The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

NOTA: E &#39;fondamentale per mantenere condizioni di assenza di RNasi durante l&#39;intera procedura. 1. Adenylation di 3 &#39;Linker <ol><li> Diluire oligonucleotide DNA progettato per le reazioni 3 &#39;legatura a 100 micron di priva di nucleasi H 2 O. NOTA: L&#39;oligonucleotide dovrebbe avere un &#39;gruppo fosfato, un dinucleotide randomizzato al 5&#39; 5 estremità, e un &#39;dideoxycytosine 3. Il 5 &#39;gruppo fosfato è un requisito dell&#39;enzima Mth per un&#39;efficiente 5&#39; adenylation 10. Il fosfato può essere aggiunto un trattamento preliminare del oligonucleotide con un polinucleotide chinasi, o ordinato con la modifica diretta. Il dinucleotide randomizzato all&#39;estremità 5 &#39;è importante per ridurre al minimo la preferenza che ligasi RNA mostre per certo fine-end giunzione reazioni sugli altri 6 sequenza. Il 3 &#39;dideoxycytosine inserisce un elemento di bloccaggio all&#39;estremità 3&#39; estremità del oligonucleotide to inibire la formazione di concatamers linker-linker durante le successive fasi di legatura e serve anche per bloccare &#39;estremità della molecola miRNA-Linker formato alla fine del 3&#39; la reazione di ligazione 11 3. La sequenza di oligonucleotidi linker scelto per il metodo miR-Seq imparziale è la seguente: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montare la seguente reazione adenylation: 200 pmol 3 &#39;oligonucleotide linker, 4 microlitri 10x 5&#39; tampone adenylation DNA, 4 microlitri 1 mM ATP, 4 microlitri Mth RNA ligasi, priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 40 microlitri. </li><li> Incubare la reazione a 65 ° C per 1 ora. Terminare la reazione mediante riscaldamento a 85 ° C per 5 min. </li><li> Precipitare linker adenylated con l&#39;aggiunta di 2,5 volumi di etanolo 100% e 1/3 volume di 10 M di acetato di ammonio per rimuovere ATP residuo e per prevenire legature imprevisti nelle reazioni future. <ol><li> In breve, mescolare il algnato di alcool, sale e soluzione oligo all&#39;omogeneità, filatura a piena velocità in una microcentrifuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C per 20 min. Lavare il precipitato in etanolo al 70%, aria secca, e risospendere in volume appropriato di priva di nucleasi H 2 O per produrre 50-100 micron di oligo adenylated. </li></ol></li><li> Confermare adenylation eseguendo un gel di poliacrilammide al 18%. <ol><li> Preparare il gel miscelando il seguente insieme: 6,3 g di urea, 6,75 ml di 40% acrilammide, e 1,5 ml di 10x TBE. Aggiungi H 2 O a 15 ml. </li><li> Mescolare fino urea è completamente sciolto e aggiungere 150 microlitri al 10% (w / v) di ammonio persolfato (APS) e 15 microlitri tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Una volta che il gel ha impostato, pre-corsa per 30 min a 24 V / cm di larghezza gel con 1x tampone di corsa TBE a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti è da pozzi a filo con tampone di corsa. </li><li> Mescolare 5 pmol di oligonucleotidi adenylated e con uguale volume di tampone di denaturazione 2x RNA di carico (il 95% (v / v) formammide,0,02% (w / v) di SDS, 0,02% blu di bromofenolo (w / v), 0,01% (w / v) Xilene cianolo, 1,0 mM EDTA), portare rapidamente a 75 ° C, e scatto raffreddata su ghiaccio. Dispensare intero campione nel pozzetto del gel. Includere anche un identico ammontare di controllo non adenylated, e gli standard di bassa dimensione peso molecolare. </li><li> Attivare il gel a 24 V / cm fino a quando il blu di bromofenolo è ¾ fino al fondo del gel. Smontare apparecchi, gel post-macchia con soluzione di SYBR-oro 1x a 1x TBE e visualizzare sulla scatola UV-transilluminatore (Figura 2). NOTA: Gel purificare l&#39;oligo adenylated in un modo simile a quello descritto sopra, se &quot;no RNA ingresso&quot; controlli hanno determinato una elevata quantità di prodotto di PCR rispetto ai campioni con ingresso RNA. </li></ol></li></ol> 2. Linker legatura a 3 &#39;Fine di miRNA <ol><li> 3 &#39;legatura <ol><li> Assemblare i seguenti componenti su ghiaccio nell&#39;ordine indicato: 1,0 microlitri 50% (w / v) di PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x tampone RNA ligasi (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ml adenylated 3 &#39;Linker (100 mM), inibitore della RNasi 0,5 microlitri, 0,5-8,0 mg di RNA totale, 0,5 microlitri RNA ligasi T4 2, priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 5 microlitri. </li><li> Mescolare la reazione pipettando la soluzione è troppo viscoso a vortice causa dell&#39;elevata concentrazione di PEG 8000. Una volta accuratamente miscelati, posizionare la reazione in un termociclatore con un coperchio riscaldato. Impostare il blocco a 16 ° C, e incubare per 4 ore. NOTA: La reazione può essere scalata fino ad un volume finale di 20 ul senza alcuna perdita di efficienza legatura. Reagire per 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C per produrre efficienze legatura sostanzialmente identici. </li></ol></li><li> Gel Purificazione <ol><li> Dopo 3 &#39;legatura, mescolare la reazione con un volume uguale di tampone di caricamento 2x RNA. Riscaldare a 70 ° C per 5 min e scatto raffreddare su ghiaccio. </li&gt; <li> Eseguire il campione su un gel di poliacrilammide al 15% per la purificazione PAGE. <ol><li> Preparare un gel di poliacrilammide al 15% contenente 7 M urea, in modo simile a quello descritto in precedenza al punto 1.5. </li><li> Pre-eseguire il gel a 24 V / cm di larghezza gel per almeno 30 min. Spegnere l&#39;alimentazione elettrica, pozzi a filo, campione del carico e gel di corsa a stessa tensione pre-run. </li><li> Caricare il campione e eseguire la pagina fino a quando il blu di bromofenolo è appena uscito il gel. Il prodotto desiderato migrerà vicino al cyanol xilene. </li></ol></li></ol></li><li> Colorazione, visualizzazione, e l&#39;escissione <ol><li> Smontare apparecchi gel e posto gel in vassoio pulito con 1x tampone di corsa (TBE), 1x SYBR-oro, e di roccia per 15 min. </li><li> Rimuovere il gel dal piatto macchie e visualizzare su scatola transilluminatore UV coperta con pellicola trasparente pulito. Il prodotto legatura dovrebbe essere di circa 45 nucleotidi di lunghezza. </li><li> Accise la regione contenente il prodotto con una legatura Razo pulitolama r e il luogo in 0,5 ml di tubo di micro-centrifuga. </li></ol></li><li> Isolamento del prodotto e Precipitazioni <ol><li> Pierce fondo della provetta da 0,5 ml microcentrifuga con un ago da 30 G e posizionare il tubo forato in un secondo pulita, a bassa ritenzione, 1,5 ml provetta. Centrifugare per 5 minuti a ~ 15.000 x g. </li><li> Visivamente che l&#39;intera fetta del gel è spostato attraverso il foro nel tubo interno. Se necessario, usare un puntale pulito per spingere alcuni frammenti di gel più vicino alla buca. </li><li> Smaltire il tubo vuoto 0,5 ml e aggiungere 400 ml di alto contenuto di sale tampone colonna (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% SDS) per il liquame acrilamide. Tubo di roccia (s) a 4 ° C per una notte. </li><li> Trasferimento liquami di una colonna di spin acetato di 0,22 micron di cellulosa con un puntale ampio tunnel. Centrifugare per 3 minuti a temperatura ambiente a ~ 15.000 xg per raccogliere tutto il liquido dalla matrice di gel di acrilammide. </li><li> Trasferire il liquido di un ambiente pulito, bassa ritenzione, provetta da 1,5 ml contieneing 1 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Aggiungere un uguale volume di isopropanolo e 1/10 di volume di acetato di sodio. Miscelare soluzione capovolgendo tubo più volte il precipitato in -80 ° C freezer per 20 min. </li><li> Centrifugare a piena velocità a 4 ° C per 20 minuti per far sedimentare l&#39;acido nucleico. Rimuovere il surnatante e lavare in etanolo al 70%. Aria pellet secco per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere direttamente al 5 &#39;passo legatura. </li></ol></li></ol> 3. Linker legatura a 5 &#39;Fine del miRNA-3&#39; Linker Hybrid <ol><li> Per l&#39;acido nucleico in granuli, aggiungere i seguenti componenti: 2 microlitri PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ml 10x RNA Ligase Buffer, 0,5 microlitri ATP (10 mM), 0,5 microlitri NN-RNA oligo (100 mM), e H 2 O ad un volume finale di 4 microlitri. NOTA: La composizione del &#39;NN-RNA oligo&#39; è il seguente 5&#39;-invertita dideossi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 &#39;ed è stato purificato tramite HPLC dal costruttore. </li><li> Mescolarequesto campione pipettando su e giù più volte. Fare questo per un certo tempo (fino a 5 minuti) per garantire che il pellet è stato completamente ri-solubilizzati. Se ri-solubilizzazione è problematico, riscaldare brevemente campione (3-5 min) a 37 ° C e riprendere pipettaggio mescolare. </li><li> Una volta che il pellet è tornato in soluzione, trasferire il contenuto in una provetta pulita PCR contenente 1 ml di una miscela 1: 1 di inibitore della RNasi e T4 RNA ligasi 1 (5 unità). Anche in questo caso mescolare pipettando su e giù. </li><li> Incubare la reazione in un termociclatore a 37 ° C per 4 ore. Procedere immediatamente alla sintesi del DNA. </li></ol> 4. trascrizione inversa / cDNA Synthesis <ol><li> Aggiungere i seguenti componenti al 5 &#39;reazione Legatura: 2 microlitri di buffer 5x RT, 0,75 ml 100 mM DTT, 1 ml Illumina RT Primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39; (1 micron), e 0,5 microlitri dNTP (10 mm). </li><li> Mescolare pipettando e calore a 65 ° C per 5 min. Poi raffreddare lentamente in panchina top. </li><li> Una volta che la reazione è raffreddata a temperatura ambiente, il tubo posto su ghiaccio e aggiungere 0,5 ml ciascuno di enzima trascrittasi inversa e inibitori RNasi. Mescolare pipettando e posto in termociclatore per la fase di estensione indicato nelle istruzioni del produttore. </li><li> Una volta completato Aggiungere 5 ml di priva di nucleasi H 2 O per portare il volume finale della libreria di cDNA fino a 15 ml. </li></ol> 5. Biblioteca Preparazione <ol><li> Per l&#39;indicizzazione PCR, montare la seguente reazione su ghiaccio: 6 ml 5x Phusion Buffer, 1 microlitri dNTP (10 mm), 0,9 ml di DMSO, 0,75 ml 5 &#39;Primer (25 micron), 0,75 ml 3&#39; Primer (25 micron), biblioteca 3 microlitri di cDNA (concentrazione variabile a seconda della quantità di input), 0,5 ml Phusion Polymerase (1 unità), priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 30 ml. Scegli le sequenze dei primer per garantire la compatibilità con il modello e la piattaforma di sequenziamentoscelta. <ol><li> Eseguire la reazione di PCR con le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale a 98 ° C per 3 minuti, per i primi 4 cicli, denaturare 98 ° C per 15 sec, ricottura a 50 ° C per 15 sec, estendere a 72 ° C per 15 sec . NOTA: A seconda della quantità del materiale in ingresso, variare il totale numero di cicli di PCR. Tipicamente, per un ingresso di 1-2 mg di RNA totale, 13 cicli di PCR in totale sono sufficienti a generare la libreria miR-Seq. </li><li> Effettuare cicli successivi, ad esempio, cicli 5-12, in un modo a due fasi in cui i cicli di ricottura e di estensione sono combinati e effettuate a 70 ° C per 30 sec e la denaturazione è ancora 98 ° C per 15 sec. NOTA: Il volume di reazione è di 30 ml per consentire una pausa il programma PCR e rimuovere una aliquota di 10 ml al numero di cicli predeterminati per monitorare l&#39;aspetto del prodotto desiderato. Tipicamente, i cicli di 10, 13, e 16 sono scelti per il test di un campione di RNA totale. </li></ol></li><li> Preparareun 8% non denaturante acrilamide gel miscelando 2 ml di 40% acrilammide, 1 ml di 10x TBE, e H 2 O a 10 ml. Quindi aggiungere 100 ml di 10% di APS e 10 ml di TEMED. Versare il gel e lasciare set. <ol><li> Pre-eseguire il gel a 12 V / cm di larghezza gel per 30 min. Pozzi a filo. Aggiungere 1 ml di 10x tampone di caricamento (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1% (w / v) di SDS, 0,01% (w / v) di blu di bromofenolo), aggiungere 10 ml di campione a ciascun pozzetto di dimensioni 5 millimetri x 1 mm x 15 mm. In genere, ogni bene può caricare fino a 30 ml di campioni. Eseguire il gel campione a 10 V / cm di larghezza gel 1x tampone TBE finché il colorante blu di bromofenolo appena esaurisce il fondo del gel. </li><li> Colorare e visualizzare il gel come descritto al punto 2.3. </li><li> Accise la coppia di banda di 146 base e eluire durante la notte in 0,25 ml di HSCB in modo simile a quanto descritto nella sezione 2.4. Precipitare il DNA in un uguale volume di isopropanolo e 1/10 di volume di acetato di sodio. Lavare pellet nel 70% eTHANOL e risospendere in tampone TE. </li><li> Quantificare la libreria utilizzando PicoGreen secondo le raccomandazioni del produttore. </li></ol></li></ol>

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	<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).</li><li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ENCODE+(ENCyclopedia+Of+DNA+Elements)+Project.">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li><li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling.">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).</li><li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction.">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3&#8242;-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3&#8242;-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li><li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA.">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development.">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li><li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs.">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

La metodologia qui descritta si avvale di diverse variabili chiave per massimizzare l&#39;efficienza di legatura, ovvero alte concentrazioni di PEG, l&#39;uso di linker randomizzati, e alta concentrazione di linker 2,6,9. Questo approccio permette di librerie di sequenziamento in modo affidabile quantitativi di campioni di RNA totale di 2. Abbiamo condotto molteplici titolazioni di ingresso RNA e hanno concluso che il metodo precedente è più adatto per importi totali di RNA nel range 1-8 mg (dati...

Metodologie basate High-throughput sequencing sono stati ampiamente applicati a molti campioni biologici negli ultimi anni notevolmente ampliando la nostra comprensione della complessità molecolare dei sistemi biologici 3,4. Tuttavia, la preparazione di campioni di RNA per high-throughput sequencing conferisce spesso pregiudizi specifici inerenti alla metodologia utilizzata, che limitano la potenziale utilità di queste tecniche potenti. Questi pregiudizi metodo specifico sono stati ben documentati per la base di legatura-piccolo-RNA preparati biblioteca 1,2,5,6. Questi pregiudizi in una modifica di 1000 volte in legge dei numeri per miRNA sintetici equimolari, facendo inferenza di miRNA abbondanza di dati di sequenziamento selvaggiamente variabile e soggetto a errori. Gli studi si concentrano sulle proprietà di T4 ligasi RNA fago-derivati ​​hanno documentato che gli enzimi mostrano preferenze di base nucleotide-7, che si manifestano come le biblioteche di parte negli esperimenti di sequenziamento high-throughput <sup&gt; 1,2,8. Per minimizzare le distorsioni impartite dalla RNA ligasi, molteplici strategie sono state impiegate; macromolecolare affollamento 9, randomizzare la sequenza nucleotidica sull&#39;adattatore che è prossimale al sito legatura 6, e utilizzando alte concentrazioni di adattatore legatura 2. Attraverso una combinazione di questi tre approcci abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per la preparazione imparziale di piccole librerie di RNA compatibili per high-throughput sequencing (Figura 1). Per i confronti diretti tra i protocolli correnti e il nostro metodo ottimizzato, si prega di fare riferimento al nostro recente rapporto 2. Questo metodo ottimizzato produce efficienze di legatura superiore al 95% sia a 3 &#39;e 5&#39; passi e permette la legatura imparziale di piccole molecole di RNA da campioni sintetici e biologici 2.

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

Mirna clonazione e high-throughput sequencing, chiamati miR-Seq, si trova solo come un approccio a livello di trascrittoma per quantificare miRNA con risoluzione di singolo nucleotide. Questa tecnica cattura miRNA collegando adattatori 3 &#39;e 5&#39; oligonucleotide alle molecole miRNA e permette la scoperta de novo miRNA. Accoppiamento con potenti piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, miR-Seq è stato determinante per lo studio della biologia miRNA. Tuttavia, distorsioni significative introdotte dal oligonucleotide passi legatura hanno impedito miR-Seq da essere impiegato come strumento di quantificazione accurata. Studi precedenti hanno dimostrato che i pregiudizi in attuali metodi di miR-Seq spesso portano a inesatte miRNA quantificazione di errori fino a 1.000 volte per alcuni miRNA 1,2. Per risolvere questi pregiudizi impartite dalla RNA legatura, abbiamo sviluppato un piccolo metodo di legatura RNA che si traduce in efficienza legatura di oltre il 95% sia per la 3 &#39;e 5&#39; passi legatura. Benchmarking questo imdimostrato metodo di costruzione libreria utilizzando miRNA sintetici equimolare o differenziale misti, produce sempre legge i numeri con deviazione inferiore a due volte rispetto al valore atteso. Inoltre, questo metodo ad alta efficienza miR-Seq permette accurate genome-wide miRNA profiling dall importo totale di campioni in vivo di RNA 2.

I risultati attesi per il metodo precedente dovrebbe inizialmente essere l&#39;osservazione di un solo turno nucleotide (aumento) delle dimensioni del oligonucleotide DNA che è stato oggetto di adenylation da Mth RNA ligasi (Figura 2). Dopo 3 &#39;legatura, visualizzazione del gel di acrilammide indica (vedi Figura 3) taglienti alte bande peso molecolare evidenti nella regione di 100-300 nucleotidi del gel. Ciò indica che il campione di RNA totale utilizzato è di alta qualit...

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

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Biology

11.8K Views.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

Video: Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Ricerca

Bioingegneria

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Genetica

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biochimica

Analisi della dinamica del tRNA con AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autore in primo piano: Ruolo di AQRNA-seq nella mappatura di piccoli RNA e nel disfacimento dei meccanismi di traduzione delle proteine

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

Riepilogo

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Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

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Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

Identificazione di RNA impegnati nell'interazione diretta RNA-RNA con un RNA lungo non codificante

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA