Vorremmo ringraziare il Dr. Guo-Sabrina Hung e Dr. Bharatkumar Joshi per i preziosi commenti che il manoscritto è migliorato.

Tutti gli esperimenti condotti in questi studi sono stati effettuati secondo protocolli approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali presso la struttura di ricerca di Food and Drug Administration (FDA).
1. isolamento e coltura di fibroblasti embrionali del Mouse (MEFs)
<ol><li>Isolare i fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) da un ceppo di PP2A-B56γ-mouse e wild-type littermates da protocollo standard 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs per 3 passaggi, congelare e conservare fino a quando necessario per esperimenti 8.</li>
</ol>2. coltura Mefs in vetro di copertura Chambered 2-pozzo per vivere Imaging
<ol><li>Preparare 500 mL di mezzi di sviluppo MEF contenente Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM/F12) con 10% siero bovino fetale (FBS), 1 X penicillina/streptomicina antibiotici, L-Glutammina (200 mM) e 1 X gli aminoacidi non essenziali (NEAA) in una bottiglia di 500 mL media.</li>
	<li>Scongelare i flaconcini di MEFs congelati da wild type e PP2A-B56γ-topi al passaggio 3 in bagno di acqua pre-riscaldata a 37 ° C.</li>
	<li>Trasferimento scongelati MEFs di provette da 15 mL e lentamente aggiungere goccia a goccia 20 mL di DMEM/F12 media ai tubi 15 mL utilizzando una pipetta di 10 mL.</li>
	<li>Trasferimento MEFs insieme con 20 mL di coltura DMEM/F12 in boccette T75 ed espanderli fino a quando le cellule sono 70% confluenti. Confluency è stimato utilizzando un microscopio inverso a 4x o ingrandimento 10x.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura utilizzando un pascolo di vetro Pipettare collegato ad un sistema di vuoto nella cappa, aggiungere 3 mL di tripsina/EDTA 0.25% e incubare a 37 ° C per 5 min. aggiungere 3 mL di terreno di coltura DMEM/F12 per arrestare la reazione.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a bassa velocità (300 x g) per 5 min a temperatura ambiente. Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura DMEM/F12 pre-riscaldato a 37 ° C in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Enumerare le celle utilizzando il metodo di esclusione del blu di trypan o altre cella appropriata contando metodo 8.</li>
	<li>Seme circa 20.000 MEFs/pozzetto in un vetro di copertura chambered 2-pozzo. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di coltura DMEM/F12 e permettono alle cellule di allegare incubando una notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
</ol>3. sincronizzazione
<ol><li>Sincronizzare MEFs in fase G0/G1 incubando le cellule in coltura DMEM/F12 contenente 0,1% FBS per 24 h, per ottenere un numero massimo di cellule in fase G0/G1. Nota: Sebbene inedia del siero è stato utilizzato come metodo di preferenza, vari altri metodi possono essere utilizzati a seconda della fase mitotica in cui le cellule sono necessarie per essere arrestato 10.</li>
</ol>4. etichettatura
<ol><li>Preparare 1,5 mg/mL di soluzione madre di nocodazole in DMSO. Nocodazole arresti le cellule in fase G2/M inibendo la formazione di microtubuli 10.</li>
	<li>Tre giorni dopo la sincronizzazione, aggiungere 200 µ l di terreno di coltura (con 10% FCS), 200 ng/mL nocodazole e CL-HB regent (istone 2B-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Calcolare il reggente di CL-HB particelle Per cella (PPC) da aggiungere alle cellule come segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> Dove il numero delle cellule è il numero totale stimato delle cellule al momento dell'etichettatura, PPC è il numero di particelle Per cella, e 1 × 108 è il numero di particelle per mL di reagente. Ad esempio, alle cellule di etichetta 20.000 con un PPC di 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> Nota: Regent CL-HB funziona bene con molti tipi di cellule tra 10 e 50 PPC. Tuttavia, 30 PPC ha funzionato meglio per questo studio.</li>
	<li>Incubare MEFs per 18 h a 37 ° C e 5% CO2. Nota: Per l'esperimento corrente, visualizzazione di cromosomi nelle cellule mitotiche sfuggire il checkpoint di montaggio del mandrino si è verificato 18 h dopo l'arresto del ciclo cellulare con nocodazole.</li>
</ol>5. visualizzazione di in ritardo di cromosomi
<ol><li>Visualizzare fibroblasti embrionali di topo (MEFs) utilizzando un sistema di microscopio confocale di filatura disco dotato di una camera climatica e un olio da immersione, obiettivo obiettivo 63X.<ol>
<li>Utilizzare lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm ed emissione lunghezza d'onda 450 nm per acquisizione di immagini di canale GFP.</li>
		<li>Utilizzare un sistema di microscopio confocal di filatura disco con la capacità di fasi motore di scansione, Z-Piezo inserti, incubazione di palcoscenico-top e recupero di fluorescenza diretta dopo foto lo sbiancamento per questa tecnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un giorno prima di formazione immagine, accendere l'unità di camera ambientale e riscaldare l'intera camera a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Accendere per il basamento del microscopio, macchina fotografica, unità disco di filatura, illuminatore, laser ad argon, computer e tavolino motorizzato.</li>
	<li>Lasciare che il sistema riscaldare per 3 min; avviare il laser di argon attivando la chiave di accensione. L'interruttore toggle per argon laser dalla modalità "standby" per "esecuzione di laser".</li>
	<li>Avviare il software di acquisizione ed elaborazione di dati.</li>
	<li>Avviare il controller di CO2 per l'incubatrice di fase superiore e impostare la concentrazione di CO2 al 5%. Questo deve essere fatto prima dell'inizio dell'imaging.</li>
	<li>Rimuovere il vetro di copertura incamerato dall'incubatore e posto sul palco per la visualizzazione. Visualizzare le cellule tramite un obiettivo ad immersione 63 x obiettivo (NA1.4).</li>
	<li>Vista attraverso le lenti oculari, mettere a fuoco l'immagine e identificare una cella in fase di ripartizione (NEBD) involucro nucleare.</li>
	<li>Avviare adeguate laser (laser di argon 488 nm per visualizzare Histone2B-GFP).</li>
	<li>Aprire la finestra acquisizione del controllo e impostare il tempo di esposizione per il canale GFP. Identificare una cella che si trova in NEBD.<ol>
<li>Manualmente determinare la parte superiore della cella di destinazione e il piano focale inferiore e immettere impostazioni di sezionamento ottico xyz.</li>
		<li>Osservarlo per 20 min; Se la cella non procede attraverso la divisione cellulare, interrompere l'acquisizione di immagini dopo 20 min e passare alla cella successiva che è in NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Circa 1 h per ogni cella è necessaria ai cromosomi in ritardo immagine durante la mitosi in PP2A-B56γ-cellule che fuggiti dal SAC. Per ottenere i dati per un film, scattare foto ogni 3 min. Nota: cellule Wild type arrestano e non progredire oltre NEBD quando trattati con nocodazole.</li>
	<li>Salvare le immagini nel formato di file di zvi per ulteriori analisi.</li>
</ol>6. analisi ed elaborazione di immagini
Nota: Eseguire l'elaborazione immagine tridimensionale e analisi utilizzando qualsiasi software disponibile come Axiovision versione 4.8.2 o Imaris versione 8.2. Per questo studio il ImageJ software è stato utilizzato.
<ol><li>Aprire la sequenza di immagini. Se le immagini sono già in un formato di pila, procedere al passaggio successivo. Se non, combinare tutte le immagini pertinenti in una pila utilizzando ' immagine > Pile > immagini allo Stack' nella barra dei menu.</li>
	<li>Eseguire eventuali regolazioni come richiesto per luminosità/contrasto e livelli.</li>
	<li>Per aggiungere un timestamp al film:<ol>
<li>Vai alla ' immagine > Pile > etichetta... ' nella barra dei menu.</li>
		<li>Selezionare il formato appropriato, il valore di tempo iniziale e intervallo di tempo tra ogni immagine.</li>
		<li>Selezionare la casella di 'Anteprima' e regolare le impostazioni di posizione e formato. Premere 'OK' per applicare il timbro di tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per aggiungere una barra di scala per il film:<ol>
<li>Impostare l'immagine ridimensionamento sotto ' analisi > Imposta scala ' nella barra dei menu.</li>
		<li>Nel campo 'Distanza in pixel', immettere un numero di pixel di cui è nota la distanza e nel campo 'Distanza noto' immettere la distanza. Impostare la corretta unità di lunghezza per la distanza, per esempio, in µm. Premere 'OK' per applicare la scala allo stack.</li>
		<li>Vai a ' Analyze > Strumenti > scala bar... ' per aggiungere la barra della scala. Impostare la dimensione della barra come 'Larghezza in µm' e regolare le restanti opzioni come appropriato di formattazione. Selezionare la casella 'Etichettare tutte le fette' per aggiungere la barra della scala per l'intero stack.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizzare in anteprima il filmato facendo clic sul pulsante triangolare play in basso a sinistra del bordo della finestra immagine. Regolare il frame rate tramite ' immagine > Pile > Animazione > Opzioni di animazione nella barra dei menu.</li>
	<li>Esportare il file del filmato selezionando ' File > Salva con nome > AVI... ' e selezionare il frame rate e compressione.</li>
	<li>Premere 'OK' per scegliere Salva percorso e nome file. Premere 'Salva' per salvare il file del filmato.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li><li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+and+cancer:+cutting+through+the+mystery.">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis.">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li><li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer.">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li><li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+phosphatase+2A+B56&#947;+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development.">The protein phosphatase 2A B56&#947; regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP2A-B56&#947;+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint.">PP2A-B56&#947; is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

I checkpoint di controllo del ciclo cellulare che assicurano la segregazione del cromosoma accurata prevenire aneuploidia e cella trasformazione 1,2,3. Nello studio presente, abbiamo trovato che l'inattivazione di PP2A-B56γ ha provocato un checkpoint di montaggio mandrino indebolito. Live cell imaging ci ha permesso di osservare la mis-segregazione cromosomica durante la mitosi in MEFs di PP2A-B56γ trattati con nocodazole 9.
Questo protocollo utilizza etichetta Histone2B-GFP generata dalla tecnologia BacMam 2.0 ai cromosomi di etichetta per l'imaging di cellule vive. Uno dei passaggi critici nell'etichettatura sta calcolando la giusta quantità di particelle per celle (PPC) per ottenere abbastanza etichettatura. È stato trovato tramite titolazione che 10-50 PPC funziona meglio. Questo reagente potrebbe essere tossico per le cellule; quindi è necessario a titolare PPC utilizzati per raggiungere l'equilibrio tra l'etichettatura e la tossicità per le cellule marcate. Inoltre, questo è una trasfezione transiente e può essere rilevato solo fino a 5 giorni, quindi, potrebbe non essere appropriata per gli studi che giustificherebbero più lunghi periodi di osservazione.
Tagging tradizionale della proteina o DNA può richiedere protocolli complicati, ma qui usiamo un reagente che richiede solo un'incubazione overnight con celle volute. Inoltre, live cell imaging è stata eseguita mediante microscopia confocale disco di filatura che a differenza di microscopia a scansione laser confocale è più veloce e riduce la fototossicità e candeggio effetti in vivo delle cellule 11. Questo protocollo permette un metodo facile e conveniente marcare le cellule mitotiche e visualizzare segregazione cromosomica rispetto ad altre tecniche come il pesce, immunohistochemistry e citometria a flusso. Questo protocollo permette anche la cattura di in ritardo immagini di cromosomi durante la mitosi, fornendo informazioni supplementari a quelle ottenute utilizzando tradizionali immunocitochimica, pesce o flusso cytometry, rendendo così possibile catturare i fenotipi tali come in ritardo cromosoma nello spazio e nel tempo. Questo protocollo permette conveniente, veloce e facile etichettatura dei cromosomi in ampia varietà di linee cellulari, cellule primarie, cellule staminali, neuroni e immortalato le cellule T 12,13,14.
Vari tipi di prodotti per terapia cellulare vengono sviluppati con le speranze per il trattamento di condizioni di malattia varia 15. Una delle sfide affrontate nello sviluppo di queste terapie con cellule comporta problemi di sicurezza grazie alla possibilità di instabilità genetica e nella tumorigenesi. Questo protocollo descrive un metodo conveniente e facile ai cromosomi di etichetta in vari tipi delle cellule. In futuro potrebbe essere impiegato per sviluppare un'analisi per studiare e misurare instabilità genetica e la qualità dei prodotti di terapia cellulare.

Nel seguente protocollo, descriviamo un metodo conveniente per visualizzare la segregazione cromosomica e mitotica progressione durante il ciclo cellulare in fibroblasti embrionali del mouse utilizzando istone 2B-GFP, BacMam 2.0 etichettatura e live cell imaging.
I checkpoint di controllo del ciclo cellulare monitorare la segregazione del cromosoma e svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità genetica delle cellule 1,2,3. Accumulo di mis-segregati cromosomi può portare a aneuploide, che è un segno dei più solidi tumori 4. Quindi, rilevamento di in ritardo cromosomi utilizzabile come un metodo per studiare l'instabilità cromosomica.
L'etichetta fluorescente proteine possono essere utilizzato per visualizzare la segregazione del cromosoma dal vivo e cromosomiche in ritardo ma la generazione di mCherry-etichetta o proteina H2B-GFP etichettate richiede conoscenza sostanza di gene consegna e biologia molecolare 5. Qui descriviamo l'uso del reagente CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, chiamato in seguito reggente di CL-HB, per ragioni di semplicità. Questo reagente può essere utilizzato immediatamente e quindi Elimina le preoccupazioni circa la qualità di vettore e l'integrità. Inoltre, questo reagente non richiede l'uso di trattamenti potenzialmente dannosi o di lipidi e di tintura-caricamento prodotti chimici. A differenza di etichette fluorescenti convenzionali, il reggente di CL-HB macchie indipendentemente dalla funzione (cioè., potenziale di membrana). Il reggente di CL-HB può essere semplicemente aggiunti alle cellule e incubato durante la notte per l'espressione della proteina. Il reggente di CL-HB non replica in cellule di mammiferi e può essere utilizzato nelle regolazioni del laboratorio 1 (BSL) livelli di biosicurezza. Inoltre, la trasfezione transiente può essere rilevata dopo incubazione overnight per fino a 5 giorni, tempo sufficiente per svolgere analisi cellulari più dinamiche.
In alternativa, le anomalie cromosomiche potrebbero essere studiate mediante varie tecniche quali la citometria a flusso, immunohistochemistry o fluorescenza in situ di ibridazione (pesce) 6. Citometria a flusso può essere utilizzato per studiare l'aneuploidia, che può essere misurato basato sul contenuto del DNA e la fase delle cellule nel ciclo cellulare. Anche se la citometria a flusso può essere utilizzato per misurare l'aneuploidia, non fornisce informazioni sulla mis segregazione cromosomica. Tecniche di immunoistochimica e pesce utilizzano sonde fluorescenti per associare al DNA o cromosomi. Mentre queste tecniche forniscono un'istantanea dello stato di una popolazione di cellule, non consentono live cell imaging quindi manca qualsiasi informazione ottenuta attraverso la visualizzazione spaziotemporali della citochinesi in cellule specifiche seguiti per un periodo di tempo.
Questo protocollo è stato usato per studiare i cromosomi in ritardo o mis-segregazione cromosomica in fibroblasti embrionali del mouse di nocodazole trattati (MEFs) isolate da topi-B56γ-PP2A. In aggiunta ai sopra applicazione, questo protocollo fornisce un semplice strumento per etichettare e visualizzare segregazione cromosomica in vari tipi di cellule che può essere usato per studiare la regolazione del ciclo cellulare o instabilità cromosomica in cellule del tumore. Inoltre, può essere utilizzato anche per studiare l'instabilità cromosomica causata da vari trattamenti farmacologici o per studiare gli effetti di gene knock out conseguente mis segregazione cromosomica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:128px;">11320082</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered saline</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>MX 1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryogenic vial storage boxes</td>
			<td style="width:135px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">10-500-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:135px;">Corning/costar</td>
			<td align="right">431416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:135px;">Cellstar</td>
			<td align="right" style="width:128px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">2 well chambered cover glass</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td style="width:128px;">155380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cellometer Vision Cell Profiler</td>
			<td style="width:135px;">Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td style="width:128px;">Cellometer Vision Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:128px;">C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td>
			<td style="width:135px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:128px;">Zeiss Cell Observer SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Water Bath</td>
			<td style="width:135px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:128px;">280 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Incubator</td>
			<td style="width:135px;">Sanyo commercial solutions</td>
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		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

Cromosomi devono essere uniformemente e in modo affidabile suddivise in cellule della figlia durante la divisione cellulare mitotica. Fedeltà della segregazione cromosomica è controllata da meccanismi multipli che includono il mandrino Assembly Checkpoint (SAC). Il SAC è parte di un sistema di feedback complessi che è responsabile per la prevenzione di un progresso delle cellule attraverso la mitosi, a meno che tutti i cinetocori cromosomici hanno attaccato per mandrino microtubuli. Cromosomiche in ritardo e cromosoma anormale segregazione è un indicatore di checkpoint di controllo del ciclo cellulare disfunzionale e può essere usata per misurare la stabilità genomica di divisione delle cellule. Deregolamentazione del SAC può causare la trasformazione di una cellula normale in una cellula maligna attraverso l'accumulo di errori durante la segregazione cromosomica. Implementazione del SAC e la formazione del cinetocore complesse sono strettamente regolati dalle interazioni tra chinasi e fosfatasi come proteina fosfatasi 2A (PP2A). Questo protocollo descrive live cell imaging di in ritardo di cromosomi in fibroblasti embrionali di topo isolate da topi che avevano un knockout della subunità regolatoria di PP2A-B56γ. Questo metodo sormonta le imperfezioni di altri ciclo cellulare controllo tecniche di imaging quali la citometria a flusso o immunocitochimica che forniscono solo un'istantanea di uno stato di citochinesi cellulare, invece di una visualizzazione dinamica spazio-temporale dei cromosomi durante la mitosi.

MEFs da wild type e PP2A-B56γ-topi sono stati seminati in un vetro di copertura 2-pozzo camera e permesso di allegare. Il giorno 2, MEFs sono stati sincronizzati utilizzando 0,1% FBS per 24 h. Il giorno 3, MEFs nei media con 200 ng/mL nocodazole e 30 PPC CL-HB regentwere incubati per 18 h 37° C e 5% CO2. Il giorno 4, le cellule erano imaged utilizzando un sistema di microscopio confocal di filatura disco (Figura 1). Live imaging cellulare è stato usato per prevedere il destino delle singole celle mentre progredivano da NEBD attraverso mitosi (Figura 2). Nocodazole è noto per arrestare le cellule wild type in fase G2M interferendo con la formazione dei microtubuli. È stato osservato che post trattamento nocodazole del tipo selvaggio cellule sono state arrestate al pannello superiore di metafase (Figura 2). Abbiamo osservato che la mancanza di PP2A-B56γ indebolito il controllo del ciclo cellulare, che ha permesso di PP2A-B56γ-MEFs superare l'arresto del ciclo cellulare indotto da nocodazole 9. Inoltre, segregazione cromosomica anormale è stata rilevata nel 62% (13 su 21) di PP2A-B56γ-MEFs mitotica trattati con nocodazole (indicato dalle frecce gialle nel pannello inferiore nella Figura 2). Cinque di PP2A-B56γ-MEFs arrestato a NEBD e 3 siamo andati attraverso mitosi senza difetti osservabili. Al contrario, tutte le cellule wild type 21 che erano imaged non procedere attraverso mitosi e sono state trovate ad essere arrestato dalla metafase (pannello superiore Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57389/57389fig1.jpg"> Figura 1 . Diagramma di flusso base per l'imaging cellulare live. MEFs da wild type e PP2A-B56γ-topi sono stati seminati in un vetro di copertura chambered 2-bene durante la notte. 2 ° giorno, le cellule sono state sincronizzate utilizzando 0,1% FBS per 24 h. giorno 3, le cellule sono state trattate con 200 ng/mL nocodazole in crescita media e 30 PPC istone 2B-GFP, reagente BacMam 2.0 per 18 h. giorno 4 le cellule erano imaged usando il sistema di filatura Disc microscopio confocale. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57389/57389fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57389/57389fig2.jpg"> Nella figura 2. Le anomalie cromosomiche sono rilevate in PP2A-B56γ-MEFs. Immagini dal vivo di time lapse microscopia acquisiti nei vari punti di tempo nella mitosi (min 0-51) di tipo selvaggio nocodazole trattati e PP2A-B56γ-MEFs. Le cellule wild-type sono state trovate per essere arrestato alla metafase (pannello superiore), mentre PP2A-B56γ-MEFs erano in grado di passare attraverso mitosi (pannello inferiore). Cromosomiche in ritardo o mis-segregazione può essere visto in PP2A-B56γ-MEFs indicato da frecce gialle nel pannello inferiore. Barra della scala = 5 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57389/57389fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Questo protocollo descrive un metodo facile e conveniente per etichettare e visualizzare live cromosomi nelle cellule mitotiche utilizzando etichetta Histone2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocal di filatura disco.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

Nanyang Technological University

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9.2K Views.  US Food and Drug Administration. Questo protocollo descrive un metodo facile e conveniente per etichettare e visualizzare live cromosomi nelle cellule mitotiche utilizzando etichetta Histone2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocal di filatura disco.

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Riepilogo

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Live-imaging del

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

A lungo termine Imaging in diretta di

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos