We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

NOTA: La seguente procedura sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico degli animali presso la Monash University e condotto in conformità con il Codice di condotta australiano per la cura e uso degli animali per fini scientifici (2006). Adulti di sesso femminile C57BL / 6 topi utilizzati per generare i risultati rappresentativi sono stati ottenuti dai Servizi Animal Monash. I topi sono stati alloggiati in uno specifico patogeno libero, temperatura e umidità ambiente controllata con un ciclo luce-buio 12 ore. Questi topi hanno avuto libero accesso a cibo e acqua. 1 Impostazione iniziale <ol><li> Collegare il portatile / desktop per la macchina di acquisizione dati per la registrazione tramite un cavo USB. </li><li> Collegare l&#39;amplificatore Bridge da &#39;uscita 1&#39; a &#39;ingresso 1&#39; della macchina acquisizione di dati tramite un cavo BNC. </li><li> Inserire il trasduttore di pressione in &#39;canale 1&#39; della Octal Ponte Amp. Accendere la macchina di acquisizione dati e aprire il software di analisi. Il software dovrebbe autorilevare automaticamente la configurazione apparecchiature (vedi Materiali e attrezzature tabella). </li><li> Impostazioni canale aperto presenti nella barra degli strumenti di configurazione del software. Modificare il numero di canali in fase di registrazione a 1. </li><li> Impostare il barometro per misurare la pressione in camera e l&#39;apparato colonna d&#39;acqua per calibrare l&#39;amplificatore Bridge. L&#39;apparato colonna d&#39;acqua comprende due pipette siringa da 5 ml sierologiche collegati da tubi in plastica. </li><li> Riempire le colonne con acqua e assicurano i livelli dell&#39;acqua sono equilibrati con un righello. Collegare un pezzo di tubo di plastica alla parte superiore di ogni pipetta. Figura 2 mostra la colonna d&#39;acqua impostata. </li></ol> 2 Ponte Amplificatore con calibrazione Nota: Per calibrare l&#39;amplificatore ponte un&#39;iniezione di aria nella colonna d&#39;acqua è necessaria per creare da 1 cm H 2 O deflessione. Questo si verifica in un unico insieme di condizioni e dipende apparato dell&#39;utente. Per chiarire questi passaggi demonstrate come questo laboratorio dovrebbe eseguire la calibrazione. <ol><li> Prelevare una siringa da 1 ml a 300 ml; collegare la siringa al rubinetto alla fine del tubo sul lato destro della colonna d&#39;acqua. NOTA: Assicurarsi che il rubinetto è aperto alla siringa e la colonna d&#39;acqua, e chiuse l&#39;aria ambiente. Se i livelli d&#39;acqua non sono equilibrati, a questo punto, ruotare il rubinetto in modo che sia aperto all&#39;aria ambiente e la colonna d&#39;acqua, questo riequilibrare l&#39;acqua. Il tubo sul lato sinistro della colonna d&#39;acqua deve essere collegato al trasduttore di pressione per misurare la variazione di pressione indotta immergendo la siringa. </li><li> Collegare il tubo dalla colonna d&#39;acqua sul lato sinistro al connettore sul trasduttore di pressione (anello superiore del trasduttore). </li><li> Selezionare il menu a scorrimento verso il basso trovato accanto al canale 1 nella schermata principale sul lato destro del software e selezionare &quot;amp Bridge&quot; (vedi tabella materiali e attrezzature). </li><li> Entrarele impostazioni a 5 mV, 20 Hz passa basso, barrare la casella &#39;invertito&#39; e fare clic su &#39;zero&#39;. Fare clic su &#39;zero&#39; per impostare la traccia a ~ 0 mV. Ridurre le dimensioni della finestra di 4: 1 per facilitare la visualizzazione. </li><li> Con tutto impostato, premere la siringa da 1 ml e lasciarla riposare per 3 sec. Questo mostrerà un improvviso picco sul software, perché la pressione è cambiata. Quando i 300 ml vengono premuti la pressione si sposterà l&#39;acqua nella colonna d&#39;acqua di 1 cm. Questo valore noto aiuterà calibrare l&#39;amplificatore Bridge. NOTA: L&#39;aumento della pressione nella camera a causa della depressione 300 microlitri corrisponde al valore P K utilizzato per i calcoli successivi. </li><li> Seleziona &#39;unità di ingresso&#39; trovato nell&#39;angolo inferiore sinistro della finestra di Bridge Amp. </li><li> Evidenziare la &quot;traccia di sfondo&quot; prima del picco altrimenti conosciuta come la &#39;Regione Zero&#39;. <ol><li> Fare clic sulla freccia accanto al &#39;punto 1&#39; e questo produrrà il bacsegnale kground all&#39;interno della gamma di -0.002 mV-0,002 mV (il valore sarà mai esattamente a 0 mV). </li><li> Tipo &#39;0&#39; nella finestra adiacente alla finestra segnale di fondo. </li></ol></li><li> Evidenziare il &quot;aumento della pressione della regione grafico&quot; da quando la siringa è depresso. Fare clic sulla freccia accanto al punto 2 e il valore dovrebbe essere nella gamma di 0,9-1,2 mV. <ol><li> Tipo &#39;1&#39; nella finestra accanto alla finestra &quot;aumento della pressione&quot;. Per un chiarimento visiva sui punti 2.7 e 2.8 fare riferimento alla Figura 3. Valori trovati di fuori dei limiti può indicare danni al ottale Ponte Amp. </li></ol></li><li> Vai a &#39;definire unità&#39; trovato in alto a destra della finestra e selezionare &quot;cmH 2 O&quot;. Se questa opzione non è disponibile, può essere inserito manualmente. Fare clic su OK. </li><li> Ritorna al menu &#39;Ponte Amp&#39; (vedi 2.1). Selezionare 1 mV e impostare l&#39;amplificatore a &#39;zero&#39;;. Questo completerà la calibrazione e la colonna d&#39;acqua può essere tranquillamente rimosso. </li></ol> 3. Recording funzione polmonare <ol><li> Pesare il mouse (g). NOTA: Una settimana prima valutazione fisiologica introdurre il mouse per l&#39;ambiente della camera pletismografia. Ciò sarà di aiuto nel acclimatazione e ridurre lo stress nello svolgimento di questa procedura in un secondo momento. Per uno schema generale che dimostra la configurazione UWBP, si prega di fare riferimento alla Figura 4. </li><li> Misurare la temperatura corporea con un termometro rettale. Lubrificare il termometro con vaselina prima dell&#39;inserimento. Registrare la lettura della temperatura e pulire il lubrificante fuori con l&#39;80% (v / v) di etanolo. Se si utilizza molto piccoli animali come cuccioli neonatali del mouse, il valore di temperatura corporea media può essere determinata con un termometro a infrarossi, invece. </li><li> Posizionare la / sonda di umidità relativa temperatura sulla fine di un buco della camera pletismografia. Registrare la temperatura, l&#39;umidità e barometric pressione all&#39;interno della camera pletismografia prima di mettere il mouse all&#39;interno. </li><li> Posizionare il mouse nella camera pletismografia, coprire l&#39;estremità aperta leggermente. Questo permette al mouse per acclimatarsi. Chiudere la camera. </li><li> Con la sonda di temperatura / umidità inserito nel lato della camera pletismografia con un foro, ora inserire il trasduttore e la siringa nell&#39;altro lato con i due fori. </li><li> Premere &#39;Start&#39; sul programma software e registrare per circa 15-45 sec. Record 5-10 sec di dati in cui l&#39;animale non si muove. Movimento cambierà basale fisiologia respiratoria dell&#39;animale e forniscono scarsi risultati. La respirazione dovrebbe oscillare in un percorso lineare sul programma. Questi sono dati utilizzabili. Nota: minzione o defecazione può portare ad un aumento della temperatura e l&#39;umidità all&#39;interno della camera pletismografia. Questo oscurare i risultati durante l&#39;analisi. In caso di minzione o la defecazione, interrompere la registrazione immediatamente e pulire la plcamera ethysmography con 80% (v / v) di etanolo. Fare riferimento alla Figura 6 per una rappresentazione visiva dei risultati non ottimali, in cui i dati devono essere respinte. </li><li> Dopo aver registrato per 45 secondi, premere il tasto &#39;Stop&#39; del software (vedi Materiali e attrezzature tabella) programma. Rimuovere il mouse dalla camera pletismografia e registrare immediatamente la temperatura della camera e l&#39;umidità. Non sempre registrare per più di 45 secondi in quanto ciò potrebbe sottolineare l&#39;animale. </li><li> Ritorna il mouse per sua gabbia, spray e pulire la camera con il 80% (v / v) di etanolo. </li><li> Lasciare la camera asciugare e riprendere temperatura basale e umidità prima di procedere alla prossima mouse. Ripetere i passaggi 3,1-3,9 per gli animali successive. Nota: se sono allo studio diversi animali, in modo che la temperatura della camera e il ritorno di umidità a valori basali vicino prima di ogni nuovo animale viene messo nella camera. </li></ol> 4. Pletismografia Analisi NoTE: Per calcolare i parametri respiratori come volume corrente (V T) e il volume minuto le seguenti variabili devono essere misurati: frequenza respiratoria (respiri / min), tempo di ciclo respiratorio totale (sec), inspirazione / espirazione tempo (Ti / Te, secondi) e variazione della pressione dovuta a ciascun volume corrente (P T). Figura 1 illustra le variabili che possono essere misurati da una traccia. Le seguenti operazioni utilizzano un software (vedi tabella materiali e attrezzature) per misurare queste variabili. Quando si analizzano, evitare le regioni della traccia contenente sniffing o movimento. Per ottenere risultati riproducibili, almeno 5 secondi di buona traccia respirazione è necessaria. Per un esempio di diverse tracce di respirazione riferimento alla Figura 5 e 6. <ol><li> Aprire la schermata a schermo intero, vista impostato a 1: 1 e selezionare 5 sec di dati utilizzabili. Una fotografia rappresentante di questo è mostrato in Figura 5. </li><li> Aprire la finestra data pad mini trovate all&#39;inizio della programmo nella scheda datapad. Selezionare il canale 1 e selezionare &quot;cycle&quot; nella colonna di sinistra e &#39;altezza media ciclico&#39; nella colonna di destra. <ol><li> Seleziona &#39;Opzioni&#39; e impostare la scala per il rilevamento di picco minimo di 1 (msec). Ciò consentirà il rilevamento di ogni valore di picco e diventa estremamente importante quando si utilizzano piccoli animali che producono piccole oscillazioni. </li><li> Fare clic su &#39;OK&#39;. Questo presenterà &#39;deflessione della pressione a causa di ciascun volume corrente&#39; (P T) misura. </li></ol></li><li> Nel mini pad dati, selezionare &#39;cycle&#39; seguito da &#39;conteggio degli eventi&#39; e fare clic su &#39;OK&#39;. Questo presenterà la &#39;frequenza&#39; (f) di misura. <ol><li> Frequenza deve essere convertito in respiri / min. Questo viene fatto moltiplicando il valore da 60 sec e dividendo il risultato per il tempo complessivo di registrazione (min). </li></ol></li><li> Nel mini pad dati, selezionare cy &#39;misurazioni CLE &#39;seguito da&#39; periodo &#39;e fare clic su&#39; Ok &#39;. Questo presenterà il &#39;tempo di ciclo respiratorio totale&#39; (T tot, sec) misura. </li><li> I passi successivi sono utilizzati per creare un macroinstruction per generare valori di tempo di inspirazione e di scadenza di picco. Assicurarsi che il cursore si trova direttamente sopra il massimo del picco / minimo e aggiungere un commento su 9 picchi sequenziali e bassi. Iniziare con il picco di oscillazione come mostrato in figura 5. </li><li> Successivamente, selezionare la finestra: data pad e colonna 1 Nella finestra che appare fare clic su &#39;informazione di selezione&#39; nella colonna di sinistra, &#39;durata&#39; nella colonna di destra e fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Seleziona macro trovato nella parte superiore del programma e quindi avviare la registrazione. Ora selezionare i comandi: &#39;Trova&#39;, &#39;Go&#39;, &#39;Start di File&#39; e cliccare su &#39;Cerca&#39;. </li><li> Selezione di comandi: &#39;Trova&#39; e &#39;i commenti&#39;. Digitare la stessa frase digitato per la casella di commento nella casella &#39;contenente&#39; fornito. Selezionare la scheda &#39;Seleziona per punto precedente&#39; e &#39;Cerca&#39;. </li><li> Selezione di comandi: &#39;Aggiungi al pad dati&#39;. Quindi, selezionare macro: i comandi macro e cominciare ripetere. La finestra numero di ripetizioni che appare dovrebbe essere fissato a 9. </li><li> Comando SELECT: &#39;Trova successivo&#39;. Selezionare il comando: &#39;Aggiungi al pad dati&#39;. Infine selezionare i comandi macro e fine ripetizione. <ol><li> Ora selezionare la macro e interrompere la registrazione. Salvare e denominare la macro dopo il numero degli animali. NOTA: Impostare la macro per ogni animale consente la macro da utilizzare per studi longitudinali e fa risparmiare tempo. </li></ol></li><li> La macro può ora essere eseguito per ottenere l&#39;Inspiration (T i) e scadenza (T e) tempo tra ogni commento. I dati vengono visualizzati sotto il canale 1 della datapad. Scadenza e ispirazione avviene consecutivamente ei dati appariranno in questo ordine. <ol><li> Occorre dividere manualmente in valori di inspirazione e di espirazione i dati. Calcolare la media dei quattro valori di dati di ciascun parametro per ottenere la media T i e T e. </li></ol></li><li> Una volta che i valori primari sono stati derivati ​​il volume corrente (V T, ml) può essere calcolato. Per ottenere il volume corrente viene utilizzata l&#39;equazione di Drorbaugh e Fenn 8: V T (ml) = (P T / P K) x V (K) x ((T NUCLEO (P B - P C)) / (T NUCLEO (P B - P C) - T C (P B - P CORE))) Dove V T: Volume corrente P k: flessione a causa della pressione di ogni iniezione di 1 ml (fare riferimento al punto 2.5) T di base: temperatura al cuore di ogni animale P C: pressione di vapore dell&#39;acqua a camera a temperatura X Umidità relativa in chamber T C: temperatura nella camera di animali P nucleo: Pressione alla temperatura corporea (pressione del vapore acqueo a temperatura corporea x 1.0) P t: deflessione della pressione a causa di ciascun volume corrente V k: Volume di iniezione per la calibrazione P B: pressione barometrica </li><li> Una volta che il volume corrente è stato calcolato i seguenti parametri possono essere determinate anche: <ul><li> Volume minuto (ml / min) = V T xf </li><li> Volume minuto (ml / min / kg) = (V T xf) / Peso corporeo (kg) </li><li> V T (ml / kg) = V T (ml) / Peso corporeo (kg) </li><li> Duty Cycle inspiratoria (%) = T i / T tot </li><li> Inspiratorio Portata (ml / sec) = V T / T i </li><li> Rapporto tra tempo di ispirazione per scadenza T = i / T e </li><li> Tempo di ciclo totale (sec) = tempo Inspiration (sec) + tempo di scadenza (sec) </li></ul></li></ol>

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The authors declare that they have no competing interests. The authors have no conflicts to disclose.

La tecnica qui descritta è un metodo non invasivo per la valutazione dei parametri respiratori di topi sfrenato e non anestetizzati. I punti di forza di questo protocollo sono la sua semplicità e precisione per misurare la funzione polmonare longitudinalmente con artefatti minimi. Vi sono, tuttavia, alcuni limiti e punti critici da rilevare sulla procedura. In primo luogo e soprattutto, il mouse deve mantenere la calma all&#39;interno della camera per un minimo di cinque secondi. Aggiunto lo stress interromperà il pa...

La disfunzione polmonare è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo. La condizione è caratterizzata da scambio di ossigeno insufficiente, sinonimo di tosse, dolori al petto e dispnea. Conti malattie delle vie respiratorie per ~ 10% di mortalità in tutto il mondo 1. Secondo l&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità, i tassi di mortalità sono destinate ad aumentare a causa del fumo persistente, inquinamento e sostanze irritanti professionali. UWBP è un&#39;aggiunta utile per studiare la fisiologia del polmone, che complimenta fortemente biochimica e istologica tradizionale analisi 2. Altre procedure utilizzate per la valutazione del polmone non forniscono gli stessi vantaggi UWBP. Pletismografia invasiva è una tecnica comunemente usata che richiede l&#39;animale deve essere anestetizzati 3,4 e, quindi, le misurazioni respiratorie risultanti non sono necessariamente riflettente di uno stato naturale. Inoltre, l&#39;obbligo per le sfide di ventilazione e chimiche meccaniche preclude misurazioni future 3,4.Un altro metodo di raccolta dati respiratorio è di oscillazione forzata, che è più sensibile alle variazioni dei parametri più fine respiratorie rispetto al UWBP 5. Oscillazione forzata è, tuttavia, una tecnica invasiva e richiede terminazione animale per la raccolta di dati 5-7. UWBP prevede il posizionamento di un animale all&#39;interno di una camera specializzata. Durante l&#39;inspirazione, l&#39;aria di marea è riscaldata e umidificata all&#39;interno dei polmoni crescente pressione del vapore acqueo e provoca dilatazione termica dei gas 8. Questo effetto provoca un cambiamento netto del volume d&#39;aria crea un aumento della pressione all&#39;interno della camera pletismografo 8. L&#39;opposto si verifica durante l&#39;espirazione la creazione di una forma d&#39;onda respiratoria dall&#39;animale. Analisi della forma d&#39;onda viene poi utilizzato per misurare dalla traccia respiratoria: frequenza respiratoria (respiri / min), tempo totale ciclo di respirazione (sec), inspirazione / espirazione tempo (Ti / Te, sec) e le variazioni di pressione dovute a ciascun volume corrente (P T). <strong&gt; Figura 1 illustra ogni origine misurazioni da una traccia respiratorio. Queste misure sono semplici da calcolare e più parametri respiratori possono essere derivate da queste misure. Questi parametri includono: Volume corrente (il volume di aria spostata tra inspirazione ed espirazione normale), il volume minuto (volume di gas inalato dai polmoni al minuto), inspiratorio ciclo di lavoro (la percentuale di tempo ispirazione per la durata totale del ciclo di respirazione) e flusso inspiratorio (la quantità di aria inspirata in un dato tempo). UWBP fornisce preciso, non invasivo, l&#39;analisi quantitativa della fisiologia respiratoria in modelli animali e può essere utilizzato per misurare la progressione della malattia respiratoria e la funzione polmonare 6,9. Contrariamente ad altre tecniche pletismografia, UWBP evita l&#39;uso di anestesia, restrizioni e manipolazioni invasive che producono manufatti e sperimentale variabilità 6,9. L&#39;anestesia può sopprimere la respirazione,alterare la frequenza cardiaca e può essere difficile per regolare 10. Restrizioni inducono un aumento della respirazione a causa di ulteriore stress tramite corticosterone e adrenalina rilasciano 11,13. La caratteristica fondamentale di UWBP si ripete la valutazione fisiologica che lo rende suscettibile di studi longitudinali. UWBP è fortemente raccomandato per la valutazione longitudinale della fisiologia del polmone e offre una competenza preziosa per il futuro la valutazione dei farmaci respiratori. Bleomicina, ovoalbumina, e ipossia sono stati utilizzati per indurre problemi respiratori in diversi studi e UWBP è misurato con successo polmone accurata valutazione fisiologica 7,9,13-16. Il protocollo descritto è stato progettato per topi di laboratorio adulti standard. Tuttavia, UWBP è stato adattato ad altri animali come i ratti, cavie e primati non umani 17-20. UWBP non si limita solo a valutare la disfunzione polmonare, ma è stato utilizzato anche per la valutazione della maturazione polmonare 3.La versatilità, la semplicità e la riproducibilità dei UWBP hanno stabilito una tecnica eccellente per la valutazione della funzione polmonare in animali. Software diversi (vedi tabella materiali e attrezzature) saranno tenuti a seguire questa procedura. Uno scienziato esperto sarebbe in grado di eseguire questo protocollo con il mouse all&#39;interno di 1 ora.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">LabChart 7 software (for Macintosh)</td>
			<td style="width:139px;">ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLU60/7</td>
			<td style="width:475px;">used in protocol step 4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerLab 8/30 (model ML870)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Octal Bridge Amp (model ML228)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>FE228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Black BNC to BNC cable (1m)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLAC01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Macintosh OS&#160;</td>
			<td>Apple Inc.&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:475px;">Mac OS X 10.4 or later</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Surgipack Digital Rectal Thermometer&#160;</td>
			<td>Vega Technologies</td>
			<td>MT-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Grass volumeteric pressure transducer PT5A</td>
			<td>Grass Instruments Co.</td>
			<td style="width:155px;">Model number PT5A; serial No. L302P4.</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1ml Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">5ml serological syringe pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606160</td>
			<td style="width:475px;">Connected via plastic tubing</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Balance/Scales</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>SHIMAUW220D</td>
			<td style="width:475px;">Any weighing balance with of 0.1 gram resolution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HM40 Humidity &#38; temperature meter&#160;</td>
			<td>Vaisala&#160;</td>
			<td>HM40A1AB</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Barometer</td>
			<td>Barometer World</td>
			<td>1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Laboratory tubing</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>508-101</td>
			<td style="width:475px;">Used to connect water column to the syringe and pressure transducer</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;width:263px;">Cylindrical Perspex Chamber</td>
			<td>Dynalab Corp.</td>
			<td></td>
			<td style="width:475px;">Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">80% Ethanol (4L)</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>BDH1162-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography

La disfunzione respiratoria è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo e tassi di mortalità continuano a salire. Valutazione quantitativa della funzione polmonare in modelli di roditori è uno strumento importante per lo sviluppo di future terapie. Comunemente usato tecniche di valutazione della funzione respiratoria compresa pletismografia invasiva e oscillazione forzata. Mentre queste tecniche forniscono informazioni preziose, la raccolta dei dati può essere pieno di artefatti e la variabilità sperimentale a causa della necessità di anestesia e / o strumentazione invasiva dell&#39;animale. Al contrario, sfrenato pletismografia tutto il corpo (UWBP) offre una precisa non invasivo, modo quantitativo, per cui per analizzare i parametri respiratori. Questa tecnica evita l&#39;uso di anestesia e restrizioni, che è comune alle tecniche tradizionali pletismografia. Questo video dimostrerà la procedura UWBP compresa l&#39;attrezzatura installata, calibrazione e registrazione funzione polmonare. Essospiegherà come analizzare i dati raccolti, nonché di identificare valori anomali sperimentali e manufatti derivanti dai movimenti degli animali. I parametri respiratori ottenuti con questa tecnica includono volume corrente, il volume minuto, inspiratorio duty cycle, velocità di flusso inspiratorio e il rapporto tra tempo di ispirazione per tempo di scadenza. UWBP non si basa su competenze specialistiche ed è poco costoso da eseguire. Una caratteristica fondamentale di UWBP, e più attraente per i potenziali utenti, è la capacità di eseguire misure ripetute della funzione polmonare sullo stesso animale.

Quando questa procedura è stata seguita correttamente, una traccia oscillante coerente viene creato il software di analisi dei dati. La procedura prevede una traccia respiratoria entro pochi minuti dopo la configurazione con calcoli semplici di calcolo per determinare i parametri respiratori elencati. Figura 5 rappresenta una traccia di respirazione adeguato da un controllo (sano) del mouse. Appropriato dati oscillante è prodotto quando l&#39;animale non si muove attivamente. <p class="jove_conten...

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Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

La valutazione della fisiologia respiratoria ha tradizionalmente invocato tecniche, che richiedono immobilizzazione o sedazione dell&#39;animale. Sfrenato pletismografia tutto il corpo, tuttavia, fornisce preciso, non invasivo, l&#39;analisi quantitativa della fisiologia respiratoria in modelli animali. Inoltre, la tecnica permette ripetuta valutazione respiratorie di topi consentano studi longitudinali.

Misurare funzione respiratoria nei topi mediante sfrenato Pletismografia corpo intero

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.0K Views.  Monash Institute of Medical Research.  La valutazione della fisiologia respiratoria ha tradizionalmente invocato tecniche, che richiedono immobilizzazione o sedazione dell'animale. Sfrenato pletismografia tutto il corpo, tuttavia, fornisce preciso, non invasivo, l'analisi quantitativa della fisiologia respiratoria in modelli animali. Inoltre, la tecnica permette ripetuta valutazione respiratorie di topi consentano studi longitudinali. 

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Measuring Blood Pressure in Mice using Volume Pressure Recording, a Tail-cuff Method

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume. A specially designed differential pressure transducer and an occlusion tail-cuff measure the total blood volume in the tail without the need to obtain the individual pulse signal. Special attention is afforded to the length of the occlusion cuff in order to derive the most accurate blood pressure readings. VPR can easily obtain readings on dark-skinned rodents, such as C57BL6 mice and is MRI compatible. The CODA system provides you with measurements of six (6) different blood pressure parameters; systolic and diastolic blood pressure, heart rate, mean blood pressure, tail blood flow, and tail blood volume. Measurements can be made on either awake or anesthetized mice or rats. The CODA system includes a controller, laptop computer, software, cuffs, animal holders, infrared warming pads, and an infrared thermometer. There are seven different holder sizes for mice as small as 8 grams to rats as large as 900 grams.

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. This tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume.

Misurazione della pressione sanguigna nei topi mediante pressione del volume di registrazione, una coda-bracciale Metodo

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualizzazione della funzione respiratoria mitocondriale utilizzando Citocromo C Ossidasi / succinato deidrogenasi (COX / SDH) Doppio etichettatura Istochimica

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Tutto il corpo Nanoparticelle Aerosol esposizioni inalatorie

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the clinic and the research laboratory, maximal muscular strength is widely measured longitudinally in humans, with knee extensor musculature the most reported functional outcome. Pathology of the knee extensor muscle complex is well documented in aging, orthopedic injury, disease, and disuse; knee extensor strength is closely related to functional capacity and injury risk, underscoring the importance of reliable measurement of knee extensor strength. Repeatable, in vivo assessment of knee extensor strength in pre-clinical rodent studies offers valuable functional endpoints for studies exploring osteoarthritis or knee injury. We report an in vivo and non-invasive protocol to repeatedly measure isometric peak tetanic torque of the knee extensors in mice across time. We demonstrate consistency using this novel method to measure knee extensor strength with repeated assessment in multiple mice producing similar results.

Quantification of knee extensor maximal strength is imperative to understand functional adaptations to aging, disease, injury, and rehabilitation. We present a novel method to repeatedly measure in vivo knee extension isometric peak tetanic torque.

Misurazione in vivo della funzione muscolare estensore del ginocchio nei topi

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...