Questo lavoro è stato supportato dal NIH di Grant HL093196 (RCR) e la ricerca di Atlanta e Education Foundation (AREF).

I. sensibilizzazione agli allergeni e Challenge (vedi Figura 1) A. Per la sfida intratracheale <ol><li> Per la sensibilizzazione iniziale, iniettare maschio o femmina C57BL / 6 o topi BALB / c (6-8 settimane) via intraperitoneale al giorno 0 e anche il giorno 7 con 20 mcg di ovoalbumina (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulsionato in 0,2 ml di soluzione salina tamponata fosfato sterile (PBS) contenente 2 mg di idrossido di alluminio (Sigma-Aldrich) oppure idrossido di alluminio con 2 mg in 0,2 ml di PBS sterile come controllo. </li><li> Challenge con antigene come appropriato (ad esempio, nei giorni 14, 16, 18 e 20). Procedura di sfida segue. </li><li> Anestetizzare topo con uno intraperitoneale (ip) iniezione di una miscela di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Assicurarsi che il mouse è completamente anestetizzato per almeno 10 min. </li><li> Operazione di superficie Angolo a 45 gradi o superiore. Posizionare il mouse su questa superficie mantenendo lato ventrale verso l&#39;alto e la testa in alto. </li><li> Hook thread sotto incisivi anteriori a tenere testa all&#39;indietro. Level le zampe tra di loro per garantire la trachea è diritta e nastro delle etichette per tenere le gambe. Bagnare con il sito chirurgico% EtOH 70 e tampone. </li><li> Applicare bupivicaine (da 0,1 a 0,2 ml di soluzione allo 0,25%) per via topica al sito di incisione. </li><li> Nip pelle sulla gola con una pinza e tirare delicatamente verso l&#39;esterno. Fai una piccola incisione verticale, con le forbici chirurgiche. Ridurre la dimensione di incisione. </li><li> Preparare una siringa da 1 ml con 50 microlitri di PBS o 0,1% in PBS OVA e inserirlo in una pipetta ripetitiva (Tridak Stepper, Torrington, CT). Prendere la pipetta in una mano e l&#39;altra per tenere il tessuto posteriore con le pinze ed esporre la trachea. </li><li> Tenendo la siringa come parallela alla trachea possibile, inserire l&#39;ago attraverso la trachea parete e iniettare la soluzione. </li><li> Mantenere il mouse in una iniezione verticale seguente orientamento per dare il tempo per la soluzione di stabilirsi nei polmoni. </li><li> Ferita zona delicatamente e sterilmente stretta collaborazione conpinzette e sigillare con sutura. </li><li> Luogo del mouse sterno in giù su una piastra elettrica e consentire di recuperare fino al completo ambulatoriale. Dopo il recupero, riportare il mouse al centro la cura degli animali e monitorare ogni giorno i segni di sieroma, infiammazione o infezione, e deiscenza della ferita fino a quando la ferita è completamente guarita. </li></ol> B. Per la sfida di nebulizzazione <ol><li> Sensibilizzare topi il giorno 0 mediante iniezione intraperitoneale di 20 mg di OVA (Sigma-Aldrich) emulsionato in 0,2 ml di PBS sterile contenente 2 mg di idrossido di alluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg di idrossido di alluminio in 0,2 ml di PBS sterile come controllo . </li><li> Il giorno 14, aumentare la sensibilizzazione mediante iniezione ip come descritto sopra. </li><li> Il giorno 21, 22, 23, 24 e 25 ° dopo la sensibilizzazione iniziale, topi sfida in caso di esposizione per 30 minuti per nebulizzata OVA 1% o PBS solo consegnato tramite un nebulizzatore ultrasonico (Buxco Systems Research, Wilmington, NC). </li><li> Luogo topi in camera principale del WBP; Ambientali loro all&#39;interno della camera pletismografia per almeno 10 min. </li><li> Luogo 1 ml di 0,1% in PBS sterile OVA sterile o PBS solo, come descritto nelle fasi 4-6 seguito, tramite un ampolla. Nebulizzare per 30 min. </li><li> Rimuovere ampolla e scartare qualsiasi soluzione rimanente. </li><li> Nebulizzazione può essere eseguita su tutti i topi simultaneamente utilizzando una camera di nebulizzazione. </li></ol> II. Determinazione della iperreattività bronchiale alla metacolina A. Misurazione non invasiva della iperreattività delle vie aeree da corpo intero Pletismografia (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC) <ol><li> Lasciare la bottiglia metacolina polvere riscaldare a temperatura ambiente prima dell&#39;apertura (metacolina è molto igroscopico e formare grumi inutili se lasciato assorbire acqua). Preparare un 200 mg / ml soluzione stock in PBS sterile, quindi effettuare seriali 2-diluizioni (ad esempio, 100, 50, 25, 12,5 e 60,25 mg / ml). Conservare le soluzioni a freddo. </li><li> Impostare l&#39;attrezzatura come segue: collegare ingresso principale della WBP per nebulizzatore, bias-portata in ingresso alla pompa ad aria, e la presa WBP di trappola per il gas utilizzando aderente tubo di gomma. Fissare trasduttore di pressione per colmare gli outlet delle camere principali e di riferimento della WBP. Collegare trasduttore di pressione per preamplificatore con i cavi in ​​dotazione, e collegare preamplificatore al PC utilizzando la specifica scheda di acquisizione dati. </li><li> Calibrare il preamplificatore con il software in base alle raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Luogo topi in camera principale del WBP; Ambientali loro all&#39;interno della camera pletismografia per almeno 10 min, poi letture di base dei record (Penhbase) per 3 min. </li><li> Mettere 1 ml di PBS sterile nella tazza del nebulizzatore. Nebulizzare per 2 minuti e quindi controllare le variabili respiratorie per ulteriori 6 minuti durante la fase di essiccazione. Rimuovere ampolla ed eliminare eventuali residui di PBS. </li><li> Mettere 1 ml di 6,25 mg / ml metacolina in tazza nebulizzatore e rnebulizzazione EPEAT per 2 minuti, più di 6 minuti ciclo di monitoraggio. </li><li> Ripetere la misurazione con 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml metacolina, utilizzando lo stesso periodo di 2-min nebulizzazione e 6-min ciclo di monitoraggio. </li><li> Rimuovere i topi dalle camere e tornare alle loro gabbie. </li><li> Refill nebulizzatore tazza con 1 ml di PBS sterile ed eseguire un&#39;altra sequenza di svuotare il tubo. </li><li> Arrestare i flussi d&#39;aria, smontare, pulire e asciugare tutte le camere prima di eseguire una seconda serie di animali. </li></ol> B. misurazione invasiva della reattività delle vie aeree da parte controllata da computer, Ventilatore (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canada) <ol><li> Pesare il mouse e anestetizzare da intraperitoneale (ip) iniezione di 60 mg per kg di peso corporeo di sodio pentobarbital. </li><li> A seguito di un&#39;anestesia adeguata, la posizione dei topi ventro-dorsale per tracheostomia. </li><li> Disinfettare la pelle del collo con il 70% di etanolo. Applicare bupivicaine (da 0,1 a 0,2 ml di soluzione allo 0,25%) per via topica al incision sito. Incidere e aprire la pelle del collo. Separare i muscoli del collo ed esporre la trachea. </li><li> Creare un 1 - a 2 mm un&#39;incisione nella trachea con le forbici sottili (essere certi di non recidere la trachea) e inserire il tubo tracheale con cautela. Tie una sutura intorno alla trachea per evitare una perdita d&#39;aria. </li><li> Posizionare il mouse nella camera di pletismografo corpo e collegare il tubo tracheale inserito al ventilatore. </li><li> Avviare ventilazione meccanica. Impostare la velocità appropriata respiratoria e volume corrente / stroke (150 colpi / min e 200 pl, rispettivamente per un 20-g mouse). Assicurarsi che il torace si muove in sincronia con il ventilatore. Se il mouse è &quot;lottare&quot; con il ventilatore (self-respirazione), inietti altro anestetico e attendere la sincronizzazione. </li><li> A seguito di misurazioni di base, mantenere i topi sotto ventilazione di base per altri 3 min, e poi prendere un 2 ° set di misure di impedenza. Questo 2 ° set di misurazioni di base viene utilizzata per calculate i valori basali medi. </li><li> Fornire PBS o di metacolina (MCH) sfide (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml) per flusso inspiratorio canalizzazione dal ventilatore attraverso un nebulizzatore ultrasonico. </li><li> Dopo ogni sfida con MCh (6.25, 12.5, 25, 50 e 100 mg / ml), riportare il pistone a fornire un Vt di 10 ml / kg a 120 respiri al minuto e prendere misure di impedenza. </li></ol> III. Misura di infiltrazione cellulare nello spazio aereo A. Perform lavaggio broncoalveolare (BAL) <ol><li> Dopo aver misurato il AHR, l&#39;eutanasia topi con CO 2, e posizionare ogni mouse sul suo dorso sullo schienale chirurgico. </li><li> Bagnare l&#39;area con il 70% EtOH. </li><li> Iniziando dal basso addome, tagliare aprire la cavità addominale e togliere la pelle / superiore del muscolo, spostando verso l&#39;alto verso le costole. </li><li> Una volta che le coste sono visibili, usare le forbici per perforare la membrana con attenzione. Polmoni dovesse crollare dal diaframma. Prestare particolare cacon cautela e precisione non intaccare i polmoni o il cuore. </li><li> Tagliare la gabbia toracica per esporre completamente i polmoni / cuore (evitare di tagliare i vasi sanguigni importanti per mantenere il sangue di riempire il sito). </li><li> Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 gauge (BD siringhe, Franklin Lakes, NJ), forare i ventricoli del cuore e lentamente e tirare indietro il siringa per raccogliere il sangue. Fare attenzione a non collassare il cuore. </li><li> Raccogliere il siero di questo sangue utilizzando il protocollo standard. Conservare a -70 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Tagliare pelle e dei tessuti dalla gola fino a quando la trachea viene rivelata. Sgombrare il campo da tessuto sufficiente per lavorare facilmente nel campo (ancora una volta, evitare di tagliare i principali vasi sanguigni). </li><li> Utilizzando forbici curve, tagliate sotto la trachea per cancellare un percorso. </li><li> Passare il punto di una pinza curve sotto la trachea e afferrare l&#39;estremità di un pezzo di sutura. Disegnare il filo di sutura sotto la trachea. </li><li> Legare un nodo allentato mezza circa la trachea, in basso nella gola. </li><li> Carefully tagliare una tacca, di dimensioni sufficienti per la cannula, sopra il filo di sutura. </li><li> Cautela inserire la cannula nel foro e lungo la trachea oltre il punto del filo di sutura. Premere delicatamente in avanti fino a quando la cannula emerge proprio all&#39;ingresso ai polmoni (troppo lontano: polmoni puntura, troppo brevi: il collasso della trachea durante il tentativo di recuperare BAL). </li><li> Stringere filo di sutura e il nodo completo per sigillare trachea intorno cannula. </li><li> Siringa blocco (PBS contenente 1 ml) sulla cannula, e premere delicatamente il fluido nel polmone. Lobi polmonari dovrebbe singolarmente gonfiare lentamente. Non over-fill. Per un pieno cresciuto topo 0,9-1,0 ml è il massimo assoluto. 0,8 ml può essere più sicuro. Bloccare siringa vagamente alla cannula, altrimenti è probabile che causare danni durante il tentativo di disimpegnarsi. </li><li> Ritirare liquido dai polmoni. Se si incontra resistenza (il tessuto risucchiato cannula), premere cannula lentamente ulteriormente nei polmoni e riprendere la rimozione. Provare anche a ruotare la cannula in posizione. Se tutti ELSe non riesce, ritirare il modo in cui parte cannula, la trachea è molto più probabile per crollare in questo caso. </li><li> Staccare la siringa dalla cannula, liquido BAL deposito nel contenitore, e ripetere 2 volte con soluzione fresca PBS. </li><li> Mantenere la soluzione BAL in ghiaccio fino al testacoda verso il basso. </li><li> Utilizzare il liquido BAL e siero per misurare il OVA IgE specifico usando il mouse disponibile in commercio IgE ELISA Kit (Bioproducts MD, St. Paul, MN). </li></ol> B. Conteggio di celle e determinare Differenziali <ol><li> Centrifugare il liquido BAL 5 min a ~ 600 × g, 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in PBS con delicatezza e tenere su ghiaccio. </li><li> Caricare un emocitometro standard di Neubauer con la sospensione cellulare diluita e contare le cellule. </li><li> Rimuovere aliquote di 2 × 10 4 cellule in 10-40 microlitri per il volume cytospins. Diluire le cellule se necessario. </li><li> Per cytospins, mescolare 2 × 10 4 celle, 130 microlitri PBS e 10 microlitri FBS. Aggiungi miscela cella Dople Cytospin imbuto e centrifugare 10 min a 700 giri al minuto, utilizzando cytoslides doppi per i campioni duplicati. </li><li> Lasciare i vetrini ad asciugare a temperatura ambiente per 1 ora prima della colorazione. </li><li> Colorare i vetrini utilizzando Diff-Quick macchia (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Risultati rappresentativi Eccessiva costrizione delle vie respiratorie a seguito di stimoli provocatori è una caratteristica importante di asma clinico. Descriviamo due metodi per misurare tale iperresponsività delle vie aeree alla metacolina in topi OVA sensibilizzate e contestato: l&#39;intero corpo pletismografia (Figura 2) e oscillazioni forzate utilizzando il sistema flexiVent (Figura 3). Entrambi i metodi di dimostrare che la sensibilizzazione e la sfida OVA produce iperresponsività delle vie aeree nei topi. Eosinofili ricco di infiammazione delle vie aeree è un&#39;altra caratteristica importante di asma sia clinica e malattie delle vie respiratorie allergiche nei topi. Come mostrato in figura 4 </strong&gt;, sensibilizzazione OVA e sfida aumenta notevolmente il numero totale di cellule che possono essere recuperati dalle vie aeree da BAL. Il numero di eosinofili e, in misura minore, neutrofili sono particolarmente aumentata. Le prove indicano che i risultati delle malattie allergiche delle vie aeree da sovrapproduzione di anticorpi IgE diretti contro antigeni sensibilizzanti. Sensibilizzazione e sfida con OVA utilizzando i protocolli che descrivono aumenta i livelli di IgE nel siero e fluido sia BAL di topi trattati (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Figura 1. Schema sperimentali per OVA indotta da asma allergica. Topi sono stati sensibilizzati ip due volte con 20 pg di OVA emulsionato in 2 mg di idrossido di alluminio in 0,2 ml di PBS sterile, o 2 mg di idrossido di alluminio in 0,2 ml di PBS sterile da sola, a seguito punti di tempo indicato dal contestarla con lo 0,1% o di soluzione sterile OVA PBS o da ex al giorno<html> bientale per 30 minuti a nebulizzare OVA 1% in PBS o PBS solo forniti tramite un nebulizzatore ultrasonico (Buxco). Ventiquattro ore dopo l&#39;esposizione OVA finale, la reattività delle vie aeree è stata determinata. Successivamente, BAL, campioni di sangue, cellule polmonari, e tessuti sono stati raccolti per ulteriori analisi. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Figura 2. Valutazione del allergene-indotta iperresponsività delle vie aeree con un metodo non invasivo. Topi (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l&#39;ultima sfida, iperresponsività delle vie aeree alla metacolina per via inalatoria è stata determinata utilizzando tutto il corpo pletismografia, come descritto nel protocollo. Penh è stata determinata ed espressa come rapporto tra Penh (media Penh il 8 min intervallo di tempo con metacolina Penh diviso per la media di 8 minuti con intervallo di PBS). * I, p &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Valutazione del allergene-indotta iperresponsività delle vie aeree con un metodo invasivo (oscillazioni forzate). Topi (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l&#39;ultima sfida, iperresponsività delle vie aeree a concentrazioni crescenti di metacolina per via inalatoria è stata determinata mediante l&#39;oscillazione forzata (flexiVent) metodo come descritto nel protocollo. A, B) la resistenza delle vie aeree; C) elastanza Lung. * I, p &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Figura 4. BAL conta delle cellule del liquido. Mice (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l&#39;ultima sfida, (Top) BAL cellule sono state raccolte e cellule totali sono state contate come descritto nel protocollo. (Bottom) slides Cytospin erano priparate e colorati con Diff-Quick. Tot. = cellule totali; Eos = eosinofili; Neu = neutrofili; Mac = macrofagi; Lym = linfociti. * I, p &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Figura 5. OVA-IgE specifiche. I topi (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l&#39;ultima sfida, IgE è stata misurata nel BAL e nel siero del sangue raccolto mediante puntura cardiaca, come descritto nel protocollo. * I, p &lt;0,05 vs PBS.

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Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal VAMC Atlanta IACUC Comitato istituito ai sensi del protocollo # V010-10.

I modelli animali di malattie allergiche delle vie aeree forniscono importanti strumenti per gli studi relativi ad asma clinico. Un certo numero di modelli differenti, impiegando specie variabili e antigeni, sono stati sviluppati. Il mouse, una specie di laboratorio attraenti e di uso frequente, offre anche una serie di vantaggi per i modelli di malattie allergiche delle vie aeree. 9,10 Sebbene tali modelli non imitare l&#39;asma sotto ogni aspetto, 11 con gli aspetti della malattia cronica che son...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Ovalbumina </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di alluminio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetil-β-methylcholine cloruro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Sale di sodio pentobarbital </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Pletismografia corpo intero (WBP) del sistema </td><td> Buxco Research Systems Wilmington, NC </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc. Montreal, Canada </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Microscopio ottico </td><td> Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, Carolina del Nord </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick macchia </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta ripetitiva </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

murine model of allergen induced asthma

L&#39;asma è una delle principali cause di morbilità e mortalità, che colpisce circa 300 milioni di persone in tutto il mondo. 1 oltre l&#39;8% della popolazione degli Stati Uniti ha l&#39;asma, con la prevalenza in aumento. 2 Come per altre malattie, modelli animali di malattie allergiche delle vie aeree facilitare notevolmente comprensione della fisiopatologia sottostante, aiutare ad identificare potenziali bersagli terapeutici, e permettere sperimentazioni precliniche di possibili nuove terapie. I modelli di malattia delle vie aeree allergica sono stati sviluppati in diverse specie animali, ma i modelli murini sono particolarmente attraente a causa del basso costo, pronta disponibilità, e ben caratterizzati sistema immunitario di questi animali. 3 disponibilità di una varietà di ceppi transgenici aumenta ulteriormente l&#39;attrattiva di questi modelli. 4 Qui si descrivono due modelli murini di malattie delle vie aeree allergica, sia ovoalbumina utilizzando come antigene. A seguito di sensibilizzazione iniziale mediante iniezione intraperitoneale, un modello Delivtori la sfida antigene per nebulizzazione, l&#39;altro con consegna intratracheale. Questi due modelli offrono vantaggi complementari, con ogni imitando le caratteristiche principali di asma umana. 5 Le caratteristiche principali di asma acuto sono una risposta esagerata delle vie aeree a stimoli come la metacolina (iperresponsività delle vie aeree; AHR) e ricco di infiammazione eosinofila delle vie aeree. Questi sono anche gli effetti di spicco del challenge allergenico nei nostri modelli murini, 5,6 e descrivere le tecniche per la misurazione di loro e quindi valutare gli effetti della manipolazione sperimentale. In particolare, si descrive sia invasive 7 e 8 non invasivo tecniche per la misurazione iperreattività delle vie aeree come pure metodi per valutare l&#39;infiltrazione di cellule infiammatorie nelle vie aeree e del polmone. Cellule infiammatorie delle vie aeree vengono raccolti da lavaggio broncoalveolare istopatologia polmonare mentre viene utilizzato per valutare i marcatori di infiammazione in tutto l&#39;organo. Questetecniche forniscono potenti strumenti per studiare l&#39;asma in modi che non sarebbero possibili in esseri umani.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Modelli murini sperimentali di asma allergico offrono nuove possibilità per studiare la patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie. Questi modelli sono adatti a fattori di misura che regolano la risposta immunitaria allergica, infiammazione delle vie aeree, e fisiopatologia polmonare.

Modello murino di asma indotta da allergene

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

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39.8K Views.  Emory University and Atlanta VA Medical Center. Modelli murini sperimentali di asma allergico offrono nuove possibilità per studiare la patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie. Questi modelli sono adatti a fattori di misura che regolano la risposta immunitaria allergica, infiammazione delle vie aeree, e fisiopatologia polmonare.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

Un modello Murine di encefalite virale acuta indotta da virus dengue

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Robust osufilazione modello di Murine Periodontitis per la valutazione dei neutrofili orali

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

Analisi sistematica del punteggio per l'infiammazione intestinale in un modello di colite indotta da solfato di sodio di Murine

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...