TKMcG è sostenuto da una borsa di studio dal Canadian Thoracic Society. CONTRIBUTO DEGLI AUTORI Tutti gli autori hanno preso parte alla concezione del manoscritto. Inoltre, TKMcG avviato il progetto, raccolto risultati sperimentali, ha contribuito alla stesura del manoscritto e la sua revisione critica. AR raccolti e analizzati i risultati sperimentali, ha redatto il manoscritto e ha contribuito alla sua revisione critica. LF raccolti risultati sperimentali e ha contribuito alla revisione critica del manoscritto. TFS e JGM contribuito alla revisione critica del manoscritto.

Le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati dal Comitato Università Animal Care McGill in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care (CCAC). 1. Operazioni preliminari <ol><li> Soluzioni: <ol><li> Metacolina: Preparare una soluzione madre a 50 mg / ml e fare diluizioni seriali (1:1) in base alle concentrazioni da testare 5. Lasciare le soluzioni a temperatura ambiente prima di nebulizzazione 5. </li><li> Anestetici: diversi regimi sono stati riportati in letteratura in vari ceppi di topi (Tabella 1). Nota: Regimen 1 è stato utilizzato ai sensi del presente protocollo. </li></ol></li><li> Equipaggiamento: Il presente protocollo si applica a uno dei due generazioni flexiVent supportati dal software flexiWare 7. Le funzioni del software sono raggruppati in tre moduli: Definizione e Pianificazione Studio, sperimentazione Session e Review e Reporting. <ol><li> Accendere il sistema (solo flexiVent FX) e / o avviare il software. </li><li> Alla prima sessione di sperimentazione o in qualsiasi momento prima di esso, aprire la definizione Study &amp; modulo Pianificazione di predefinire la struttura studio. </li><li> Fare clic sul pulsante Crea un nuovo studio e seguire la procedura guidata per creare uno studio, delineare il protocollo e definire i gruppi sperimentali e soggetti da studiare. </li><li> Avviare una sessione di sperimentazione aprendo il modulo di sessione Sperimentazione e seguendo la sequenza di avvio per lo studio e la selezione del modello. </li><li> Assegnare un soggetto al sito di misura e confermare il suo peso. </li><li> Procedere con la calibrazione del sistema seguendo la procedura descritta nel software operativo. Verrà chiesto a un certo punto per fissare la cannula da utilizzare (passo 1.3.3) per la Y-tubo per la calibrazione. </li><li> Passaggio fondamentale. Ripetert passo 1.2.6 se i valori di taratura ottenuti sono al di fuori del range accettabile. (Fare riferimento alla flexiVent FX o flexiWare 7 Manuale utente per il modulo di specifici intervalli accettabili di valori di calibrazione). </li><li> Annullare la richiesta per avviare la ventilazione e la registrazione dei dati a meno pronto per iniziare l&#39;esperimento. Questi possono essere avviate in un momento successivo. </li></ol></li><li> Soggetti: <ol><li> Anestetizzare il soggetto usando dosi appropriate di agenti anestetici (Tabella 1). </li><li> Verificare che il soggetto ha raggiunto un livello chirurgico di anestesia. Il soggetto dovrebbe mostrare alcuna reazione a un pizzico punta e la sua respirazione deve essere regolare e non affannoso. </li><li> Eseguire una tracheotomia e incannulare la trachea. <ol><li> Mettere l&#39;animale sulla sua schiena e di fornire una fonte di calore (ad esempio una coperta di riscaldamento a temperatura controllata o di una lampada con una lampadina da 60 watt situata a circa 45 cm dal mouse per evitare l&#39;eccessivo riscaldamento). </li><li> Clean Thzona della gola e con alcool ed esporre la trachea con una incisione cutanea e separare delicatamente la ghiandola sottomandibolare e lo strato muscolare che lo ricopre. </li><li> Sollevare delicatamente la trachea usando un paio di micro-pinza e passare sutura sotto di esso. </li><li> Tagliare tra due anelli di cartilagine più vicina la laringe per fare una piccola incisione nella trachea senza sezionamento essa. </li><li> Inserire la cannula precedentemente tarato in incisione e avanzare delicatamente all&#39;interno della trachea della lunghezza di circa 5 anelli. Nota: Gli attuali esperimenti sono stati condotti utilizzando un 1,2 cm di lunghezza in metallo 18 cannula calibro. </li><li> Passaggio fondamentale. Fissare la cannula in posizione con la sutura. L&#39;allegato deve formare una tenuta ermetica attorno alla cannula. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ventilazione Meccanica <ol><li> Portare l&#39;animale vicino al ventilatore. </li><li> Avviare la ventilazione meccanica, selezionando un predefinitoo un profilo personalizzato di ventilazione nella finestra mobile di ventilazione. </li><li> Collegare l&#39;animale al ventilatore tramite il Y-tubo. </li><li> Passo critico. Allineare l&#39;animale al ventilatore e assicurarsi che la cannula tracheale è allo stesso livello del ventilatore per evitare una possibile occlusione cannula tracheale o torsione. </li><li> Passaggio fondamentale. Esegui una inflazione perturbazione profonda facendo doppio clic sul nome della perturbazione di verificare l&#39;inserimento cannula e l&#39;attaccamento. In assenza di una perdita, il sistema deve essere in grado di tenere una pressione di 30 cmH 2 O per un periodo di 3 secondi senza eccessivo spostamento di volume (Figura 1). Il volume registrato e tracce di pressione dovrebbero essere liscia, senza segni di offset o deformazione in quanto potrebbero indicare una ostruzione cannula o smarrimento. </li><li> Se necessario, collegare segno vitale trasduttori per la frequenza cardiaca e controllo della temperatura corporea. La registrazione dei dati può essere avviata either manualmente o automaticamente tramite uno script. </li></ol> 3. Funzione polmonare Misure Misurazioni o comandi (ad esempio attivazione nebulizzatore, marker di eventi) possono essere automatizzate utilizzando script predefiniti o personalizzati per un processo sperimentale altamente controllato e ripetibile (Figura 2). Sei famiglie di perturbazioni che danno luogo ad una serie di parametri possono essere usati per la descrizione dell&#39;oggetto meccanica del sistema respiratorio al basale e successivo a un determinato sfida (Tabella 2). <ol><li> Passaggio fondamentale. Quando si è pronti per iniziare a prendere le misure, eseguire una inflazione profonda per reclutare le aree polmonari chiuse e standardizzare la storia del volume polmonare. </li><li> Passaggio fondamentale. Verificare l&#39;assenza di sforzi inspiratori spontanei eseguendo una misura sperimentale (ad esempio PVS-P o PV-V). Osservare le tracce dei segnali di pressione nella vista set di dati selezionato. Con graduali curve fotovoltaici,altipiani pressione deve essere ben definito, senza deviazioni verso il basso. Una oscillazione verso il basso in pressione indicherebbe uno sforzo inspiratorio dall&#39;animale (Figura 3). </li><li> Avviare lo script selezionato facendo doppio clic sul suo titolo. Script utilizzati nel presente studio generalmente inclusi per le misure: <ul><li> Una sequenza di misurazioni di base in triplicato. </li><li> Attivazione del nebulizzatore per la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata. Nota: Quando viene richiesto dal sistema, caricare circa 100 ml di soluzione fisiologica o di una soluzione di metacolina nel nebulizzatore. Nebulizzazione si avvia e arresta automaticamente. </li><li> Una sequenza di misure ravvicinati (ogni 10-15 secondi) per un periodo di circa 3 minuti dopo l&#39;attivazione del nebulizzatore. </li><li> Un prompt per eseguire un&#39;altra sfida e ripetere una sequenza di misure Nota:. Asciugatura l&#39;interno del monte nebulizzatore con un tampone in bsfide ra possono aiutare a prevenire o goccioline di condensa edificio-up in linea inspiratoria. </li></ul></li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, arrestare la ventilazione e staccare il soggetto. </li><li> Passare alla seguente argomento nel software operativo e confermare il suo peso. </li><li> Passaggio critico. Sciacquare e asciugare nebulizzatore, adattatore, Y-tubing, e cannula tra i soggetti. </li><li> Ripetere i passaggi da 1.2.6 a 3.6. </li><li> Alla fine della giornata, chiudere la sessione sperimentale. Ricordarsi di risciacquare e asciugare nebulizzatore, adattatore, Y-tubing, e cannula e per pulire la valvola di espirazione del sistema prima di lasciare il laboratorio, seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol> 4. Analisi dei dati Il software calcola e visualizza automaticamente i parametri associati a una perturbazione. Esso fornisce anche un coefficiente di determinazione (COD) che riflette l&#39;adattamento del modello matematico per i dati. Ogni set di dati con un isolamentofficiente COD è etichettato come esclusi dal software. Rassegna di sessioni sperimentali, i dati ri-analisi e la creazione di scenari di esportazione sono fatto nel modulo Review &amp; segnalazione del software. <ol><li> Aprire il modulo Review &amp; reporting e creare uno scenario di esportazione, avendo cura di includere solo set di dati che hanno una sufficiente COD. </li><li> Esporta come parametri necessari, curva di pressione o di flusso-volume, segnali di set di dati grezzi o le informazioni oggetto di un foglio di calcolo (cfr. tabella 3). </li><li> Misurazioni della durata media della linea di base per ciascun parametro e trama tutte le misure in funzione del tempo (vedi figura 4). Si può quindi scegliere di calcolare l&#39;area sotto la curva, analizzare il profilo generale delle curve o eseguire una analisi statistica. </li><li> Per esprimere respiratorie risultati di risposta in funzione della concentrazione di metacolina, determinare per ogni soggetto, parametri e condizioni sperimentali sia una specificapunto (ad es picco) o un tempo specifico dopo ogni metacolina. Calcolare le medie di gruppo e la relazione o risultati trama per ogni condizione sperimentale (Tabella 4, Figura 5). </li><li> Si può anche prendere in considerazione il calcolo della concentrazione di produzione di un raddoppio di un dato valore di base del parametro (PC 200; Figura 5C), l&#39;applicazione di una normalizzazione (ad esempio% al basale) o l&#39;esecuzione di un&#39;analisi statistica. </li></ol>

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Il continuo studio di disfunzione delle vie respiratorie come si riferisce ad asma e altri disturbi polmonari rimane fondamentale per la comprensione dei meccanismi alla base della malattia e lo sviluppo di opzioni di trattamento. L&#39;uso del mouse per malattia delle vie aeree modello è stato essenziale nel guadagnare la comprensione in questi meccanismi di malattia. Quando si considera la valutazione disfunzione delle vie aeree in un oggetto piccolo come un topo, avere strumenti affidabili e precisi con cui misurare la funzione polmonare è un fattore critico. Inoltre, avere strumenti in grado di fornire approfondimenti sulla posizione di rotta erettile o l&#39;effetto terapeutico è inestimabile. La tecnica UFT combina tutti questi attributi e fornisce un approccio potente, integrativo e traslazionale per valutare le variazioni fisiologiche. Per avere successo con questo tipo di misura nei topi, particolare attenzione deve essere data a pochi passi, e cioè la calibrazione del sistema, la resistenza del endotracheale cannula, il tipo di nebulizzatore (così come le impostazioni di funzionamento) il posizionamento dell&#39;animale e la standardizzazione della storia volume polmonare. Inoltre, è indispensabile per ottenere insiemi di dati validi che il sistema respiratorio del soggetto rimane passivo durante le misurazioni. Ciò può essere ottenuto mediante la somministrazione di un agente paralizzante muscolare, lavorando ad un piano profondo di anestesia o iperventilazione soggetto per indurre apnea (vedi Tabella 1). Gli investigatori possono iniziare padroneggiare il sistema e il suo software operativo, se lo si desidera, con carichi di prova, durante l&#39;acquisizione delle competenze necessarie per le misure nei topi. Sarebbe quindi logico per generare risultati riproducibili in animali naïve prima di muoversi verso modelli di malattia o topi trattati. Dal momento che una percentuale importante di modelli di malattia nella ricerca delle vie respiratorie comporta esponendo gli animali ad agenti quali allergeni, tossine, sostanze inquinanti, fumo di sigaretta o gas, la variabilità nei risultati ottenuti con i measurement tecnica descritta in questo articolo potrebbe quindi essere influenzato dalla procedura esposizione utilizzato. Standardizzazione dei processi sperimentali chiave (ad esempio utilizzando l&#39;esposizione controllato da computer e sistemi di misura 6, 13, 14) potrebbe potenzialmente avere un impatto significativo nel ridurre la variabilità. Gli esempi presentati in questo articolo rappresentano una selezione dei risultati tipici della naïve e cloro-topi esposti esperimenti, evidenziando i punti di forza e le limitazioni della tecnica. Come visibile ad esempio in figura 6, la tecnica è in grado di generare le misure di funzione polmonare riproducibili. Mentre sono stati segnalati analoghi valori di resistenza al basale tra i ceppi di topi, le differenze di elastanza sono stati tuttavia osservati 15. Modifiche sostanziali sono inoltre da attendersi tra neonato e topi adulti 16. Come per gli altri nella valutazione fisiologica vivo, risultati di alta precisione, come esimoose generato dal UFT, sono dotati di una concessione per lo stato naturale dei soggetti. Questo principio, che viene indicato come il principio di indeterminazione fenotipizzazione 1, si applica al presente protocollo, nel senso che le misure devono essere fatte in anestetizzato, tracheotomizzato (o per via orale intubato) e ventilato meccanicamente soggetti. Un&#39;altra limitazione della tecnica è osservabile in Figura 5D-5F in cui i dati non sono disponibili le concentrazioni più elevate per il gruppo cloro esposta perché l&#39;adattamento del modello di fase costante ai dati è povera di sopra dei livelli moderati di broncocostrizione. Tuttavia, gli animali gravemente bronchoconstricted potrebbero essere valutati analizzando ZRS direttamente 15, oppure utilizzando software di terze parti post analisi per adattarsi modelli matematici più complessi, per esempio tenendo conto della eterogeneità di funzione meccanica 17. Dataset esclusi possono osservare anche se le vie aeree dell&#39;animale non sono sufficientemente passive o se la resistenza della cannula è troppo alta. Come regola generale, la resistenza della cannula non deve superare la resistenza dell&#39;animale al basale. Lavorare con una cannula di più grande diametro interno e / o più breve lunghezza contribuirà a ridurre la resistenza cannula. Infine, l&#39;attuale dimostrazione di misurazioni UFT in mouse può essere percepita come una metodologia di tempo e quindi meno efficienti o meno applicabili a studi longitudinali rispetto alle tecniche meno invasive. Tuttavia questi ultimi sono associati a una grande incertezza sulla base dei loro risultati e sono visti da molti come imperfetto 1. Misurazioni invasive ripetute sono possibili negli animali per via orale intubati, anche se tecnicamente più impegnativo 17. Dagli esempi forniti, i risultati hanno dimostrato l&#39;equivalenza delle due generazioni del sistema flexiVent a produrre misurazioni della meccanica respiratoria, nonché vie respiratorie hyperreactività e ipersensibilità alla metacolina inalata dopo cloro-esposizione nei topi. Quando usato per caratterizzare o capire cambiamenti fisiologici o modelli di malattia, l&#39;aspetto misura dettagliata collegati con la tecnica può contribuire ad estendere lo stato attuale delle conoscenze.

Caratterizzazione adeguata delle proprietà meccaniche dei polmoni nei piccoli animali è diventato essenziale in quanto la rapida crescita di modelli murini nella scienza respiratoria. Quando è eseguita utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate (FOT), una tecnica utilizzata anche in soggetti umani, queste misurazioni forniscono un approccio potente, integrativo e traslazionale per studiare i cambiamenti fisiologici significativi. UFT misurazioni sono tipicamente ottenuti analizzando i segnali di pressione e di volume acquisite in reazione ad un predefinito, piccola ampiezza, forma d&#39;onda oscillatoria flusso d&#39;aria (indicato anche come perturbazione o segnale di ingresso) applicata in apertura delle vie aeree del soggetto 1. Nella sua forma più semplice, una perturbazione UFT sarebbe una singola forma d&#39;onda sinusoidale ad una frequenza ben definita. Perturbazioni più complessi consistono tipicamente di una sovrapposizione di una selezione di specifica (primi fra) le forme d&#39;onda di frequenza che copre un ampio spettro. La decomposizione del multifrequenzasegnali di ingresso e uscita nei loro componenti utilizzando la trasformata di Fourier permette il calcolo della impedenza di ingresso del sistema respiratorio (ZRS), cioè la funzione di trasferimento tra l&#39;ingresso e di uscita, ad ogni frequenza compresa nel perturbazione 2. Pertanto, UFT consente la valutazione simultanea meccanica respiratoria su una gamma di frequenze in una sola manovra 2. Montaggio modelli matematici avanzati (ad esempio il modello di fase costante 3) ai dati di impedenza quindi permettono una suddivisione della risposta nelle vie aeree (centrale e periferico) e parametri dipendenti del tessuto del parenchima polmonare 1, 3. Poiché molti fattori che influenzano la risposta fisiologica (ad esempio frequenza respiratoria, volume corrente, volume polmonare, delle vie aeree superiori, gli sforzi respiratori spontanei, i tempi delle misurazioni) sono controllati e standardizzati dal sistema di misurazione e procedure sperimentali, 1 la tecnica è tappoin grado di generare misurazioni precise e riproducibili a condizione che sia eseguita correttamente. L&#39;obiettivo di questo articolo è di fornire una dettagliata descrizione cronologica della procedura necessario per eseguire tali misurazioni nei topi. Il protocollo si compone di quattro parti: fasi preparatorie (reagenti, attrezzature e soggetti), la ventilazione meccanica, misure di funzione polmonare e l&#39;analisi dei dati. Esempi di risultati rappresentativi della meccanica del sistema respiratorio generati utilizzando un ventilatore a pistone controllato dal computer (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada) sono forniti. Questi sono stati ottenuti da topi naive nonché da un modello guidato stress ossidativo di danno delle vie aeree caratterizzata da infiammazione delle vie aeree, i danni delle cellule epiteliali e una maggiore reattività delle vie aeree alla metacolina inalata per aerosol 4. Anche se questo protocollo è spesso usato per valutare la reattività delle vie aeree alla metacolina inalata, si estende ad altri esiti e various patologie comprese asma, malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), enfisema, fibrosi polmonare, danno polmonare nonché di modelli di topi transgenici di patologie simili alla malattia umana. I risultati della ricerca che utilizzano questo strumento può contribuire ad una migliore caratterizzazione e la comprensione dei cambiamenti fisiologici o modelli di malattia e per l&#39;espansione in nuove aree di ricerca.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetyl-&beta;-methylcholine chloride </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A-2251</td>
 <td>Methacholine</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Adson forceps, serrated 12 cm</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11018-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria MC31 forceps, serrated-curved</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-31</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14058-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spring scissors-2.5 mm blades, straight</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15000-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-sterile blunt needle (18g x &frac12;")</td>
 <td>Brico Medical Supplies Inc.</td>
 <td>BN1805</td>
 <td>Endotracheal cannula</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-sterile 5-0 silk suture</td>
 <td>Seraflex</td>
 <td>IDI58000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffered solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14190-144</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>Starstedt</td>
 <td>SS-4001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml TB syringes</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>309626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l filter tips</td>
 <td>Biosphere</td>
 <td>70.760.211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>flexiVent FX</td>
 <td>SCIREQ Inc. </td>
 <td>sales@scireq.com</td>
 <td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank">www.scireq.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aerogen Aeroneb nebulizer</td>
 <td>SCIREQ Inc.</td>
 <td>sales@scireq.com</td>
 <td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank">www.scireq.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique

La tecnica delle oscillazioni forzate (FOT) è un potente strumento, integrativo e traslazionale permettere la valutazione sperimentale della funzione polmonare nei topi in modo completo, dettagliato, preciso e riproducibile. Esso fornisce misurazioni della meccanica del sistema respiratorio attraverso l&#39;analisi dei segnali di pressione e di volume acquisite in reazione ad predefinito, piccola ampiezza, forme d&#39;onda oscillatoria flusso d&#39;aria, che sono tipicamente applicati in apertura delle vie aeree del soggetto. Il presente protocollo dettagli i passaggi necessari per eseguire in modo adeguato le misure oscillazioni forzate nel topo, utilizzando un ventilatore a pistone controllato dal computer (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada). La descrizione è suddivisa in quattro parti: fasi preparatorie, la ventilazione meccanica, misure di funzione polmonare e l&#39;analisi dei dati. Esso comprende anche informazioni su come valutare la reattività delle vie aeree alla metacolina inalata in topi anestetizzati, una comune applicazione di questo technique che si estende anche ad altri esiti e le varie patologie polmonari. Le misurazioni ottenute in topi naive come pure da un modello guidato stress ossidativo di danno delle vie aeree vengono presentati per illustrare come questo strumento possa contribuire ad una migliore caratterizzazione e la comprensione dei cambiamenti fisiologici studiati o modelli di malattie nonché per applicazioni in nuove aree di ricerca.

Meccanica Respiratoria misure di sistema. Tabella 4 mostra i risultati tipici della naïve A / J topi ottenute al basale e seguenti broncocostrizione indotta da metacolina (12,5 mg / ml) utilizzando uno dei due generazioni flexiVent supportati dal software flexiWare 7. Tecnica del sistema respiratorio, cioè in condizioni di petto chiuse, sono state valutate da alternando perturbazioni della frequenza di oscillazione forzata singole famiglie e la banda larga in modo ravvicinati (SnapShot-150, Quick Prime-3, rispettivamente). Dal momento che la ventilazione è in pausa durante le misurazioni, la rapida Prime-3, che copre una gamma di frequenza simile a quella del Primo-8, ma ha una durata più breve (3 vs 8 sec), è stato selezionato al fine di ridurre il periodo di apnea, ridurre al minimo l&#39;effetto di la perturbazione sui gas ematici e fornire una migliore risoluzione della risposta. Parametri associati a ogni perturbazione stati calcolati automatically dal software operativo. I risultati mostrano che le due generazioni del sistema flexiVent prodotte misure equivalenti di meccanica respiratoria. Sito di risposta ai polmoni. Distinguere il sito della risposta polmonare permette al ricercatore di individuare ulteriori regioni colpite, nonché per identificare i potenziali punti di intervento farmacologico 6. Ad esempio, naïve A / J topi mostrano un incremento di resistenza al basale, quando la pressione di fine espirazione contro cui sono fatte le misurazioni è aumentata 3-9 cmH2O (Figura 6A, SnapShot-150). Nel presente esempio, l&#39;utilizzo di misurazioni UFT banda larga (Quick Prime-3) fornito dettagli chiarire la base per il cambiamento di resistenza: La variazione di pressione espiratoria finale determinato una diminuzione della resistenza delle vie aeree (R N) coerente con la effetti broncodilatatori di un volume polmonare più alto e il più grande stampa inflazioneure (Figura 6D) e un aumento smorzamento tessuto (G; Figura 6E), un parametro strettamente legato alla resistenza del tessuto che riflette viscoelasticità tessuto ed eventualmente la resistenza delle piccole vie aeree 7. Quest&#39;ultimo è noto per aumentare con l&#39;aumento del volume polmonare. Iperreattività delle vie aeree. Seguito a esposizione cloro gassoso, reattività delle vie aeree alla metacolina inalata aumenta rispetto all&#39;esposizione aria in topi Balb / c come conseguenza di danno delle vie aeree 4 (figura 2). Cloro è noto per indurre stress ossidativo, che porta alla distruzione delle cellule strutturali delle vie aeree, in particolare le cellule epiteliali, e inducendo il reclutamento di cellule infiammatorie. Come rappresentato in figura 5, cambiamenti in tutti parametri che descrivono la meccanica del sistema respiratorio può essere visto in risposta alle crescenti sfide metacolina. Rispetto ai topi esposti aria, topi esposti a chlorine gas visualizzata maggiori risposte massime a tutti i parametri UFT (Figura 5A, 5B, 5D-5F) nonché un aumento statisticamente significativo spostamento verso sinistra della curva concentrazione-risposta esemplificato da una riduzione della concentrazione di metacolina necessaria per causare un raddoppio della resistenza e elastanza (PC 200; Figura 5C). Questi risultati illustrano, rispettivamente, iperreattività delle vie aeree e di ipersensibilità al via inalatoria metacolina seguito all&#39;esposizione al gas di cloro. Altre misure. Oltre alla UFT, il sistema flexiVent può essere utilizzato anche per raccogliere altri tipi di 8-10 funzionalità polmonare o cardiovascolari 11 misurazioni. Figura 7 mostra una graduale, dovuti a pressione curva pressione-volume rappresentativo in naive A / J topi in condizioni basali . La porzione superiore del lembo sgonfiamento della curva viene adattata alla Salazar-Knowles equazione 12 </<html> sup&gt; e parametri sono calcolati automaticamente dal software. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="Tabella 1" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabella 1. Esempi di regimi anestetici usati in mouse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare tavolo più grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="Tabella 2" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" /> Tabella 2. Perturbazioni utilizzati per misure di funzione polmonare nei topi. * Proroga necessaria per il sistema. Il soggetto ha anche bisogno di essere in una camera di pletismografo chiusa durante le misurazioni.lank &quot;&gt; Clicca qui per vedere tabella più grande. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="Tabella 3" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabella 3. Esempio di parametri esportati dalla frequenza forzati famiglie singole e banda larga perturbazione oscillazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere tabella più grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="Tabella 4" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabella 4. Sistema di comparazione. Confronto dei parametri meccanica polmonare raccolti con le due generazioni del sistema flexiVent gestite da software flexiWare 7. Risultati sono stati generati in naive A / J topi (n = 5 /<html> gruppo) al basale e seguenti broncocostrizione indotta da metacolina (MCH 12,5 mg / ml). * I gruppi sono stati confrontati con una ANOVA a due vie per misure ripetute e il log 10 di risposte individuali per l&#39;omogeneità delle varianze (GraphPad Prism, versione 5.03; GraphPad Software, San Diego, Stati Uniti d&#39;America). <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg"/> Figura 1. Schermate di una inflazione polmone profondo. Il pannello superiore mostra il volume spostato dal pistone del ventilatore (traccia rossa) e il volume consegnato al soggetto (traccia grigio). Il pannello inferiore mostra la pressione del cilindro aumentando ad una pressione impostata di 30 cmH 2 O su un periodo di 3 secondi e mantenuta costante per lo stesso periodo di tempo. 172/50172fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Esempio di uno script tipico utilizzato per valutare la meccanica del sistema respiratorio al basale. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Sforzi inspiratori spontanei durante l&#39;esecuzione di una curva pressione-volume stepwise. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg"/> Figura 4. Ora portate seguente risposta crescente sfide metacolina per via inalatoria. Risultati sono espressi come media (± deviazione standard) di un gruppo di 5 naïve spontaneamente hyperresponsive A / J topi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg"/> Figura 5. Cambiamenti nella meccanica del sistema respiratorio a seguito crescenti sfide metacolina in cloro-e aria esposti topi BALB / c. Valore di picco è stato identificato per ogni parametro in ogni oggetto e condizione sperimentale. Medie di gruppo sono stati poi calcolati (media ± deviazione standard, n = 4-6). Le differenze tra i gruppi sono stati valutati mediante analisi della varianza utilizzando il registro di 10 risposte individuali per l&#39;omogeneità delle varianze. La concentrazione di metacolina produrre un raddoppio della linea di base (PC 200) è stato ottenuto inserendo un secondo polinomio per singole curve dose-risposta e interpolazione della curva montato. I punti dati sono mancanti in D, E e F nei topi cloro-espostile due più alte concentrazioni metacolina causa sufficientemente elevati coefficienti di determinazione che riflette una scarsa vestibilità del modello matematico ai dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg"/> Figura 6. Partizionamento della risposta respiratoria nelle vie aeree e la meccanica del tessuto polmonare. Traccia sperimentale da un ingenuo A / J topi illustrano singola frequenza (2,5 Hz) e la banda larga (1-20.5Hz) costretti misure di oscillazione di meccanica respiratoria, in triplice copia a due diverse pressioni di fine espirazione (3 e 9 cm H 2 O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> </a&gt;. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="Figura 7" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg"/> Figura 7. Curva pressione-volume in naïve A / J topi in condizioni basali. Curve pressione-volume sono stati generati utilizzando una perturbazione di pressione-driven graduale (PV-P) per assicurare che ogni polmoni del mouse sono stati gonfiati alla stessa pressione, indipendentemente dalla loro condizione. Salazar-Knowles parametri dell&#39;equazione estratti dalle singole curve pressione-volume sono stati mediati e riportati in formato tabella. Risultati sono espressi come media ± deviazione standard (n = 6).

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Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

Il presente protocollo fornisce una dettagliata descrizione passo-passo le procedure necessarie per eseguire le misurazioni della meccanica del sistema respiratorio, nonché la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata nei topi usando la tecnica delle oscillazioni forzate (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).

Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

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Research

JoVE Journal

Biology

56.0K Views.  McGill University. Il presente protocollo fornisce una dettagliata descrizione passo-passo le procedure necessarie per eseguire le misurazioni della meccanica del sistema respiratorio, nonché la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata nei topi usando la tecnica delle oscillazioni forzate (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).

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Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Ricerca

Biologia

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative assessment of lung function in rodent models is an important tool in the development of future therapies. Commonly used techniques for assessing respiratory function including invasive plethysmography and forced oscillation. While these techniques provide valuable information, data collection can be fraught with artefacts and experimental variability due to the need for anesthesia and/or invasive instrumentation of the animal. In contrast, unrestrained whole-body plethysmography (UWBP) offers a precise, non-invasive, quantitative way by which to analyze respiratory parameters. This technique avoids the use of anesthesia and restraints, which is common to traditional plethysmography techniques. This video will demonstrate the UWBP procedure including the equipment set up, calibration and lung function recording. It will explain how to analyze the collected data, as well as identify experimental outliers and artefacts that results from animal movement. The respiratory parameters obtained using this technique include tidal volume, minute volume, inspiratory duty cycle, inspiratory flow rate and the ratio of inspiration time to expiration time. UWBP does not rely on specialized skills and is inexpensive to perform. A key feature of UWBP, and most appealing to potential users, is the ability to perform repeated measures of lung function on the same animal.

The assessment of respiratory physiology has traditionally relied upon techniques, which require restraint or sedation of the animal. Unrestrained whole-body plethysmography, however, provides precise, non-invasive, quantitative analysis of respiratory physiology in animal models. In addition, the technique allows repeated respiratory assessment of mice allowing for longitudinal studies.

Misurare funzione respiratoria nei topi mediante sfrenato Pletismografia corpo intero

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Induction of Right Ventricular Failure by Pulmonary Artery Constriction and Evaluation of Right Ventricular Function in Mice

The mechanism of right ventricular failure (RVF) requires clarification due to the uniqueness, high morbidity, high mortality, and refractory nature of RVF. Previous rat models imitating RVF progression have been described. Compared with rats, mice are more accessible, economical, and widely used in animal experiments. We developed a pulmonary artery constriction (PAC) approach which is comprised of banding the pulmonary trunk in mice to induce right ventricular (RV) hypertrophy. A special surgical latch needle was designed that allows for easier separation of the aorta and the pulmonary trunk. In our experiments, the use of this fabricated latch needle reduced the risk of arteriorrhexis and improved the surgical success rate to 90%. We used different padding needle diameters to precisely create quantitative constriction, which can induce different degrees of RV hypertrophy. We quantified the degree of constriction by evaluating the blood flow velocity of the PA, which was measured by noninvasive transthoracic echocardiography. RV function was precisely evaluated by right heart catheterization at 8 weeks after surgery. The surgical instruments made inhouse were composed of common materials using a simple process that is easy to master. Therefore, the PAC approach described here is easy to imitate using instruments made in the lab and can be widely used in other labs. This study presents a modified PAC approach that has a higher success rate than other models and an 8-week postsurgery survival rate of 97.8%. This PAC approach provides a useful technique for studying the mechanism of RVF and will enable an increased understanding of RVF.

Here, we provide a useful approach for studying the mechanism of right ventricular failure. A more convenient and efficient approach to pulmonary artery constriction is established using surgical instruments made inhouse. In addition, methods to evaluate the quality of this approach by echocardiography and catheterization are provided.

Induzione del fallimento ventricolare destro da parte della costrizione dell'arteria polmonare e valutazione della funzione ventricolare destra nei topi

The mechanism of right ventricular failure (RVF) requires clarification due to the uniqueness, high morbidity, high mortality, and refractory nature of ...