Il lavoro è stato finanziato da UK Medical Research Council progetto di sovvenzione G0601253 di GSB e RSF e una borsa SULSA Bioskape a GSB

Questi metodi sono stati utilizzati nella ricerca riportata in Banks, RW et al. 2 I topi sono stati sacrificati umanamente per dislocazione cervicale. Nel Regno Unito, questo è un metodo legalmente approvato Schedule 1 riportate negli animali (Procedure Scientifiche) Act, 1986 e la direttiva europea 2010/63 / UE. Questa legislazione federale viene applicato localmente presso l&#39;Università di Aberdeen da parte del benessere degli animali e etica Review Board che hanno approvato tutte le procedure. 1. Orecchie Preparazione per l&#39;etichettatura <ol><li> Preparare una soluzione salina fisiologica standard, ad esempio di Liley (1956) 5 e saturare con 90% O 2/5% CO 2 (CarboGen). Salina di Liley è (mM): NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) e glucosio (11). NOTA: Per tutto il resto di questo manoscritto, &#39;saline&#39; farà riferimento alla soluzione salina che è completamente saturo di CarboGen. durante dissection, aggiornare la soluzione salina che copre la preparazione ogni 15 - 20 minuti. </li><li> Umanamente eutanasia un topo adulto senza danneggiare il cranio. NOTA: Abbiamo usato topi C57 / Bl6J e MF1, ma tutto lo sforzo del mouse può essere utilizzato. L&#39;aspetto più importante è di non utilizzare grandi adulti (&gt; 25 g). Etichettatura nei topi più grandi è meno affidabile, spesso in quanto limitato a piccoli e sparsi gruppi di follicoli. </li><li> Rimuovere le orecchie esterne (padiglioni auricolari) vicino alla base con ~ 25 cm forbici, appena sopra la linea pelo fitto, e immergere in soluzione salina in una gomma siliconica-foderato cultura / capsula di Petri (50 mm è di solito conveniente). </li><li> Posizionare la parte anteriore (concava) lato Pinna verso il basso e pin i margini per il silicone a intervalli regolari con perni sottili di insetti (~ 6 - 8 per orecchio, ~ pin 0,2 millimetri di diametro). Aggiorna saline ogni 15 - 20 minuti, o utilizzare un bagno in costante perfusione. </li><li> attenzione staccarsi la pelle posteriore dalla pelle anteriori per via smussa, inizialmente si accede dalla base del taglio della pinna soprala cartilagine centrale di spessore e lavorare in modo sistematico verso i sottili, margini esterni privi di cartilagine. <ol><li> Per fare questo, tenere il centro del bordo di taglio della pelle posteriori con un paio di n. 3 pinze. Poi, con le ganasce chiuse, posizionare i punti di un altro insieme di n. 3 pinze nel divario tra la pelle e la cartilagine sottostante. </li><li> lavorare delicatamente i punti della pinza chiusa dal lato a lato all&#39;interno della discontinuità, con la forza minima necessaria, allentare attentamente adesioni mentre peeling indietro la pelle posteriori per separare gli strati. </li></ol></li><li> Con la pelle posteriore rimossa, lascia la pelle anteriori in posizione. Pin la pelle posteriore, lato dermico up, accanto alla pelle anteriore (come da 1.5, sopra). </li><li> Successivamente, con attenzione e rimuovere completamente la cartilagine pinna che è stato inserito tra gli strati di pelle dalla pelle anterior con la stessa tecnica smussa come in 1.6. Evita di fare fori di puntura con le pinze. </li><li> Poi, fo entrambe le preparazioni della pelle Pinna delicatamente buccia, grinta e strofinare via il sottile strato di tessuto connettivo, che assomiglia polistirene espanso, che copre le basi del follicolo pilifero. NOTA: Ottenere compensazione ottimale può prendere un po &#39;di pratica; rimozione del tessuto insufficiente ostacola l&#39;accesso, sia per soluzione colorante e per l&#39;imaging, mentre raschiando troppo energicamente rimuove le reti neurali che sono alla base dei follicoli. </li><li> Aggiornare la soluzione salina. </li></ol> 2. Lanceolate Terminal Labeling NOTA: Il seguente protocollo è ottimizzato per la tintura styryl piridinio. Altri, chimicamente simili, coloranti piridinio stirilici dovrebbero lavorare, magari dopo qualche aggiustamento nella concentrazione e l&#39;incubazione di tempo. Indossare guanti e un camice da laboratorio durante la manipolazione soluzioni coloranti. O comprare 10 mM soluzione madre di colorante direttamente dal produttore o preparare magazzino sciogliendo la polvere colorante in soluzione salina, senza glucosio. Aliquota (10 ml di solito è conveniente, ma regolare questo per grande scaLe sperimentazioni) e conservare congelati per un massimo di 6 mesi a -20 ° C o ~ 1 anno a -80 ° C. Polvere memorizzerà per almeno 2 anni. Evitare ripetuti di congelamento / scongelamento di soluzioni coloranti; questo denatura rapidamente il colorante. Una volta scongelato, conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 1 settimana. <ol><li> Pre-riscaldare un bagno d&#39;acqua a 30 ° C, con una piattaforma ~ 3 - 5 mm al di sotto della superficie dell&#39;acqua. </li><li> Appena preparare 10 mM soluzione colorante styryl piridinio (10 ml di appena scongelati 10 mM colorante styryl piridinio in 10 ml di soluzione fisiologica) ed equilibrare a bagnomaria. </li><li> Pin ciascun preparato in un silicone-rivestita in gomma 35 piastre di coltura mm sommerso in 1 - 2 mm di soluzione fisiologica (volume tipico, ~ 2 ml). Ogni preparazione della pelle Pinna produrrà due preparazioni, se tagliate a metà dal vertice alla base con piccole forbici (10 - lunghezza 15 cm), per ridurre al minimo l&#39;uso degli animali. </li><li> Porre le capsule da 35 mm contenenti i preparativi Pinna saline ricoperte sulla piattaforma sommersa in C bagnomaria a 30 °. Assicurarsi che ilprofondità di acqua è sufficiente per il riscaldamento adeguata ma non contamini la soluzione salina nella vaschetta aperta. </li><li> Pin fine (0,5 - diametro esterno 1 mm) tubo con fluente O 2 / CO 2 nella base di silicone di ogni piatto a gas continuamente le preparazioni. posizionare anche in bagno d&#39;acqua 100 ml di soluzione fisiologica priva di colorante per il lavaggio / piatto rinfrescante. Utilizzare una bottiglia tappata strettamente per mantenere la saturazione CarboGen e prevenire la contaminazione dell&#39;acqua. </li><li> Equilibrare tutto a 30 ° C per 30 min quindi sostituire la soluzione salina nel corso dei preparativi Pinna da 100 ml bottiglia chiusa con tappo. Incubare altri 30 min. NOTA: Questa sostituzione compensa l&#39;evaporazione salina e di eventuali perdite di volume di massa derivanti da gas-linea di bubbling. </li><li> Versare via fisiologica priva di tintura in un bicchiere da 100 ml di rifiuti, poi rapidamente e con attenzione macchia via eventuali residui di liquido intorno alla preparazione con la carta velina per minimizzare gli effetti di diluizione sul soluzione colorante da aggiungere successivo. Fare attenzione a non toccare ( <em&gt; vale a dire, i danni) le superfici cutanee profonde esposte direttamente. </li><li> Incubare preparazioni pinna in 2 - 3 ml di 10 mM colorante styryl piridinio per 40 min a 30 ° C e poi tornare a R / T per il resto della procedura. </li><li> Rimuovere non interiorizzato colorante in tre fasi, utilizzando soluzioni in R / T. NOTA: Questi passaggi sono meglio eseguite in luce minima ambiente (tende oscuranti, arancione illuminazione intensità rosso / basso) per iniziare occhio scuro-adattamento per l&#39;imaging. <ol><li> Versare via la soluzione di etichettatura dai piatti in un bicchiere di rifiuti e lavare rapidamente in tre cambi di soluzione fisiologica priva di colorante in rapida successione. Ciò elimina la residua styryl piridinio soluzione colorante aderendo ai preparativi e qualsiasi colorante che departitions facilmente dalle membrane esposte. </li><li> Incubare in una variazione finale di soluzione fisiologica priva di tintura per altri 30 min a departition colorante più restante dalle membrane di superficie, cioè non la tintura internalizzato dai terminali. </li><li> Rimuovere colorante persistente bloccato to il foglietto esterno della membrana esposte da chelanti con solfonata b-ciclodestrina derivati ​​(Advasep-7, 1 mM, 5 min - vedi Tabella 1). Così, tutto colorante rimanente sarà all&#39;interno dei tessuti. </li></ol></li><li> Mettere in soluzione salina privo di coloranti fresca per l&#39;imaging e asciugare l&#39;esterno del piatto fondo con carta velina. NOTA: I terminali sono ora pronti per l&#39;imaging. E &#39;importante essere consapevoli del fatto che le terminazioni lanceolate sono vivi e, di conseguenza, rilasciando lentamente il colorante piridinio styryl endocitosi di nuovo. Anche se questo sarà più lento a R / T, è importante ridurre al minimo i ritardi prima / durante l&#39;imaging. Se l&#39;esperimento richiede etichettatura dei più preparati, inizialmente mantenerle tutte non marcato a 30 ° C. Saranno valida per diverse ore. Poi etichetta in sequenza a intervalli, etichettando la seconda preparazione (passi 2.7 - 2.8.3), mentre l&#39;imaging del primo. </li></ol> 3. Imaging etichetta Lanceolate Endings. NOTA: L&#39;osservatoredovrebbe essere adattata al buio per le seguenti operazioni di imaging. La maggiore acuità visiva questo permette significa livelli di luce inferiori di eccitazione sono necessari per trovare i follicoli per l&#39;imaging. Questo è più importante per minimizzare fototossicità invece di ridurre l&#39;inconveniente di photobleaching. I radicali liberi generati dai illuminazione piena intensità possono rapidamente (entro 60 sec) uccidere terminazioni nervose (GS Bewick, S. Fadul e WJ Betz, osservazioni non pubblicate) vivere. <ol><li> Prima di imaging, controllare la preparazione allo stereomicroscopio dissezione e rimuovere con cautela eventuali detriti di superficie. Questo impedisce autofluorescenza contaminare le immagini. <ol><li> Montare il piatto sul palco di un microscopio a epifluorescenza in posizione verticale con un set di filtri fluoresceina standard (480-488 nm di eccitazione, 500-520 nm di emissione per tintura piridinio styryl). </li></ol></li><li> Attenuare l&#39;intensità della luce di eccitazione con filtri a densità neutra fino appena sufficiente a localizzare comodamente terminaleS. </li><li> Individuare follicoli etichettati osservando con bassa (3.5x - 4x obiettivo secco), poi progressivamente obiettivi più elevato (obiettivo ad immersione 10x e 20x acqua) ingrandimento. </li><li> Catturare immagini di terminali lanceolate etichettati con obiettivo 10x a secco per bassa potenza e 20x obiettivi immersione acqua per ingrandimento maggiore. Ridurre al minimo l&#39;intensità e il tempo di esposizione della luce (un tempo di integrazione della fotocamera di 0,5 - 1 sec è suggerito). </li><li> Catturare immagini su una fotocamera digitale standard e salvare le immagini sul disco rigido del computer utilizzando il software proprietario. NOTA: Un tipico esempio è mostrato in Figura 1. </li><li> Immagine ~ 20 terminazioni lanceolate da ogni preparazione. Iniziare la più margine dal bordo tagliato alla base della pelle pinna e lavoro lungo questo margine di imaging ogni follicolo a turno. Lavorare attraverso leggermente sovrapposte campi parallelamente al bordo di taglio, facendo attenzione a non immagine stessa follicolo due volte e quelli che sono ovviamente danneggiati. NOTA: Ilre sono in genere troppo molti terminali lanceolate di immagine a tutti prima che si verifichi significativo spontanea de-colorazione. Così, si consiglia sistematicamente campionamento della popolazione che utilizza il seguente protocollo. </li><li> Dopo aver completato la striscia marginale, spostare un campo a larghezza verso la base della pinna, e ripetere il processo in senso inverso. </li><li> Immagine tutti i terminali incontrati, ad eccezione di quelli occasionali chiaramente orientati molto più obliquamente rispetto al piano ottico e improbabile per adattarsi completamente all&#39;interno dell&#39;analisi anulare ROI standard (vedi paragrafo 4). Non escludere lanceolates insolitamente forte o più debole rispetto ai terminali circostanti, a meno che non sono ovviamente danneggiati o intensità sfondo è particolarmente elevato, indicando danni ai tessuti localizzati. </li><li> Eliminare la preparazione se più del 10% della superficie cutanea / morsetti sono danneggiati / inutilizzabile. NOTA: Come lanceolates Decolorare con il tempo, completa di imaging ciascun preparato entro 20 minuti dalla fine del lavaggio. </li><li> iof utilizzando più di una preparazione, assicurano i confronti intensità sono validi per le preparazioni di tempo-matching. Per fare questo, compensato tempi di colorazione ogni preparazione da ~ 30 minuti, al fine di garantire la comparabilità dei tempi di de-macchia. </li><li> Per monitorare de-macchia (esocitosi), l&#39;immagine lo stesso terminale a 5 o 10 min intervalli. Con la pratica, è possibile immagine fino a 3 terminali separati per ogni punto temporale in qualsiasi preparazione. </li></ol> 4. Analisi etichetta Lanceolate Endings. Nota: La seguente procedura è un metodo rapido per l&#39;analisi intensità terminale. <ol><li> Effettuare una regione anulare di interesse (ROI) centrata sulla punta del fusto del capello alla base del follicolo (Figura 2). Impostare la circonferenza interna della ROI anulare sufficientemente elevato per evitare il fusto del capello auto-fluorescenza in ogni follicolo da analizzare ma ancora comprendere tutti la fluorescenza terminale. Assicurarsi che la circonferenza esterna è abbastanza grande da racchiudere il più grande terminAl che si possono verificare, che è orientata vicino all&#39;asse ottico / follicolo principale. </li><li> Realizzare uno sfondo ROI approssimativamente uguale nella zona a corona circolare di destinazione (quadrato o un cerchio, tipicamente ~ 400 micron 2) per determinare l&#39;intensità di colorazione locale in prossimità del terminale in analisi. Nota: Le dimensioni di queste due ROI sono impostati all&#39;inizio dell&#39;analisi e utilizzati per analizzare tutti i successivi follicoli / terminali lanceolate in tutti i preparati in qualsiasi esperimento. Quindi, è importante impostare i parametri con cura all&#39;inizio. </li><li> Posizionare il ROI di fondo abbastanza vicino al follicolo di rappresentare sfondo locali nelle ghiandole sebacee che sono alla base dei terminali, non la pelle minore intensità tra i follicoli, ma attenzione a non includere le regioni terminali. </li><li> Registrare l&#39;intensità media delle due ROI utilizzando la &#39;misura&#39; o &#39;analizzare il ROI&#39; funzione del software e di trasferire dati a un foglio di calcolo.</li><li> Nel foglio di calcolo, per ogni singolo follicolo sottrarre l&#39;intensità media di fondo locale da che l&#39;anello di dare una intensità netta. Questa regolazione per il fondo localizzata riduce notevolmente la variabilità tra-follicolo. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Bewick e Betz originariamente sviluppato la N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro-correlato coloranti styryl piridinio 7-10 per monitorare il riciclaggio locale della membrana delle vescicole sinaptiche. Dye assorbimento, e quindi un aumento della fluorescenza, riflette quindi sinaptica internalizzazione membrana delle vescicole (endocitosi). Successivamente, questo colorante interiorizzato può essere ripubblicato da ulteriori attività elettrica, mostrando la perdita di colorante monitora esternalizzazione membrana delle vescicole (esocitosi). In sinapsi, questo è un proxy per la secrezione di neurotrasmettitori. Allo stesso tempo, abbiamo anche trovato questi coloranti etichetta primarie terminazioni nervose meccanosensoriali 7. Più di recente 11, Bewick, Banche e colleghi hanno poi dimostrato che questo riflette un processo simile a maturi, terminali meccanosensoriali differenziate ex vivo. Anche in questo caso, i coloranti etichetta 50 di diametro vescicole sinaptiche nm &#39;simile&#39; (SLV) che riciclano costitutivamente al rilascio di glutammato.In terminali meccanosensoriali, a differenza dei loro omologhi sinaptiche, questo riciclaggio è soprattutto spontanea. Inoltre è modulata da meccanico, piuttosto che semplicemente elettrico, stimolazione. Per i neuroni sensoriali nella cultura e nelle cellule ciliate coclea, stirilici in generale e styryl colorante piridinio in particolare hanno dimostrato di passare attraverso i canali meccanosensoriali, bloccando i canali meccanosensoriali ed etichettatura irreversibilmente membrane interne 12. Tuttavia, a concentrazioni di colorante styryl paragonabili a terminali meccanosensoriali differenziati in situ, come qui in terminazioni lanceolate 2, o di terminazioni Ia in 11 fusi muscolari, e in cellule ciliate che non vengono stimolati meccanicamente 13, 14, l&#39;etichettatura è per endocitosi membrana. In terminazioni nervose meccanosensoriali, per esempio, l&#39;etichettatura è reversibile e non blocca le risposte meccanosensoriali alle concentrazioni utilizzate qui 2, 11, 15. Mentre alcuni colorante interiorizzazione da permeazione canale in queste terminazioni non può essere completamente escluso, il Decolorare quasi totale con latrotoxin indica la grande maggioranza della etichettatura di terminali maturi è di internalizzazione con membrana riciclo delle vescicole. Abbiamo, quindi, utilizzato questa tecnica per studiare la dipendenza di attività 11 e, più recentemente, la farmacologia 2 del riciclaggio SLV nei terminali afferenti meccanosensoriali esaminando gli effetti dei farmaci sulla assorbimento e il rilascio dei coloranti. Come con la maggior parte delle tecniche pratiche, riproducibilità richiede la ripetizione e la pratica. Alcuni dei punti chiave per assicurare l&#39;affidabilità sarà ora discusso. etichettatura Lanceolate negli animali giovani è più affidabile - l&#39;animale più piccolo abbiamo usato era 15 g di peso corporeo. Non è del tutto chiaro perché questo è il caso, ma può essere causa dissezione del tessuto connettivo minore richiede meno traumi meccanici e leaves meno restante residuo quando si rimuovono i tessuti sovrastanti lo strato di innervazione. Nel complesso, la preparazione dei tessuti è abbastanza semplice, con peeling gli strati di pelle a parte essendo l&#39;aspetto pratico tecnicamente più impegnativo e quindi solo nei topi anziani. In questi, gli strati di pelle aderiscono fortemente insieme alla base dove inizia la dissezione, ma anche qui la separazione degli strati diventa molto più facile verso i margini. Per fortuna, o forse di conseguenza, queste aree cutanee più sottili marginali di solito danno l&#39;etichettatura più soddisfacente, così come la pelle anteriori in generale. Pertanto, in particolare evitando afferrando la pelle molto sottile ai margini. Per ridurre al minimo il rischio di danni, manipolare preparati indirettamente spingendo con una pinza chiusa piuttosto che cogliere direttamente, oppure se cogliere essenziale tessuti solo più severe improbabile che sia etichettato. Essere approfondita nel rimuovere lo strato &#39;foglia di polistirene&#39; immediatamente sovrastante i follicoli, in quanto questo è il principale meostruzione meccanico di imaging e l&#39;accesso di droga. Tuttavia, è essenziale per ridurre al minimo il contatto fisico con le strutture sottostanti come questo danno (ad esempio, le strisce di distanza) le reti neurali e terminali appena sotto. Se la fluorescenza predominante è il giallo / bianco nelle ghiandole sebacee, prominente auto-fluorescenza delle basi degli alberi dei capelli e pochi mezzelune di colore arancione / giallo terminazioni lanceolate, questo indica il livello dei nervi del plesso e terminali lanceolate associati sono stati rimossi durante il gioco. Questo sembra essere il problema principale con anziani (&gt; 30 g) topi. Nel corso delle procedure di colorazione, assicurano tutto è a 30 ° C e ben ossigenate. Essere consapevoli del fatto che i terminali marcati sono ancora vivi. Di conseguenza, tintura sarà secreto dal corso spontanea (costitutiva) di rilascio esocitica. Questo sarà più lento a R / T, ma è buona norma ridurre al minimo il ritardo tra la rimozione della soluzione chelante e di imaging, per minimizzare la perdita di colorante. Inoltre, tra il-gruppi s comparativiTUDI di intensità, è essenziale garantire immagini di tutti i gruppi è tempo-abbinato. Uso di un agente colorante chelante prima di imaging migliora notevolmente contrasto dell&#39;immagine. Così, mentre relativamente costoso, il passo chelazione è molto importante per garantire una buona qualità dell&#39;immagine. uso chelante può essere minimizzata riutilizzare la soluzione più volte, e anche sul 2 - 3 giorni consecutivi, se conservati a 4 ° C tra usi. Scartare la soluzione chelante una volta che va notevolmente rosa, mostrando il suo sequestro colorante si avvicina alla saturazione. Durante l&#39;imaging, essere consapevoli del rischio di danni fototossica per questi terminali viventi, che è un risultato cumulativo sia l&#39;intensità e il tempo di esposizione della luce di eccitazione. Questa considerazione è meno importante per le immagini singolo timepoint, in cui la qualità delle immagini è la preoccupazione principale. Tuttavia, è fondamentale durante l&#39;imaging ripetuti in studi cinetica per ridurre l&#39;esposizione luce di eccitazione al minimo. Durante lo sviluppo di questi coloranti asinapsi etichetta, abbiamo trovato di eccitazione per&gt; 1 min a eccitazione illuminazione piena potenza causerà un danno drammatico e irreparabile per terminazioni nervose. In primo luogo successivamente espandono enormemente, poi collassano completamente in un periodo di ~ 15 min. Non abbiamo provato sistematicamente i contributi relativi del tempo di esposizione e intensità, ma queste osservazioni suggeriscono il principio guida dovrebbe essere quello di ridurre al minimo sia. Quindi, si raccomanda che l&#39;intensità della luce di eccitazione e durata sono il minimo commisurato con ottenere buone immagini, e le immagini di controllo appropriati sono prese in studi time corso. Per verificare che i dati non sono interessati da fototossicità in condizioni di imaging ripetuti, in ogni punto prendere un&#39;immagine aggiuntiva di un terminale in precedenza non visualizzato. Questo è quello di garantire il comportamento del etichettatura terminali ingenui assomiglia a quella nei follicoli di essere ripreso più volte. Una serie di fattori in grado di ridurre la variabilità intra-gruppo di intensità in quotaata. posizionamento accurato delle ROI, in particolare il fondo ROI, è importante, in quanto anche piccole aree di colorazione inadeguato possono influenzare notevolmente tra-follicolo variabilità dei dati. La variabilità di intensità netta è influenzata anche dal modo completamente ogni follicolo pilifero è circondato da la palizzata di terminazioni. Confronto per esempio, la forma di mezzaluna distribuzione etichettatura in Figura 1B con il pattern quasi completamente circolare visibile in figura 2. Ulteriori analisi complessa, magari utilizzando software di rilevamento automatico e thresholding, sono necessari se il grado di accerchiamento è un parametro rilevante. Si prega di notare che le distribuzioni di intensità anche per i gruppi follicolo più accuratamente analizzati non sono distribuiti normalmente (si veda la Figura 3), che richiede l&#39;uso di statistiche non parametrici per i confronti tra il trattamento di mediane di popolazione piuttosto che mezzi. tecniche di normalizzazione, per esempio esprimere intensità come percentuale of comando controlaterale, o di un gruppo di controllo costituito da diversi preparati, può essere applicato per ridurre ulteriormente la variabilità. La voce tecnica finale da considerare è il disegno sperimentale per il test farmacologici. Durante prove farmacologiche, pre-incubare il preparato in soluzione medicinale per 30 minuti prima dell&#39;applicazione tintura. Quindi, mantenere la concentrazione del farmaco nella soluzione colorante. In controlli, utilizzare soluzione fisiologica o, se il farmaco viene sciolto in un veicolo, salina più veicoli. Il presente articolo viene illustrato come questa nuova preparazione Pinna offre immagini di alta qualità di terminazioni meccanosensoriali in pelle con una minima preparazione. Mostriamo anche esso può essere utilizzato per esaminare la farmacologia dei due aspetti critici di riciclo delle vescicole. Mostriamo prima che un agonista del recettore del glutammato può aumentare colorante interiorizzazione (un marcatore di endocitosi), e in secondo luogo, che il colorante è perso di nuovo con latrotoxin (uno stimolante di esocitosi). Il significato di questo preparatione e la tecnica è che offre un ottimo accesso alla pelle terminali mechanosenory vivere in situ per gli esperimenti di imaging, offrendo opportunità uniche per il controllo ottico della funzione del terminale, la struttura e le loro interrelazioni. A quest&#39;ultimo fine, abbiamo anche sviluppato ulteriormente per l&#39;utilizzo in studi combinati ottici / elettrofisiologici (vedi articolo sorella Giove per i dettagli).

Terminazioni nervose meccanosensoriali sono tipicamente piccole, diffusamente distribuita e di difficile accesso in situ, in quanto sono di solito sepolti in profondità nella pelle o altri tessuti circostanti. Loro visualizzazione, di conseguenza, di solito richiede sezionamento seguito da un prolungato immunomarcatura / periodo di colorazione, o il ritardo e la spesa di ottenere linee del mouse con l&#39;espressione genetica di etichette fluorescenti come la proteina fluorescente verde o giallo (GFP / YFP) 1. Qui vi mostriamo un tessuto comodo e un metodo rapido e semplice per ottenere l&#39;accesso a un gran numero di afferenti follicolo pilifero per lo studio, e come possono essere rapidamente etichettato per il controllo ottico della funzione del terminale 2. Con la pratica, l&#39;intera tecnica da dissezione all&#39;imaging può essere completato in meno di 2 ore. I terminali lanceolate di assoni sensitivi che innervano i follicoli piliferi nei mammiferi formano palizzate intorno l&#39;epitelio dei capelli-follicolo, con ogniterminale inserita tra gliali cellule / Schwann processi di 2-4. Lo scopo dei morsetti è per rivelare lo spostamento meccanico dei peli che circondano. Essi sono una miscela di terminazioni rapidamente e lentamente adattando, ma prevalentemente producono brevi sequenze di attività in risposta al movimento dei capelli. Tipicamente, la cottura ferma molto rapidamente quando il movimento cessa, anche in presenza di spostamento continuato. Questo modello murino pinna per lo studio di terminali lanceolate con metodi ottici ha molte caratteristiche vantaggiose per studiare la struttura e la funzione di queste terminazioni. La pinna è prevalentemente due strati di pelle apposto back-to-back, con solo una piccola quantità di tessuto cartilagine tra. La pelle è molto sottile e facilmente sezionato causa di minime quantità di adesivo debolmente tessuto connettivo rispetto ad altre regioni del corpo. Gli strati di pelle facilmente separati, quindi, dare un buon accesso ai follicoli e terminali. l&#39;innervazioneè facilmente accessibile e identificabile. I follicoli dei capelli sono più scarsamente distribuiti che in altre regioni della pelle, facilitando la formazione immagine di individui o piccoli gruppi di follicoli. Lo strato dermico sottostante sottile dà una buona accessibilità ai coloranti e droghe farmacologiche, quindi è l&#39;ideale per l&#39;imaging mediante microscopia a fluorescenza, senza ulteriori elaborazioni. La formazione immagine di terminali marcati può essere sia di terminali viventi o, se si utilizza un analogo tintura risolvibile, dopo la fissazione e il successivo trattamento istologico. Abbiamo usato questa preparazione per dimostrare che la membrana di riciclaggio si verifica nelle terminazioni lanceolate, dimostra assorbimento (endocitosi) e il rilascio (esocitosi) di un colorante styryl piridinio (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro). Il colorante non, tuttavia, sembra etichettare in modo significativo i processi della cellula di Schwann investire 2. Abbiamo anche dimostrato che questo colorante assorbimento / rilascio, e quindi membrana reCycling, è soggetto alla modulazione glutamatergica attraverso un atipico (fosfolipasi D-coupled) dei recettori metabotropici del glutammato. I risultati di semplici protocolli di stimolazione e di analisi sono illustrati, e potenziali problemi di analisi comuni sono state evidenziate anche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1435">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PDMS - Sylgard 184</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:989px;">Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 3 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43/Synaptogreen C4</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70020</td>
			<td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advasep 7</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70029</td>
			<td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&#38; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retiga Exi Fast 1394</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Image capture and analysis software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical monitoring of living nerve terminal labeling in hair follicle lanceolate endings of the ex vivo mouse ear skin

Una tecnica dissezione e la registrazione romanzo è descritto per ottica colorazione monitoraggio e de-colorazione dei terminali lanceolate circonda i follicoli piliferi nella pelle della pinna mouse. La preparazione è semplice e relativamente veloce, ottenendo in modo affidabile vaste regioni della più unità etichettati di terminazioni nervose viventi per studiare l&#39;assorbimento e il rilascio di stirilici coloranti piridinio ampiamente utilizzati negli studi di riciclo delle vescicole. Suddividendo i preparativi prima di etichettatura permette di prova vs. confronti di controllo nello stesso orecchio da un singolo individuo. consigli utili sono dati per migliorare la qualità della preparazione, l&#39;etichettatura ei parametri di imaging. Questo nuovo sistema è adatto per saggiare farmacologicamente e l&#39;assorbimento e il rilascio di questi coloranti vitali nel terminal lanceolate sia wild-type e animali geneticamente modificati meccanicamente indotte. Esempi di influenze modulatori sulla intensità di etichettatura sono dati.

I follicoli piliferi in questa preparazione pinna sono facilmente visibili con transilluminazione senza fluorescenza (Figura 1A), illustra la natura sottilissimo del preparato e la relativa facilità di accessibilità si permette a questi terminali meccanosensoriali. Ogni è caratterizzata dalla base fusto del capello prominente perforando la falce scura della ghiandola sebacea. Sotto epifluorescenza, i terminali lanceolate etichettati circondano ogni follicolo pilifero si vedono chiaramente e mostrano il solito robusto spontanea colorante styryl assorbimento (Figura 1B). Questo avviene senza movimento imposto. I terminali lanceolate sono visti circondare il fusto del capello, anche se il grado di accerchiamento è variabile 6. Gran parte del dell&#39;etichettatura è puntata (macchie), piuttosto che la disposizione lineare che ci si potrebbe aspettare. Il pattern puntiforme riflette terminali osservati in un piano ottico lungo la lunghezza del terminale. Thipreparazione s ricevuto alcuna ulteriore elaborazione per la visualizzazione dopo etichettatura, è stato semplicemente trasferito in una fase di microscopio e ripreso in situ, che illustra ancora una volta la semplicità di questa preparazione. Esperimenti Esempio Per che questo romanzo preparazione è adatta sono mostrati in figura 3. Può essere usato per studiare sia endocitosi e esocitosi nei terminali di vita, così come la loro modulazione. Così, per endocitosi, agonisti dei recettori del glutammato può aumentare l&#39;intensità di etichettatura, mentre il blocco di Ca 2+ canali con leganti o cationi come il Mg 2+, Ni 2+ o Cd 2+ diminuisce 2. In alternativa, questa preparazione può anche essere usato per studiare la cinetica di esocitosi, come mostrato in Figura 3C. Innanzitutto, un terminale marcato è visto de-colorazione spontaneamente. Tuttavia, questo Decolorare è accelerato dalla stimolante esocitosi, latrotoxin. più decode dei risultati sperimentali possono essere visti Banks, RW et al. 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig1.jpg" /> Figura 1. robusta styryl Dye Etichettatura Registrato nel Pinna Mouse. (A), parte di una preparazione pinna senza etichetta nell&#39;illuminazione campo luminoso, che mostra come chiaramente follicoli dei capelli appaiono nelle aree liquidati del sovrastante tessuto areolare / adiposi. I, di solito bilobato, forme a mezzaluna scure sono ghiandole sebacee che circondano il fusto del capello centrale. (B) Una zona simile, ad un ingrandimento leggermente superiore e ripreso con epifluorescenza, mostrando terminazioni lanceolate etichettati con la tintura styryl. Scala bar -. 40 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi di styryl Dye Labeling intensità. (A) modello circolare tipica di etichettatura follicolo pilifero con la tintura styryl, centrata sulla fusto del capello (non visibile in questa immagine). (B) &#39;regione di interesse&#39; L&#39;analisi principale (ROI) è definita da un anello di serie sovrapposta sulla posizione del palisade di terminazioni nervose lanceolate circondano il follicolo. Questo ROI viene mantenuta costante in forma e zona per ogni singolo esperimento per garantire intensità etichettatura può essere abbastanza confrontata tra preparativi e attraverso tutti i trattamenti. Intensità netta di ogni ROI è calcolato sottraendo l&#39;intensità di una regione fondo quadrato o circolare adiacente (~ 400 micron 2). Di nuovo, questa regione fondo quadrato viene mantenuta costante in forma e l&#39;area durante ogni esperimento.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig3.jpg" /> Figura 3. Etichettatura Intensità del follicolo dei capelli afferenti Lanceloate Endings non è normalmente distribuito, e può essere utilizzato per esaminare sia endo- ed esocitosi. Dati tipici provenienti da misure di intensità colorante styryl nei terminali lanceolate spontaneamente etichettati utilizzando il metodo di analisi descritto in precedenza. (A) Intensità di etichettatura in condizioni di controllo (54 follicoli, 4 spighe) e 1 mM glutammato (42 follicoli, 4 orecchie). I valori di intensità dei singoli terminazioni vengono visualizzati come trame dot cluster. Ogni punto rappresenta l&#39;intensità di uno palisade terminale intorno un follicolo. Si noti che anche in condizioni di controllo un paio di punti di dati (follicoli) sono estremamente intense, mentre la maggior parte sono raggruppati a bassa intensità. Il primo punto in un particolare intenslità è tracciata al centro e successivi punti dati della stessa intensità sono tracciati progressivamente più lateralmente su entrambi i lati. Così, diffusione laterale rappresenta la frequenza dei follicoli di qualsiasi particolare intensità etichettatura. Le linee orizzontali rappresentano mediana interquartile ± 25%. Incubazione con 1 mM glutammato aumenta l&#39;intensità mediana ~ 50% (*** P &lt;0,001, Mann-Whitney), ma etichettatura può essere migliorata dopo 200 - 300% in alcuni terminali. (B) che dimostrano glutammato-mediata migliorato dye assorbimento (endocitosi). Incubazione del preparato follicolo pilifero in glutammato (1 mM) aumenta marcatamente styryl colorante assorbimento, come mostrato dalla maggiore intensità etichettatura. barra della scala 20 micron. (C) Enhancing rilascio di colorante (esocitosi). Dopo l&#39;etichettatura, tintura styryl viene spontaneamente rilasciato ancora una volta, come l&#39;etichettatura a 0 min è chiaramente più luminoso a 60 minuti, anche dopo la sottrazione dello sfondo per il controllo per photobleaching. Questa release è notevolmente Potentiated da latrotoxin, una vedova nera ragno veleno costituente, che innesca incontrollato esocitosi delle vescicole. Dopo 60 min di tossina, l&#39;etichettatura terminale è quasi impercettibile. Questa reversibilità di etichettatura tintura styryl supporta l&#39;ipotesi che la fluorescenza del terminale è dovuta alla internalizzazione durante il riciclaggio locale delle vescicole sinaptiche-like. Barra della scala 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

optical-monitoring-living-nerve-terminal-labeling-hair-follicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

7.4K Views.  University of Aberdeen. Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Video: Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Ricerca

Neuroscienze

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del

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