We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Cura&#231;ao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

NOTA: I reagenti devono essere preparati per Serial Block Volto Imaging di Coral Campioni 1 Preinfiltration Cera <ol><li> Sciogliere 3,6 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro. Mescolare bene su una piastra calda (60-70 ° C). </li><li> Aggiungere 400 mg di Sudan IV (per ridurre al minimo la cera fluorescenza di fondo). Mescolare bene e attendere fino ad ottenere una soluzione trasparente rosso. </li><li> Aggiungere 96 ml di paraffina fusa a caldo (100%) e mescolare bene. </li></ol> 1.2) Embedding Wax <ol><li> Sciogliere 7,2 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro e mescolare bene su una piastra calda (60-70 ° C). </li><li> Aggiungere 0,8 g di Sudan IV. Mescolare bene e attendere fino ad ottenere una soluzione trasparente rosso. </li><li> Aggiungere granuli di paraffina (162 g) e mescolare fino a quando la paraffina si scioglie completamente. </li><li> Aggiungere 30 g del bianco granulare Vybar e sciogliere completamente nello stesso bicchiere; una volta sciolto, mescolare. </li><li> Liberamente chiudere la bottiglia di vetro con un coperchio. Posizionare la bottiglia di vetro in un 60 ° C convezione ovit per mantenere gli ingredienti in uno stato liquido. Effettuare tutte le infiltrazioni di questo forno. </li><li> Dividere il volume totale della cera rossa 200 ml in due bottiglie di vetro da 100 ml. Utilizzare una aliquota di infiltrazione e l&#39;altro per l&#39;incorporamento finale. </li></ol> 1.3) Incorporare Coral tessuti per Serial Block Viso Imaging <ol><li> Lavare i polipi di corallo raccolti sul campo (SI Video 1) e memorizzati (3-6 mesi a 4-5 ° C in paraformaldeide) in tampone fosfato (3x 5 min) e decalcificazione quando è pronto per essere ripreso. Disincrostare il polipi in soluzione Excal per 24 ore o fino a quando i polipi sono totalmente prive di CaCO 3. Incubare diversi polipi di corallo decalcificata da un singolo blocco di una serie di 25, 50, 75 e 100% etanolo, seguito da 1x sostituto dello xilene a disidratare i campioni. </li><li> Posizionare i polipi trattati in preriscaldato a 65 ° C forno contenente 100% sostituto di xilene. Incubare per 30 minuti due volte da Changing di soluzione fresca. Orientare i polipi in modo tale che la parte superiore dei polipi rivolto verso il basso e la superficie superiore è più piatta possibile. </li><li> Fate soluzioni di 2: 1, 1: 1, e 1: 2 sostituto di xilene e cera preinfiltration (passo 1.1) in 50 ml provette Falcon. </li><li> Incubare polipi corallini con queste tre concentrazioni crescenti di cera preinfiltration, seguita da 3x incubazione in cera preinfiltration 100% per 30-60 minuti ogni volta. </li><li> Nota: A seconda dello spessore dei campioni, a pochi passi 1.3.1-1.3.5 potrebbero essere aumentati con periodi di tempo più lunghi. </li><li> Spostare i campioni per l&#39;incorporamento di cera (vedi punto 1.2.6), dopo incubazione 3x in cera preinfiltration 100%. </li><li> Rimuovere la cera embedding dopo 30 min. Sostituire con cera incorporamento fresco e continuare l&#39;incubazione per un minimo di 4 ore a 65 ° C. </li></ol> 1.4) Incorporare in cera rossa <ol><li> Fotografare il blocco (vassoio in acciaio inox dove la cera bianca è posto e sulla cui sommità della samPLE è collocato). Ciò è necessario perché una volta incorporato nella cera, la posizione del campione diventa invisibile come la cera rossa incorporamento è opaco. </li><li> Mettere piccole gocce di cera alto punto di fusione intorno al nuovo in acciaio inox stampo embedding preriscaldato e lasciarlo raffreddare. Versare una piccola quantità di cera appena fuso integrazione da secondo contenitore, come indicato al punto 1.2.6. </li><li> Posizionare il polipo di corallo rivolto verso il basso rapidamente sopra il puntino cera bianca, quindi inserire un portacampioni plastica sul vassoio di acciaio inossidabile e versare cera più incorporamento in modo che la cera si avvicina alla superficie dello stampo di plastica. </li><li> Prendere l&#39;intera impostazione di 65 ° C forno e lasciare raffreddare su una panchina o su una superficie fredda fino a quando la cera si indurisce completamente. </li><li> Questo può richiedere fino a 6 ore giorno o due. Posizionare il blocco essiccata in frigorifero a 4 ° C, al riparo dalla luce, per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 1.5) il sezionamento a Serial Setup Block Viso <ol><li> Trim il blocco e tagliare 1 micron sezioni con un microtomo. Non raccogliere le sezioni in cui diventerà come polvere. Ricordate, stiamo Imaging solo il volto blocco. Il campione appare quando la cera bianca comincia a scomparire. </li><li> Cattura immagini del viso liscia blocco che contiene il campione ogni volta che una sezione viene rimosso. Continuare fino a quando il polipo del corallo scompare come in SI Video 2. </li><li> Record / Cattura le immagini con una macchina fotografica in bianco e nero usando un filtro fluorescente FITC per prendere l&#39;auto-fluorescenza del cromatofori / corallo polipo. Immagine 3-4 nuclei decalcificati di ciascuna specie. </li></ol> 2. Imaging Coralli Sotto due fotoni microscopia a fluorescenza <ol><li> Fissare nuclei polipo di corallo, ciascuno contenente circa 10-12 polipi di circa un centimetro di diametro, in 4% paraformaldeide presso il sito di raccolta (riva del mare) non appena vengono raccolte sotto l&#39;acqua. </li><li> I campioni a 4 ° C fino imaging. Nuclei Lavato sono collocati in the stessa soluzione a testa in giù in un piatto fondo di vetro di copertura (spessore di 0,17 millimetri). </li><li> Utilizzando un laser a due fotoni a 780 nm di eccitazione, immagine 3-4 polipi in due diversi ingrandimenti (zoom digitale) con un (NA 0,3) obiettivo 10X. La forma dei polipi del corallo e l&#39;altezza varia tra i campioni (di solito 1-2 mm) e la profondità delle immagini è anche limitata dalla distanza di lavoro del oggettivo di imaging. </li><li> Utilizzare la modalità di scansione tegola per la raccolta di circa 25-100 (5 x 5 o 10 x 10 piastrelle) immagini al piano focale di 50-100 xy e immagini attraverso l&#39;asse Z a intervalli di 10 o 20 micron, un totale di circa 5.000-10.000 immagini / polipi del corallo. </li><li> Immagine 3-4 aree polipo per rappresentare una specie di base e corallo. NOTA: L&#39;immagine tempo di acquisizione varia tra 2-5 hr zona / polipo. </li><li> Memorizzare tutte le immagini in formato RAW in disco rigido del sistema LSM 5 rendering 3D in una analisi di immagini 3D e software di rendering. </li></ol> 3. 3D Volume Rendering e Visualization di SBFI e due fotoni Spectral fluorescenza dati <ol><li> Ritagliare i dati 2D per ridurre la dimensione del file, concentrandosi su un singolo polipo utilizzando lo strumento di ritaglio quadrato nel programma e compilare come un unico file tiff (ridurre le dimensioni del file anche salvando il file in formato 8 bit) nel software di acquisizione. </li><li> Aprire i file montati dei dati SBFI (raccolti nella fase 1.5.1) o le piastrelle più z-pile di sezioni ottiche a due fotoni (raccolti nella fase 2.1.4) nel programma Imaris modulo Surpass sotto algoritmo di volume. </li><li> Proiettare i dati SBFI resi in 3D utilizzando una proiezione dell&#39;ombra. Creare una modalità isosurface dove i voxel sono thresholded per creare un modello di superficie solida (SI Video 3). </li><li> Visualizza le proiezioni in 3D utilizzando un algoritmo piano di ritaglio a xy, xz, yz e modalità ortogonali per rivelare la struttura 3D e la forma dei coralli. </li><li> Animare le proiezioni con un modulo di un&#39;animazione fotogramma chiave nello stesso programma Imaris (SI Videos 3-7). </li><li> Generare i file video al 5% di compressione e generare un clip filmato in formato avi utilizzando il volume (SI Video 4 e 6), 3D e Isosurface modalità (SI Video 5 e 7). </li></ol>

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The authors declare no conflict of interests.

Ricerca barriera corallina è uno sforzo di ricerca fortemente interdisciplinare, che coinvolge l&#39;analisi della simultanea fisiche, chimiche e fenomeni biologici che operano in ambiente marino. Lo studio di complessi ecosistemi delle barriere coralline è quindi meglio completata entro un &#39;Powers of Ten&#39; quadro contestuale (Figura 10). Questa grafica compilation dimostra che l&#39;ecosistema corallo copre una vasta gamma di dimensioni spaziali (10 -9 a 10 5 m). Inoltre,...

Il riscaldamento globale e di accompagnamento cambiamenti ambientali stanno interessando direttamente la salute e la distribuzione dei coralli tropicali marini 1-4. Sono stati osservati effetti multipli, tra cui sbiancamento dei coralli e la comparsa di malattie infettive 5-6. Tuttavia, la previsione più accurata della futura risposta corallo a queste minacce ambientali richiede che una &quot;linea di base&quot; istologica essere stabilito, che definisce la morfologia dei tessuti e la composizione delle cellule e la distribuzione dei coralli &quot;apparentemente sani&quot;. A sua volta, &quot;influenzati&quot; coralli possono quindi essere confrontati quantitativamente. Inoltre, dovrebbe essere stabilito questa linea di base per i coralli apparentemente sani in una varietà di condizioni ambientali, in modo che &quot;la risposta sana&quot; può essere misurato attraverso gradienti ambientali. Come primo passo verso la creazione di questa linea di base, uno studio 3D ad alta risoluzione è stata intrapresa di come apparentemente polipo tessuto del corallo sanomorfologia e composizione cellulare risponde agli aumenti di profondità d&#39;acqua (WD) e diminuzioni di accompagnamento alla luce del sole irraggiamento. I risultati possono poi essere utilizzati per stabilire una più completa comprensione meccanicistica di adattamento corallo, nonché al fine di conoscere l&#39;evoluzione corallo simbionte e il miglioramento della raccolta della luce. Coralli duri (Scleractinia) sono coloniali animali invertebrati marini che ospitano un complesso assemblaggio di altri microrganismi, indicate collettivamente come il corallo holobiont 7-10. La ricerca condotta nel presente studio si propone di utilizzare una suite di tecnologie di imaging all&#39;avanguardia per monitorare contemporaneamente le modifiche con l&#39;aumentare della profondità dell&#39;acqua nei tessuti e pigmenti zooxantelle simbionti dei coralli ospitanti apparentemente sani. Questo stabilirà il tessuto comparativa cella &quot;di base&quot; necessaria attraverso un gradiente batimetrico per i coralli apparentemente sani e fungono da indicatori di corallo health 10. Pigmenti corallo, chiamato cromatofori, agiscono per assorbire, riflettere, dispersione, rifrangere, diffrangere, o in altro modo interferire con radiazione solare incidente 11. Il rapporto endosimbiontica zooxantelle-chromatophore ha permesso la coevoluzione di strategicamente vantaggiosa ottimizzazione della luce-raccolta e strategie di crescita scheletrica, nonché di plasticità trofica (strategie di alimentazione spostando avanti e indietro da autotrofia a eterotrofia) per il corallo animale 12. Il sud dei Caraibi isola nazione di Curaçao (ex parte delle Antille olandesi) si trova a circa 65 km a nord del Venezuela nel nord-ovest trend Aruba-La Blanquilla arcipelago (Figura 1A). Il lungo 70 km costa meridionale di Curaçao contiene un continuo moderno e Miocene-Pliocene-Pleistocene-Olocene antico fringing reef di corallo tratto 13,14. SST media annuale su Curaçao varia di circa 3 ° C unnualmente, che vanno da un minimo di 26 ° C alla fine di gennaio ad un massimo di 29 ° C all&#39;inizio di settembre, con una temperatura media annua di 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Set, 2000-2010). La barriera corallina a Playa Kalki (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot; W), situata vicino alla punta nord-occidentale di Curaçao (Figura 1A), è stato scelto per il campionamento perché è stato già ben studiato e la ecosistema marino in questa località è immersa in acqua di mare fresco nonpolluted 7,15-19. . Due strettamente legate specie di coralli Scleractinia, M. annularis e M faveolata, sono stati scelti per la sperimentazione e l&#39;analisi in questo studio perché ogni specie: (1) mostre nettamente diversi e non sovrapposti distribuzioni batimetriche sul tratto di barriera rispetto alla rottura scaffale e l&#39; ambienti deposizionali carbonato sedimentari associati (gamma annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; figure 1B, 2A, e 2B); (2) è un costruttore quadro barriera corallina comune in tutto il Mar dei Caraibi 21; e (3) ha ben studiato ecologico, fisiologico, e le relazioni evolutive 22. Campo di campionamento per il presente studio è stato condotto utilizzando tecniche standard di immersioni subacquee al largo di Playa Kalki su Curaçao. A poco a profondità batimetriche acqua transetto è stato stabilito che attraversava la mensola, durante la pausa scaffale, e negli ambienti di scogliera anteriori in acque profonde. A quanto pare teste di corallo sano sono stati poi identificati per il campionamento lungo questo transetto batimetrico, tra cui: (1) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. annularis, tutti erano a 5 m di profondità d&#39;acqua (WD); e (2) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. faveolata, tutti erano a 12 m di WD. Fotosinteticamente radiazione attiva (PAR) è stata misurata come 33-36% PAR a 5 m di WD e il 18-22% PAR a 10 m di WD. Il campionamento è stato condotto nel mese di gennaio, quando il SST era 26 ° C alle profondità dell&#39;acqua sia del 5 me 12 m. Ciascuno di questi sei teste di corallo è stato campionamento in triplice copia a posizioni spaziali equivalenti (es., Circa 45 ° N di latitudine su ciascuna delle sei teste di corallo emisferiche). Ogni singolo campione consisteva di un corallo biopsia tessuto di base-scheletro 2,5 centimetri di diametro che è stato raccolto con un pugno arco pulito. Tre biopsie di tessuto-scheletro di corallo sono stati campionati in serie SCUBA con le mani guantate di ciascuna delle teste di corallo (9 da M. annularis colonie a 5 m di WD e 9 da M. faveolata a 12 m WD). Subito dopo la raccolta in profondità, ogni campione biopsia è stata posta in una sterile 50 ml provetta per centrifuga in polipropilene, tappo a vite sigillato, e tornò in superficie. L&#39;acqua di mare è stato decantato da ciascuna provetta per centrifuga e ogni biopsia nucleo è stato poi immerso, immagazzinato e trasportato in paraformaldeide al 4%. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; immagini SBFI è già stato eseguito su una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tutto il cervello e tessuti umani tutto-cuore, embrioni di topo intatti, embrioni di pesce zebra, e diversi tipi di campioni animali con le ossa intatte 23-30. La maggior parte di questi studi utilizzati microscopia ottica / luce sia con fluorescenza o tecniche in campo chiaro. Tuttavia, sono stati condotti studi in ultra-alto ingrandimento con blocco elettronico a scansione seriale volto di imaging nel passato 31. Nel presente studio, un protocollo SBFI modificato è stato sviluppato e applicato alla coralli per la prima volta. Perché M. annularis e M. faveolata polipi corallini sono 1-2 mm di spessore, nessuna delle tecniche di microscopia luce di routine sarebbe in grado di penetrare l&#39;intero spessore del tessuto del corallo polipi. Pertanto, abbiamo SBFI protocollo di preparazione del campione specificamente progettato per i campioni di corallo. Inoltre, abbiamo personalizzato progettato un titolare stereomicroscopio, Che è motorizzato per muoversi in entrambe le direzioni x ed y. Questo apparecchio prende immagini del volto blocco del campione piuttosto che raccogliere le sezioni utilizzando un microtomo regolare davanti al microscopio. Abbiamo anche introdotto un altro ottico a due fotoni tecnica microscopica non lineare per l&#39;immagine degli stessi polipi corallini attraverso l&#39;intero spessore dei tessuti di corallo. Questo supera le limitazioni imposte dalla SBFI in termini di decalcificazione e la possibilità di cambiamenti nella morfologia del tessuto e del volume (contrazione) che possono essere indotte dalla preparazione del campione (disidratazione) e protocolli di trattamento. Inoltre, i profili di emissione dei coralli sono spettralmente risolte per identificare le loro emissioni picchi e variazioni tra i cromatofori e zooxantelle fotosintetica. Questi risultati sono stati valutati nel contesto del metodo utilizzato e loro vantaggi individuali riguardanti tempo di acquisizione, tempi di analisi, e la capacità di risolvere dettagli fini strutturali senza compromettere structural integrità del tessuto del corallo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coral Tissue Skeleton</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>2.5 cm Biopsy from natural habitat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arch Punch Coring Device</td>
			<td>C.S. Osborne and Company</td>
			<td>No. 149</td>
			<td>For Coral biopsy collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15700</td>
			<td>16% Pre-diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear/Safeclear II</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 64111-04</td>
			<td>Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene and Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Richard Allen Scientific</td>
			<td>Type H REF 8338</td>
			<td>Infiltration solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybar</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stearin</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S667-25</td>
			<td>Red Wax-Opaque background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>W32466</td>
			<td>For labeling&#160; Coral Mucus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36095</td>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD-35-100</td>
			<td>For two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Motor, Driver and Controller</td>
			<td>Lin Engineering</td>
			<td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td>
			<td>XY Translational Movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>DC-220</td>
			<td>Melting all wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>DX-600</td>
			<td>Infiltration and Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ASP 300</td>
			<td>Dehydration, Infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2055</td>
			<td>Disposable knifes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stereolumar V 12</td>
			<td>1.5x (30 mm WD) Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope with ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axiovert M 200, ApoTome I System</td>
			<td>Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>MRm</td>
			<td>Monochrome camera 1388x1040 pixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Version 4.8</td>
			<td>Image acquisition program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Photon Laser</td>
			<td>Spectraphysics</td>
			<td>Maitai eHP, pulsed laser (70 fs)</td>
			<td>With DeepSee module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710 with Spectral Detector</td>
			<td>34 channel PMT detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>2010 or above</td>
			<td>for two-photon and spectral image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Suite Software</td>
			<td>Bitplane, Inc.,</td>
			<td>Version 7.0 or above</td>
			<td>3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal optical microscopy methods reveal polyp tissue morphology and structure in caribbean reef building corals

Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare il tridimensionale (3D), morfologia e struttura cellulare dei tessuti polipo che comprende la costruzione di coralli dei Caraibi barriera corallina Montastraea annularis e M. faveolata. Questi approcci includono microscopia a fluorescenza (FM), blocco di serie faccia di imaging (SBFI), e due fotoni laser microscopio confocale a scansione (TPLSM). SBFI fornisce l&#39;imaging dei tessuti profondi dopo il sezionamento fisico; dettaglia la struttura della superficie del tessuto e la visualizzazione 3D per profondità tissutali di più di 2 mm. FM complementare e resa TPLSM immagini ad altissima risoluzione della struttura cellulare dei tessuti. I risultati sono: (1) identificato precedentemente non dichiarata morfologie del tessuto lobate sulla parete esterna dei singoli polipi corallini e (2) ha creato le prime mappe superficiali della distribuzione e del tessuto 3D densità di cromatofori e endosimbionti dinoflagellato alghe zooxantelle-like. Pisello assorbimento spettraleks di 500 nm e 675 nm, rispettivamente suggeriscono che M. annularis e M. faveolata contiene tipi simili di clorofilla e cromatofori. Tuttavia, M. annularis e M. faveolata presentano differenze significative nella densità dei tessuti e la distribuzione 3D di questi componenti cellulari fondamentali. Questo studio incentrato sui metodi di imaging indica che SBFI è estremamente utile per l&#39;analisi di campioni di grandi dimensioni mm scala di tessuti di corallo decalcificata. FM gratuito e TPLSM rivelano sottili cambiamenti di scala submillimeter nella distribuzione cellulare e la densità in campioni di tessuto del corallo nondecalcified. La tecnica TPLSM offre: (1) la preparazione minimamente invasiva del campione, (2) la capacità sezionamento ottico superiore, e (3) l&#39;assorbimento della luce minima e dispersione, pur permettendo l&#39;imaging dei tessuti profondi.

Un apparato SBFI progettato su misura (realizzato appositamente per il presente studio, Figura 3) ha prodotto le prime dettagliate mappe 3D digitali di elevazione (DEM) della struttura della superficie esterna e la morfologia del M. annularis e M. polipi corallini faveolature (Figura 4 e SI Video 1-2). Questo ha prodotto immagini di lobi sovrapposti precedentemente non descritta di tessuto del corallo concentrica irradia verso l&#39;esterno da...

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Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni.

Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

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Research

JoVE Journal

Environment

12.2K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni. 

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

Ottimizzato colorazione negativa: un protocollo ad alta velocità per l&#39;esame di piccole e asimmetrica Protein Structure da microscopia elettronica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Ricerca

Ambiente

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

I metodi di ricampionamento suolo per monitorare i cambiamenti delle concentrazioni chimiche di foresta Suoli

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Building Double-decker Traps for Early Detection of Emerald Ash Borer

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions of forest and landscape ash (Fraxinus spp.) trees. Several artificial trap designs to attract and capture EAB beetles have been developed to detect, delineate, and monitor infestations. Double-decker (DD) traps consist of two corrugated plastic prisms, one green and one purple, attached to a 3 m tall polyvinyl chloride (PVC) pipe supported by a t-post. The green prism at the top of the PVC pipe is baited with cis-3-hexenol, a compound produced by ash foliage. Surfaces of both prisms are coated with sticky insect glue to capture adult EAB beetles. Double-decker traps should be placed near ash trees but in open areas, exposed to sun. Double-decker trap construction and placement are presented here, along with a summary of field experiments demonstrating the efficacy of DD traps in capturing EAB beetles. In a recent study in sites with relatively low EAB densities, double-decker traps captured significantly more EAB than green or purple prism traps or green funnel traps, all of which are designed to be suspended from a branch in the canopy of ash trees. A greater percentage of double decker traps were positive, i.e., captured at least one EAB, than the prism traps or funnel traps that were hung in ash tree canopies.

Effective traps to attract and capture the emerald ash borer (EAB) are a key element of detecting and managing this invasive pest. Double-decker traps, placed in full sun near ash trees, incorporate visual and olfactory cues and were more likely to capture EAB than other trap designs in field trials.

Edificio a due piani trappole per individuazione tempestiva di smeraldo cenere Borer

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindicazione test di idoneità ambiente Stream per giovani d'acqua dolce perla cozze utilizzando metodi di esposizione In Situ

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

Fabbricazione di anisotropo polimerici artificiali Antigen Presenting Cells per l'attivazione delle cellule T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm morphogenesis, that is the structural diversification of biofilms during community assembly, represents a remarkable challenge across spatial and temporal scales. Here, we present an automated biofilm imaging system based on optical coherence tomography (OCT). OCT is an emerging imaging technique in biofilm research. However, the amount of data that currently can be acquired and processed hampers the statistical inference of large scale patterns in biofilm morphology. The automated OCT imaging system allows covering large spatial and extended temporal scales of biofilm growth. It combines a commercially available OCT system with a robotic positioning platform and a suite of software solutions to control the positioning of the OCT scanning probe, as well as the acquisition and processing of 3D biofilm imaging datasets. This setup allows the in situ and non-invasive automated&#160;monitoring of biofilm development and may be further developed to couple OCT imaging with macrophotography and microsensor profiling.

Microbial biofilms form complex architectures at interphases and develop into highly scale-dependent spatial patterns. Here, we introduce an experimental system (hard- and software) for the automated acquisition of 3D optical coherence tomography (OCT) datasets. This toolset allows the non-invasive and multi-scale characterization of biofilm morphogenesis in space and time.

Tomografia a coerenza ottica 3D automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Split Point Analysis and Uncertainty Quantification of Thermal-Optical Organic/Elemental Carbon Measurements

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon (EC). This is commonly accomplished using thermal-optical OC/EC analyzers (TOAs), which enable measurement via controlled thermal pyrolysis and oxidation under specific temperature protocols and within constrained atmospheres. Several commercial TOAs exist, including a semi-continuous instrument that enables on-line analyses in the field. This instrument employs an in-test calibration procedure that requires relatively frequent calibration. This article details a calibration protocol for this semi-continuous TOA and presents an open-source software tool for data analysis and rigorous Monte Carlo quantification of uncertainties. Notably, the software tool includes novel means to correct for instrument drift and identify and quantify the uncertainty in the OC/EC split point. This is a significant improvement on the uncertainty estimation in the manufacturer&#8217;s software, which ignores split point uncertainty and otherwise uses fixed equations for relative and absolute errors (generally leading to under-estimated uncertainties and often yielding non-physical results as demonstrated in several example data sets). The demonstrated calibration protocol and new software tool enabling accurate quantification of combined uncertainties from calibration, repeatability, and OC/EC split point are shared with the intent of assisting other researchers in achieving better measurements of OC, EC, and total carbon mass in aerosol samples.

This article presents a protocol and software tool for the quantification of uncertainties in the calibration and data analysis of a semi-continuous thermal-optical organic/elemental carbon analyzer.

Analisi dei punti divisi e quantificazione dell'incertezza delle misurazioni termo-ottiche del carbonio termico/elementare

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Stima dell'indice dell'area foglia utilizzando tre metodi distinti in stand deciduous puro

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Metodi standardizzati per misurare l'induzione della risposta agli urti di calore in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...