per definire la geometria di (1) gruppi di cellule Merkel, visualizzati con anti-citocheratina-6 o con AM colorante assorbimento (figure 3I-L), (2) i muscoli erettore del pelo, visualizzati con anti- actina muscolo liscio <stron...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee.

Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

flat-mount-imaging-mouse-skin-its-application-to-analysis-hair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.2K Views.  Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine.  Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee. 

Video: Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Ricerca

Neuroscienze

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...