Il progetto descritto è stato supportato da Award numero R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) del National Institute of Mental Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiali dell&#39;Istituto Nazionale di Salute Mentale o il National Institute of Health.

Il protocollo che segue descrive la procedura standard per isolare RNA da CSF e di profilo microRNA utilizzando piastre PCR pronti. Si noti che l&#39;estrazione fase organica è facoltativo, e che un RNA carrier viene aggiunta al campione durante l&#39;estrazione garantire massimo recupero di RNA. Di conseguenza, non vi è alcuna necessità di quantificare l&#39;RNA. Nel complesso, una media di 6-8 piastre può essere eseguito in un giorno se il cDNA viene sintetizzato il giorno prima (circa 2 ore). L&#39;analisi dei dati viene eseguita quando tutti i campioni sono stati profilato e caricato nel software. A seconda del numero di campioni / gruppi o loro combinazione per il confronto, l&#39;analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. 1. RNA Estrazione L&#39;estrazione di RNA è stata eseguita da campioni di CSF, congelati a -80 ° C in aliquote fino all&#39;analisi. Per questa procedura è stato utilizzato il kit di isolamento Mirvana Parigi, seguendo strumento del produttoreZIONI per l&#39;isolamento di RNA totale. Si prega di notare che, sebbene l&#39;arricchimento per le piccole specie di RNA è possibile con questo kit, questo passaggio non è stato fatto e la procedura di estrazione RNA è conclusa dopo la fase di totale isolamento di RNA. Inoltre, sebbene il kit di isolamento Mirvana Parigi (come altri kit di isolamento dell&#39;RNA disponibili in commercio) non richiede estrazione organico, un protocollo per questa procedura sono disponibili sotto. Il protocollo per l&#39;estrazione dell&#39;RNA consiste di due fasi: 1.1. Estrazione biologico (non necessario se si utilizza Mirvana Parigi kit di estrazione RNA) 1.2.2. Isolamento RNA totale 1.1. Estrazione Organic 1.1.1. Preparare i reagenti <ol><li> Aggiungere 375 ml di 2-mercaptoetanolo a 2x Denaturing soluzione, e conservarlo a 4 ° C. </li></ol> 1.1.2. Preparare il CSF <ol><li> Scongelare ogni aliquota di CSF sul ghiaccio prima dell&#39;estrazione dell&#39;RNA. Aggiungere 1 mg di carrier RNA MS2 a 0,5 ml di liquor scongelato e delicatamentemescolare. Si noti che se l&#39;estrazione organica viene omesso, il vettore MS2 sarà aggiunto al campione prima dell&#39;isolamento dell&#39;RNA descritto in 1.2.2.1 seguito. </li><li> Mescolare 0,5 ml di 2x denaturazione soluzione a temperatura ambiente al CSF. </li><li> Aggiungere 1 ml di acido-fenolo: cloroformio al CSF più il 2x denaturazione Soluzione: assicurarsi di ritirata la fase inferiore contenente acido-fenolo: cloroformio, non il tampone acquoso che si trova sulla parte superiore della miscela. Inoltre, si noti che l&#39;acido-fenolo: cloroformio contiene fenolo, che è un veleno e un irritante, usare guanti ed altri dispositivi di protezione individuale quando si lavora con questo reagente. </li><li> Vortex per 30-60 secondi per mescolare. Per comodità, i 2 ml di campione / denaturazione soluzione / acido-fenolo: cloroformio mix sono divisi in due provette Eppendorf da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a velocità massima (10.000 xg) a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione la fase acquosa (superiore) senza disturbare la fase inferiore o interfase e trasferirlo in unprovetta. Annotare il volume recuperato. </li></ol> 1.2. Isolamento dell&#39;RNA Si raccomanda di avere un banco dedicato, set di pipette e rastrelliere per la gestione di campioni di RNA. L&#39;area di lavoro e gli strumenti sono decontaminati mediante RNasi Zap spray e salviette prima di ogni esperimento. 1.2.1. Preparare i reagenti: <ol><li> Aggiungere 21 ml di etanolo al 100% miRNA Soluzione di Lavaggio 1 e 40 ml di etanolo al 100% di soluzione di lavaggio 2/3. Si prega di notare che il miRNA soluzione di lavaggio 1 contiene guanidio thiocyanate che è una sostanza potenzialmente pericolosa. </li></ol> 1.2.2. Isolamento RNA totale <ol><li> Aggiungere 1,25 volumi di temperatura ambiente 100% di etanolo alla fase acquosa dall&#39;estrazione organica e mescolare accuratamente. </li><li> Posizionare una cartuccia filtrante in uno dei tubi di raccolta. </li><li> Pipette non più di 700 ml di miscela lisato / etanolo sulla cartuccia del filtro. </li><li> Centrifugare per 30 secondi alla massimavelocità. Applicare la miscela superiore 700 microlitri nelle applicazioni successive allo stesso filtro. Gettare il flow-through dopo ogni centrifugazione e salvare il tubo di raccolta per le fasi di lavaggio. </li><li> Applicare 700 microlitri miRNA Wash Solution 1 alla cartuccia del filtro e centrifugare per 15 secondi alla massima velocità. Gettare il flusso attraverso dal tubo di raccolta e sostituire la cartuccia del filtro nello stesso tubo di raccolta. </li><li> Applicare 500 microlitri soluzione di lavaggio 2/3 e centrifugare per 15 secondi alla massima velocità. Gettare il flusso attraverso dal tubo di raccolta e sostituire la cartuccia del filtro nello stesso tubo di raccolta. Applicare un secondo da 500 microlitri soluzione di lavaggio 2/3 e centrifugare per 15 secondi alla massima velocità. Gettare il flusso attraverso dal tubo di raccolta e sostituire la cartuccia del filtro nello stesso tubo di raccolta. Spin il gruppo per 1 min a velocità massima per rimuovere residui di liquido dal filtro. </li><li> Trasferire la cartuccia del filtro in un tubo di raccolta fresca. Applicare 100 &amp; mu; L preriscaldata (a 95 ° C) acqua priva di nucleasi al centro del filtro, e chiudere il tappo. Centrifugare per 30 secondi a velocità massima per recuperare il RNA. </li><li> Raccogliere l&#39;eluato contenente RNA e conservarlo a -80 ° C per le applicazioni successive. </li><li> Quantificare 1 ml di RNA utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop 2000C. Si noti che la quantificazione RNA può essere saltata se un vettore RNA viene aggiunta al campione durante l&#39;estrazione di RNA. In tal caso 8 pl di RNA sono sottoposti a sintesi di cDNA come descritto di seguito. </li></ol> 2. miRNA Profilo: qRT-PCR Protocol Il protocollo per miRNA profiling consiste di due fasi: <ol><li> First-strand sintesi del DNA </li><li> Real-time PCR di amplificazione </li></ol> 2.1. First-strand sintesi del DNA 2.1.1. Diluire stampo di RNA <ol><li> Regolare ciascuno dei campioni di RNA template ad una concentrazione di 5 ng / ml con acqua nucleasi gratuito. Se l&#39;RNA non è stato quantificato (vedere fase 1.2.2.9), poi 8 pl di RNA sono utilizzati per la sintesi di cDNA </li></ol> 2.1.2. Preparare i reagenti <ol><li> Scongelare delicatamente il tampone di reazione 5x e nucleasi acqua libera, e mettere immediatamente in ghiaccio. </li><li> Mescolare nel vortex. Risospendere il RNA spike-in con l&#39;aggiunta di acqua priva di 40 microlitri di nucleasi al tubo e mescolare nel vortex, lasciare in ghiaccio per 15-20 min. Immediatamente prima dell&#39;uso, rimuovere il mix enzima dal freezer, mescolare sfogliando le provette e disporli sul ghiaccio. Spin giù tutti i reagenti. </li></ol> 2.1.3. Configurazione inversa reazione di trascrizione <ol><li> Preparare la quantità richiesta di soluzione di lavoro RT in una provetta Eppendorf da 1,5 ml o equivalente (nelle proporzioni indicate nella Tabella 1, tranne per il modello RNA), mescolare nel vortex (1-2 sec max velocità), brevemente centrifugare ( usiamo un mini Eppendorf centrifuga con velocità fissa, 10 sec) e posizionarlo sul ghiaccio. Si noti che l&#39;RNA picco UniSp6-In viene aggiunto al campione prima della reazione RT (vedi Tabella 1). </li><li> Dispensare soluzione di lavoro RT in provette PCR priva di nucleasi. </li><li> Pipettare stampo di RNA in ciascun tubo. Nota: ricordatevi di calcolare il 10% di volume in eccesso / ogni reagente per pipettaggio e / o volume morto robotica. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Panel I Volume (ml) </td><td> Panel I + II Volume (ml) </td></tr><tr><td> Tampone di reazione 5x </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Acqua nucleasi libero </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> Mix enzimatico </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA Spike-in template </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Template RNA totale (5 ng / ml) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Volume totale </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Invertire la configurazione reazione di trascrizione. </li></ol> 2.1.4. Mescolare e far girare i reagenti <ol><li> Mescolare la reazione delicatamente (1-2 sec) vortex per assicurare che tutti i reagenti siano ben amalgamati. Dopo la miscelazione, spin down (mini centrifuga Eppendorf con velocità fissa, 10 sec). </li></ol> 2.1.5. Incubare e inattivare a caldo <ol><li> Programmare una macchina PCR come segue: </li><li> Incubare per 60 min a 42 ° C </li><li> Calore inattivare la trascrittasi inversa per 5 minuti a 95 ° C </li><li> Immediatamente raffreddare a 4 ° C </li><li> Conservare a 4 ° C o congelare Nota: il protocollo può essere interrotto in questa fase. Il cDNA diluito può essere conservato a -20 ° C per 5 settimane (negozio opzionale a 4 ° C per 4 giorni). </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. Real-time PCR di amplificazione 2.2.1. Preparare i reagenti per Real-time PCR <ol><li> Posizionare cDNA (dal punto 2.1.5) sul ghiaccio. </li><li> Scongelare acqua libera e PCR Master mix nucleasi sul ghiaccio. Proteggere le fiale master mix per PCR dalla luce coprendoli con un foglio di alluminio. Immediatamente prima dell&#39;uso, mescolare la miscela master PCR vortex 1-2 secondi in una mini centrifuga e centrifugare a 1500 xg per 1 min. </li></ol> 2.2.2. Combina SYBR Green Master Mix, acqua e cDNA e aggiungere piastre PCR La seguente procedura è consigliata per evitare basse concentrazioni di cDNA di aderire alla superficie del tubo: <ol><li> Prima di rimuovere il sigillo piastra, brevemente centrifugare la piastra (s) in una centrifuga refrigerata a 1.500 xg per 1 min. </li><li> In un tubo da 15 ml, unire 2x PCR miscela master e acqua. Panel I: 2,000 microlitri 2x master mix e 1980 microlitri di acqua; Panel I + II: 4,000 microlitri 2x master mix e 3960 μ, L acqua. </li><li> Aggiungere 20 microlitri di cDNA (pannello I) o 40 microlitri di cDNA (pannello di I + II) e mescolare. </li><li> Mescolare delicatamente vortex 1-2 sec e spin down in una centrifuga refrigerata a 1.500 xg per 1 min. </li><li> Posizionare la PCR Master mix / cDNA mix in una pipetta multicanale serbatoio. Potrebbe essere necessario identificare un serbatoio che ha la lunghezza della pipetta multicanale. Ciò mantiene il livello di volume di abbastanza alto consentendo aliquote volume uguale in tutto il multicanale. Questo è critico verso gli ultimi aliquote. </li><li> Pipettare 10 microlitri miscela master PCR / cDNA miscela in ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti usando una pipetta a 16 canali. </li><li> Sigillare la piastra con guarnizione ottica. </li><li> Spin piastra brevemente in una centrifuga refrigerata (1.500 xg per 1 min), per mescolare le soluzioni e rimuovere le bolle d&#39;aria. Nota: l&#39;esperimento può essere sospeso, a questo punto. Conservare le reazioni al riparo dalla luce a 4 ° C per un massimo di 24 ore. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Eseguire real-time PCR amplificazione e analisi della curva di melting secondo i parametri descritti nella tabella 2. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fase del processo </td><td> Impostazioni, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polymerase Attivazione / denaturazione </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Amplificazione </td><td> 45 cicli di amplificazione a 95 ° C, 10 sec 60 ° C, 1 min Ramp-rate 1,6 ° C / sec Lettura ottica </td></tr><tr><td> Melting analisi della curva </td><td> Sì </td></tr></tbody></table> Tabella 2. In tempo reale le condizioni del ciclo di PCR utilizzando la Roche LightCycler 480. 2.3. Analisi in tempo reale dei dati di PCR In tempo reale analisi dei dati PCR è fatto con l&#39;Exiqon GenEx Professional 5.0, a seguito di tha raccomandato istruzioni. Il manuale GenEx step-by-step può essere scaricato all&#39;indirizzo <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> L&#39;analisi dei dati è costituito da tre fasi: <ol><li> Importazione di dati </li><li> Pre-elaborazione dei dati </li><li> L&#39;analisi statistica </li></ol> 2.3.1. Importazione di dati <ol><li> Nel Roche LightCycler 480 selezionare il metodo di analisi nd derivato 2 e calcolare i valori Cq. I dati vengono esportati come un tavolo e salvati come file di testo. </li><li> Per importare i dati, aprire GenEx e fare clic sul pulsante di importazione guidata Exiqon e fare clic su &quot;Start&quot;. Seguire le istruzioni per selezionare il formato, strumento e file di layout di piastra (s). Si noti che i file di layout piastra (file excel) vengono scaricati dal sito web Exiqon ( <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import Pannelli I e II e fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> La tabella generata dopo file di importazione contiene colonne predefinite. I nomi dei campioni possono essere modificati e le colonne di classificazione possono essere aggiunti o rimossi in questa fase. Fare clic su &quot;Next&quot; quando avete finito. </li><li> Salvare i dati e caricare Editor dei dati. </li></ol> 2.3.2. Pre-elaborazione dei dati <ol><li> Come raccomandato dal Exiqon e GenEx, quando si confrontano più lastre la prima cosa da fare è quella di calibrare i dati tra le piastre scegliendo calibrazione inter-piastra dal menu pre-elaborazione. </li><li> Si raccomanda di eseguire le matrici miRNA nei funzionamenti triplicato. Se un miRNA non è presente in almeno due delle tre repliche sarà impostato come nonexpressed. </li><li> Nella fase successiva nella pre-elaborazione, impostare un cut-off. Definizione di un valore di cut off indica che i dati con un ciclo soglia (C t) superiore a questo valore vengono scartati. Nel presente esperimenti usando campione di fluido cerebrospinale, la off taglio è stato fissato a 39. Cirima, verranno eliminati tutti i campioni con C t superiore a 39 nelle tre repliche. Se un miRNA ha un C t&gt; 39 per una sonda (una replica su tre), che la lettura verrà sostituito con la media del C t per le altre due sonde, a condizione che siano entrambi sotto 39. </li><li> Definire geni di riferimento. GenEx Professional ha la possibilità di utilizzare geNorm e / o NormFinder per identificare i geni di riferimento. Selezionare una lista di miRNA che hanno valori simili Cq in tutti i campioni e corrono geNorm e / o NormFinder. Secondo questa analisi, nell&#39;esempio fornito qui, miR-622 e miR-1266 avevano valori più uniformi per i vari campioni e sono stati scelti come geni di riferimento (Figura 1). </li><li> Successivamente, i dati vengono normalizzati utilizzando i geni di riferimento ei valori ottenuti corrispondono alla ΔC t </li><li> Se reazioni di sintesi di cDNA sono stati eseguiti in triplicato, a questo punto i valori devono essere mediate. </li><li> Convalida foglio di rispostare le colonne vuote e quasi vuote. Nella finestra di pre-elaborazione selezionare &quot;Convalida patrimoniale&quot; e di applicare sulla Remove colonne vuote linea. Nella riga sotto, ha scelto la percentuale desiderata di dati validi e fare clic su Applica. Ad esempio, selezionare 100%, se si vuole confrontare solo miRNA comuni a tutti i campioni. </li><li> Gestire i dati mancanti. Selezionare &quot;dati mancanti&quot; dal menu Preprocessing e ha scelto una delle opzioni per gestire i dati mancanti. Questo passaggio è necessario. Si noti che GenEx vi darà errore se si tenta di caricare file che contengono dati mancanti non gestite. </li><li> Determinare la quantificazione relativa tra gruppi di campioni (per esempio. Esperimento rispetto al controllo). La quantificazione relativa tra i gruppi è calcolato utilizzando il metodo t ΔΔ C. In GenEx, fare clic sulla scheda di pre-elaborazione e selezionare quantificazione relativa. Nella finestra selezionare il gruppo di riferimento e premi applica. Si noti che per rappresentazioni grafiche e / o per ulteriori analisi statistiche, exprdati essione devono essere convertiti in una scala logaritmica. Nel menu di pre-elaborazione, selezionare log2. </li></ol> 2.3.3. Analisi statistica Software GenEx consente una vasta gamma di analisi statistiche, incluse T-test e ANOVA. <ol><li> Caricare il file mdf finale in GenEx e responsabile dei dati aperti. E &#39;fondamentale per selezionare i campioni o gruppi corretti di campioni per cui è eseguita l&#39;analisi statistica. </li><li> Selezionare &quot;Statistiche&quot; e scegliere l&#39;icona corrispondente alla prova desiderata. </li><li> Fare clic su &quot;Esegui&quot; nella finestra del pannello di controllo. Salvare i risultati come file Excel o mdf. </li></ol> 2.3.4. Profili di espressione I microRNA e campioni possono essere classificati, raggruppati e visualizzati sul calore mappe e dendrogrammi, come segue <ol><li> Caricare il file mdf finale in GenEx e responsabile dei dati aperti. Utilizzare questa finestra per selezionare e creare gruppi di campioni o miRNA. Fare clic su &quot;Applica&quot; quando hai finito. </li> &lt;li&gt; In alto a sinistra, selezionare grappolo superiore e fare clic sull&#39;icona heatmap </li><li> Nella finestra Pannello di controllo cliccare su &quot;Esegui&quot;. Il heatmap può essere salvato in vari formati come tiff o bmp, ma può anche essere copiato e modificato in base alle esigenze. </li></ol>

<ol>
	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

MicroRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l&#39;espressione genica inibendo la traduzione e / o la promozione di degradazione dell&#39;mRNA 2. Grazie alla loro elevata stabilità in condizioni cell-free, microRNA sono stati rilevati in molti fluidi corporei. Inoltre, il profilo di espressione dei microRNA distinta è stata correlata con la fase e / o la progressione in una varietà di tumori umani 3-9. Ci sono diversi strumenti a disposizione al profilo mic...

MicroRNAs appartengono alla famiglia di piccole dimensioni (21-23 nt in lunghezza) RNA non codificanti che regolano l&#39;espressione genica post-trascrizionale. microRNA possono essere secreti nello spazio extracellulare dove sembrano essere relativamente stabile. Mentre determinare cambiamenti nell&#39;espressione miRNA può essere un passo importante verso l&#39;identificazione di biomarcatori, eseguire profili miRNA e gestire una grande quantità di dati può essere intimidatorio. Qui, descriviamo un protocollo per determinare cambiamenti nell&#39;espressione miRNA nel liquido cerebrospinale (applicabile ad altri fluidi corporei) da un tempo reale sensibili PCR. Noi descriviamo anche l&#39;uso di software per l&#39;analisi dei dati, compresa l&#39;analisi statistica e rappresentazione grafica dei risultati. L&#39;intera procedura è relativamente semplice e lineare e, a seconda del numero di campioni da analizzare e il numero di macchine di PCR in tempo reale disponibili, anche relativamente veloce. La parte sperimentale richiede precisione nella movimentazioneRNA e pipettaggio in piastre da 384 pozzetti, mentre la sezione di analisi dei dati utilizzando GenEx richiede alcune conoscenze di base in informatica e statistica.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> MicroRNA (miRNA) costituiscono uno strato potente di regolazione genica guidando RISC a bersaglio siti posizionati su mRNA e, di conseguenza, modulando la loro repressione traduzionale. Cambiamenti nell&#39;espressione miRNA hanno dimostrato di essere coinvolti nello sviluppo di tutte le principali malattie complesse. Inoltre, recenti scoperte hanno mostrato che i miRNAs possono essere secrete nell&#39;ambiente extracellulare ed entrano nel flusso sanguigno e altri fluidi corporei dove possono circolare con elevata stabilità. La funzione di tale microRNA circolanti rimane in gran parte sfuggente, ma approcci sistematici ad alto rendimento, come miRNA array profiling, hanno portato all&#39;identificazione di firme miRNA in diverse condizioni patologiche, tra cui le malattie neurodegenerative e alcuni tipi di tumori. In questo contesto, l&#39;identificazione di miRNA profilo di espressione nel fluido cerebrospinale, come riportato nel nostro studio recente, rende miRNA candidati interessanti per analisi biomarker. _content &quot;&gt; Ci sono diversi strumenti disponibili per il profiling microRNA, come microarrays, quantitativa real-time PCR (qPCR), e sequenziamento profondo. Qui, descriviamo un metodo sensibile al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale dal quantitativa real-time PCR. noi utilizzato i pannelli umani Exiqon microRNA pronti per l&#39;uso PCR I e II V2.R, che consente il rilevamento di 742 unici microRNA umani. Abbiamo eseguito gli array in un parchetto in triplicato e abbiamo elaborato e analizzato i dati utilizzando il software GenEx Professional 5. Usando questo protocollo, abbiamo profilato successo microRNA in vari tipi di linee cellulari e cellule primarie, CSF, plasma e tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina.

I risultati di questo studio sono stati pubblicati in precedenza 1. Figura 1 mostra i risultati dell&#39;analisi dei microRNA riferimento candidati usando l&#39;applicazione di geNorm. Di conseguenza, due microRNA, miR-622 e miR-1266, sono stati identificati i geni di riferimento e sono stati usati per normalizzare i valori di miRNA. Per lo studio QCS avevamo tre gruppi di campioni: da HIV (n = 10), HIVE (n = 4), e l&#39;HIV +, senza encefalite (...

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Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l&#39;eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Views.  LSU Health Sciences Center.  Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto. 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Ricerca

Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Movimento Riqualificazione con feedback in tempo reale delle prestazioni

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

In tempo reale a raggi X Imaging del polmone volumi di fluido in neonatale topo polmone

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...