Supported by grants from CIHR (MOP231122) and NSERC (RGPIN-2014-06503). We would like to thank Genevi&#232;ve Cyr for her help preparing experiments and supervising laboratory work. MAL received a scholarship from The Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità alle direttive del Consiglio canadese per la protezione degli animali e la revisione consiglio Etico della Université de Montréal. 1. Assemblea della pipetta registrazione iniezione <ol><li> Estrarre un capillare di vetro di circa 7 cm di lunghezza (diametro esterno 1 mm) con un estrattore pipetta. </li><li> Rompere la punta del capillare e controllare l&#39;apertura al microscopio ottico. Verificare che il diametro interno è compreso tra 30 micron a 40 micron. </li><li> Inserire un lungo filo Silver 7 cm nel capillare di vetro con circa 1 cm sporgenti dall&#39;estremità non rastremata della pipetta di vetro. </li><li> Piegare il filamento eccesso ortogonalmente al capillare di vetro. </li><li> Applicare una goccia di adesivo plastica flessibile sull&#39;albero di un ago ipodermico 30 G. </li><li> Inserire un ago ipodermico 30 G nella pipetta di vetro secondo gli schemi presentati nella figura 1 </strong&gt;. </li><li> Aggiungere un secondo strato di colla per garantire un&#39;adeguata tenuta dalla giunzione tra la pipetta di vetro e l&#39;ago ipodermico. </li><li> Lasciare la pipetta asciugare con la punta rivolta verso l&#39;alto per circa 12 ore per garantire il corretto indurimento della colla. Il risultato finale è mostrato in Figura 2. </li></ol> NOTA: Questa procedura viene eseguita su esperimenti acute e la sterilizzazione del puntale non è necessaria. 2. Preparazione degli animali <ol><li> Posizionare il topo in una scatola di anestesia. </li><li> Indurre l&#39;anestesia con il 4% isoflurano per 5 a 10 min. </li><li> Posto l&#39;animale su un tavolo stereotassico con il rilievo di riscaldamento e sonda rettale per mantenere una temperatura corporea di 37 ° C. Utilizzare un cono per mantenere l&#39;anestesia con il 2% isoflurano. Fissare la testa del topo con le orecchie bar e titolare denti. </li><li> Applicare unguento oftalmico o collirio, che includono 1% Atropina scende a facilitare la dilatazione della pupilla. Per prevenire la secchezza, applicare goccia lubrificantes circa ogni 30 min. </li><li> Shave testa e pulirlo con 10% iodopovidone. </li><li> Per anestesia locale, iniettare 0,5 ml di 2% lidocaina sotto il cuoio capelluto in 2-3 posizioni sollevando la pelle ed inserendo la punta dell&#39;ago. </li><li> Conferma adeguato livello di anestesia eseguendo un pizzico piedi e osservando la mancanza di movimento. Inoltre, monitorare la frequenza cardiaca per garantire che sia entro valori normali (da 300 a 400 battiti / min). </li><li> Incidere il cuoio capelluto in una linea retta lungo la mediana con una lama di 10 # bisturi per esporre entrambe le suture coronale e sagittale. </li><li> Rivela i punti di Lambda e Bregma spingendo da parte del tessuto che copre il cranio con una spatola chirurgico. </li><li> Livellare il cranio in modo che le posizioni bregma e lambda sono sullo stesso piano. </li><li> Per impostare il punto di riferimento, utilizzare un dispositivo stereotassico con un tubo di vetro montato impostarla proprio sopra Bregma. Questo sarà il &quot;zero&quot; antero-posteriore e medcoordina le misure ial-laterali. </li><li> Impostare il punto di interesse spostando il stereotassico di montaggio alle coordinate richieste, annotare le coordinate stereotassica e disegnare un quadrato intorno alla zona di destinazione che segna dove verrà eseguita la craniotomia. </li><li> Utilizzare un trapano chirurgico con un trapano sterilizzato lungo la piazza marcata lentamente senza pressione per rimuovere lentamente il materiale osseo. Fare attenzione a non forare troppo a lungo nella stessa zona, in quanto la produzione di calore e causare lesioni della corteccia. </li><li> Quando l&#39;osso che delimita la craniotomia è diventata sufficientemente sottile, rimuovere con attenzione la sezione del cranio con le pinzette per esporre la corteccia. </li><li> Irrigare Spesso la corteccia esposta con liquido cerebro-spinale artificiale per evitare l&#39;essiccamento dei tessuti. NOTA: la rimozione mater Dura è inutile per il ratto come la punta di un injectrode è abbastanza robusto da penetrare. </li></ol> 3. Riempimento e montaggio del sistema di iniezione <ol><li> Riempire il5-10 microlitri microsiringa da aspirazione con olio minerale. </li><li> Riempire il ago ipodermico con la pipetta di vetro fissa con una soluzione di 0,5% Chicago Sky Blu (CSB) e acido 300 pM γ-amminobutirrico (GABA), o una soluzione di 2% lidocaina con 0,5% CSB 9. Diluire tutte le soluzioni con soluzione salina. <ol><li> Nel caso di una sostanza abbondante, riempire con una siringa regolare e utilizzare le usuali tecniche precauzionali per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Nel caso di sostanze più costose, utilizzare olio minerale per riempire il injectrode e l&#39;agente chimico può quindi essere introdotto tramite aspirazione. Poiché la differenza di densità tra l&#39;olio minerale e l&#39;acqua è relativamente elevata, questa sostanza è un buon candidato per l&#39;iniezione di soluzioni acquose. NOTA: Un colorante può essere aggiunto per confermare la separazione tra i due liquidi. </li></ol></li><li> Per riempire la pipetta di iniezione, riempire una siringa da 1 ml con la soluzione per aspirazione e poi iniettare lentamente la soluzionenella pipetta di iniezione. </li><li> Prestare attenzione per perdite in regioni indicate in figura 1 con tampone queste aree pulite e osservando perdite iniettando ulteriormente la soluzione lentamente con la siringa. </li><li> Rimuovere la siringa da 1 ml. Nel fare così, essere sicuri di mantenere una leggera pressione sullo stantuffo in modo che il vuoto non rimuove la soluzione dalla pipetta iniezione. </li><li> Riempire la microsiringa con olio minerale tramite aspirazione e fissarlo saldamente alla pipetta di iniezione riempita, poi pulire attentamente tutta la soluzione in eccesso dalla injectrode assemblato con una garza. </li><li> Verificare che la punta non è bloccato iniettando un volume molto piccolo, abbastanza per vedere una piccola goccia formando sulla punta della pipetta di vetro. </li><li> Montare il injectrode sul sistema micropompa e assicurarsi che sia ben fissata. </li><li> Posizionare accuratamente la punta injectrode alle coordinate di destinazione e abbassare la punta alla superficie della corteccia. </li><li> Abbassare lentamente il injectrODE usando l&#39;apparato stereotassico alla struttura di destinazione (collicolo superiore in questo caso) utilizzando gli appositi coordinate anatomiche. </li><li> Coprire la corteccia esposta con agar calda per prevenire l&#39;essiccamento dei tessuti. </li></ol> 4. Iniezione e inattivazione reversibile <ol><li> Impostare la pompa microiniezione di iniettare 400-800 nl a 40 nl / min e premere Esegui per avviare l&#39;iniezione. Si noti che il tasso di picco mostrerà riduzione durante l&#39;iniezione. NOTA: Nel setup sperimentale, l&#39;attività neurale recuperato nel giro di un&#39;ora dopo la fine della consegna GABA. Qualsiasi dispositivo meccanico tarato può essere usato per applicare pressione sulla siringa microiniezione per condurre l&#39;iniezione. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione dei dati elettrofisiologici, eutanasia con un metodo approvato dalla locale Comunità etico degli animali. </li></ol>

<ol><li>Martin, J. H., Ghez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inactivation+in+the+analysis+of+the+central+control+of+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).</li>
<li>Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+indirect+pathways+to+visual+response+properties+in+macaque+middle+temporal+area+MT%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Neuroscience+The+Official+Journal+Of+The+Society+For+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT.</a> The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).</li>
<li>Lomber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+limitations+of+permanent+or+reversible+deactivation+techniques+in+the+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).</li>
<li>Malpeli, J., Schiller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).</li>
<li>Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoloop%3A+an+adaptable+reversible+cooling+deactivation+method+for+behavioral+or+electrophysiological+assessment+of+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+deep+brain+structures+with+microinjections+for+delivery+of+drugs%2C+viral+vectors%2C+or+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants.</a> Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).</li>
<li>Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+parameters+of+cortical+inactivation+by+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).</li>
<li>Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+Reorganized+Primary+Somatosensory+%28SI%29+Cortex+after+Local+Inactivation+of+Normal+SI+Cortex+in+Chronic+Spinal+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+%26+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats.</a> Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).</li>
<li>Malpeli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).</li>
<li>Minville, K., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+frequency+processing+in+posteromedial+lateral+suprasylvian+cortex+does+not+depend+on+the+projections+from+the+striate-recipient+zone+of+the+cat%E2%80%99s+lateral+posterior-pulvinar+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex.</a> Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).</li>
<li>Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+the+binocular+visual+field+in+the+superior+colliculus+of+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat.</a> Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).</li>
</ol>

We have nothing to disclose.

Il protocollo proposto è stato progettato per risolvere le sfide poste dagli attuali metodi di inattivazione reversibile. In particolare, questo progetto mira a perfezionare i metodi utilizzati per microiniezioni chimiche delle sostanze che modulano l&#39;attività neurale, in particolare nelle strutture cerebrali profonde. Una sfida tecnica emergente da questo tipo di configurazione è la necessità per entrambe le sonde da colocalized nello stesso spazio ristretto in vivo al fine di derivare registrazioni precise al sito di iniezione. Questo problema può essere superato utilizzando dispositivi, come quello qui presentato, che sono capaci di iniezione e registrazione nello stesso sito. Metodi alternativi includono l&#39;uso di dispositivi a base di impulsi di pressione del gas. Tali strumenti sono stati disponibili per molti anni, ma l&#39;uso di un intermedio comprimibile riduce il controllo sui prezzi e volumi di iniezione, due parametri che sono importanti per controllare per assicurare la reversibilità. Altri metodi come l&#39;iniezione iontoforetico systems sono inoltre disponibili, ma le dinamiche di diffusione del liquido sono diverse rispetto a iniezione in bolo, riducendo il potenziale gamma di inattivazione. Questi metodi hanno il vantaggio di avere un modello di diffusione sferica in contrapposizione al modello ellittica osservato per microiniezioni 7. Quindi, la scelta del metodo di inattivazione deve essere progettato secondo la regione bersaglio e il disegno sperimentale. Anche se esistono alternative commerciali, il protocollo proposto fornisce una maniera conveniente di monitorare il rilascio del principio attivo farmaceutico e consentendo un elevato grado di personalizzazione. Tale libertà nella lavorazione del dispositivo di iniezione favorisce una vasta gamma di flessibilità sperimentale e sintonizzazione per specifici contesti applicativi. Per quanto riguarda il protocollo proposto, il passaggio fondamentale è il processo di riempimento della pipetta di vetro. Le bolle d&#39;aria devono essere evitati, come la compressione dell&#39;aria renderà il monitoraggio dei iniettatovolumi intrattabili. Una resistenza molto minima dovrebbe essere sentito quando si spinge manualmente liquido attraverso la pipetta, confermando libero flusso nel sistema. L&#39;assenza di liquido con iniezione manuale può indicare una perdita nel sistema o nella preparazione pipetta errato causando una punta ostruito. L&#39;impedenza della pipetta deve essere misurato per ottenere la registrazione elettrofisiologica tipo desiderato (LFP, potenziali evocati, l&#39;attività più unità, etc.), come le punte più grandi formati provocheranno impedenze inferiori. Se l&#39;iniezione è successo, un volume di 400 a 800 nl della soluzione 300 mM GABA o la soluzione di lidocaina 2% è sufficiente a sopprimere spiking attività. Per avere un&#39;idea della iniezione diffuse nello spazio e nel tempo, agar può essere utilizzato per simulare il tessuto nervoso. La diffusione di iniezione può essere facilmente osservata con una soluzione CSB. Dopo simulazioni, è essenziale per caratterizzare iniezione diffondere istologicamente attraverso l&#39;uso of coloranti come il CSB, di autoradiografia usando le droghe radioattivi o utilizzando approcci metaboliche come autoradiografia glucosio deleghe come indirette per misurare l&#39;attivazione o inattivazione di attività neurale 1. E &#39;anche importante notare che le iniezioni veloci (≥100 nl / min) probabilmente porterà a lesioni che fanno piena reversibilità irraggiungibile. Un importante vantaggio del protocollo proposto è il potenziale di integrare il sistema di iniezione con software che retroazione controllare la velocità di iniezione per un set livello di attività neuronale. Tale implementazione consentirebbe ricercatori di concentrarsi sulla inattivazione (o attivazione) parametri piuttosto che su parametri tecnici quali tassi di iniezione o volumi mentre l&#39;erogazione di sola la giusta quantità di farmaco per l&#39;applicazione considerata. Ciò ridurrebbe al minimo spostamento della sonda ottimizzando il volume farmaco necessario, consentire un maggiore controllo time-sensitive del drug delivery, favorire riproducibilità e tuttiow confronto diretto-abbinato dei dati. Questa tecnica combina un sistema di rilascio del principio attivo e la registrazione di segnali elettrofisiologici. Abbiamo dimostrato la sua efficacia, utilizzando la capacità di registrazione della nostra pipetta per individuare funzionalmente collicolo superiore inducendo i treni di attività multi-unità utilizzando il flash stimoli 11. Durante l&#39;inattivazione, attività multi-unit diminuita e gradualmente recuperato dopo compensato iniezione. Tecniche di inattivazione reversibili, come quello qui presentato, forniscono notevoli vantaggi rispetto lesioni meccaniche o chimiche tecniche che consentono il recupero assente o scarsa 3. Tecniche di inattivazione reversibili rafforzano la significatività statistica degli esperimenti da confronti a coppie sono possibili 3, eliminando così le differenze idiosincratiche. Abbiamo sviluppato una tecnica efficiente e personalizzabile costo che permette un controllo preciso sulla durata del rilascio del principio attivo e il robustoprobing di un&#39;area cerebrale destinazione.

L&#39;inattivazione di aree corticali e nuclei sottocorticali è importante nello studio delle relazioni funzionali tra varie strutture cerebrali 2-4. La letteratura recente ha impiegato tecniche criogeniche chimica perdita-di-funzione o per studiare il ruolo delle strutture cerebrali 2,5. Per quanto riguarda microiniezioni farmacologiche, piccoli volumi di farmaci possono essere somministrati in una regione del cervello ad una velocità controllata, riducendo al minimo i danni collaterali al 6,7 tessuto circostante. Questa tecnica può essere usata per fornire agonisti specifici, agonisti inversi o antagonisti per studiare l&#39;effetto di differenti bersagli farmacologici sulla attività neuronale. Tali effetti possono essere studiati da cambiamenti nelle risposte neuronali provenienti da località lontane misura, consentendo ai ricercatori di studiare i rapporti tra diverse strutture corticali e subcorticali. Qui, dimostriamo l&#39;assemblaggio di un dispositivo, il injectrode, capace di both registrazione di segnali elettrofisiologici e consegna di piccole quantità di droga nel luogo di destinazione. Dimostriamo le capacità di questo sistema iniettando GABA, un inibitore comune di attività neuronale, nel ratto collicolo superiore. Questa regione è sensibile alla stimolazione visiva, che ci ha permesso di utilizzare l&#39;attività multiunit evocata visivamente per confermare la localizzazione injectrode. La reversibilità della inattivazione è stata valutata dalla ripresa della normale attività neuronale dopo la fine dell&#39;iniezione GABA. La possibilità di monitorare l&#39;attività multi-unit dal sito di iniezione consente la messa a punto dei tassi di iniezione e volumi necessari per ottenere la risposta farmacodinamica desiderato. Pertanto, un vantaggio di questa tecnica è il potenziale limitazione di danni ai tessuti causati da microperfusione, poiché i volumi efficaci piccoli vengono iniettati. Il protocollo proposto fornisce un metodo efficiente di costo per la generazione del necessar hardware monousoy per esperimenti che conducono in cui si desidera la consegna della droga e la registrazione dell&#39;attività neuronale locale.

<table><tbody><tr><td>Injection pump (UltraMicroPump III)</td><td>WPI</td><td>#UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Injection console (Micro4 Controller)</td><td>WPI</td><td>#SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamliton</td><td>(80301) 701LT 10 &amp;micro;L SYR</td><td>Syringes between 5 and 10 &amp;mu;l used</td></tr><tr><td>Flexible plastic adhesive</td><td>Lepage</td><td>393915</td><td>The gel form is easier to apply to the shaft of the 30&amp;nbsp;G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.</td></tr><tr><td>Glass pipettes</td><td>WPI</td><td>#TW100F-4</td><td>Thin wall, 1&amp;nbsp;mm OD, 0.75&amp;nbsp;mm ID with filament pipettes used</td></tr><tr><td>720 Needle Pipette Puller</td><td>Kopf</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>782500</td><td>Bare 0.010&amp;rdquo;</td></tr></tbody></table>

simultaneous electrophysiological recording and micro-injections of inhibitory agents in the rodent brain

Qui si descrive un metodo per la costruzione di un mono-uso &quot;injectrode&quot; utilizzando parti commercialmente accessibili e convenienti. Un sistema di ispezione è stato sviluppato che consente l&#39;iniezione di un farmaco durante la registrazione di segnali elettrofisiologici dalla popolazione neuronale colpita. Questo metodo fornisce una semplice ed economica alternativa alle soluzioni commerciali. Una pipetta di vetro è stato modificato combinandolo con un ago ipodermico e un filamento d&#39;argento. Il injectrode è collegato a pompa Microsiringa commerciale per la somministrazione di farmaci. Ciò si traduce in una tecnica che fornisce feedback farmacodinamica tempo reale attraverso segnali extracellulari più unità provenienti dal sito di somministrazione di farmaci. Come un proof of concept, abbiamo registrato l&#39;attività neuronale del collicolo superiore suscitata da lampi di luce nei ratti, in concomitanza con la consegna di farmaci attraverso il injectrode. La capacità di registrazione injectrode permette la caratterizzazione funzionale del injsito ezione favorendo un controllo preciso sulla localizzazione del drug delivery. L&#39;applicazione di questo metodo si estende anche ben oltre ciò che è dimostrato qui, come la scelta di sostanza chimica caricato nel injectrode è vasta, tra cui tracciare i marcatori per esperimenti anatomici.

La costruzione del injectrode è illustrato in Figura 1. Un filo d&#39;argento (C) viene alimentato in una pipetta di vetro (D) con la porzione di filo e piegata sporge fuori dall&#39;apertura. Un ago 30 G (B) viene fissato e sigillato all&#39;apertura della pipetta di vetro con colla. Dopo la pipetta è stata riempita con la sostanza di iniezione, una siringa di vetro micro (A) è collegata all&#39;ago. È importante che vi sia una buona tenuta in cui il micro siringa collega con l&#39;ago (E) e dove il filo d&#39;argento sporge dalla pipetta di vetro (F). La Figura 2 mostra una fotografia di ciò che il injectrode assomiglia montaggio avvenuto. Attività multiunità Visivamente evocata sono stati ottenuti nel collicolo superiore segue un lampo msec 300 ad occhio controlaterale come illustrato nella figura 3. Dopo l&#39;iniezione di GABA, spiking attività in risposta ad uno stimolo istantaneo è stato soppresso. visivamentel&#39;attività dell&#39;unità multipla evocata tipicamente rinviato tra 45 a 60 minuti dopo l&#39;iniezione è cessata. La figura 4 illustra la configurazione del sistema di microiniezione. Il controller pompa di iniezione consente all&#39;utente di specificare le impostazioni per l&#39;iniezione. Un connettore elettrico molla collega il filo d&#39;argento che sporge dalla pipetta di vetro. Il connettore porta ad uno stadio testa con elettrodi di massa e di riferimento e quindi inserito in un amplificatore. Un convertitore analogico / digitale interfaccia (A / D) viene utilizzato per acquisire i dati elettrofisiologici, e un altoparlante è utilizzato per il monitoraggio audio complementare di attività neuronale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52271/52271fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Rappresentazione schematica del complesso injectrode Un micro siringa (A) è attaccato alla pipetta di registrazione-iniezione che consistono di un G 30 hago ypodermic (B) aderito a un filo d&#39;argento (C) all&#39;interno di una pipetta di vetro (D). Regioni cerchiato (E - F) aree di luce che potrebbero essere suscettibili di perdite. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52271/52271fig2highres.jpg" /> Figura 2: Una foto della pipetta costruito usando un ago 30 G (B), la colla adesivo impermeabile (F), un filo d&#39;argento (C) e una pipetta di vetro (D). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52271/52271fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: Un esempio dell&#39;effetto inibitorio di iniezione del GABA (300 micron) sul evocata visivamente attività multi-unit nel collicolo superiore, frecce indicano il flash esordio. Elettricosegnali al sono filtrati utilizzando un filtro passa-banda impostata fra 30 e 3.000 Hz. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52271/52271fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4: Rappresentazione schematica del sistema di micro-iniezione completa.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain at JoVE.com

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

simultaneous-electrophysiological-recording-micro-injections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.1K Views.  Université de Montréal. Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Video: Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

FMRI simultanea ed Elettrofisiologia nel cervello roditori

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ricerca

Neuroscienze

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

acuto<em&gt; In Vivo</em&gt; Registrazioni elettrofisiologiche dei potenziali del campo locale e dell&#39;attività multi-unità dal percorso iperdirezionale nei ratti anestetizzati

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Concurrent Recording of Co-localized Electroencephalography and Local Field Potential in Rodent

Although electroencephalography (EEG) is widely used as a non-invasive technique for recording neural activities of the brain, our understanding of the neurogenesis of EEG is still very limited. Local field potentials (LFPs) recorded via a multi-laminar microelectrode can provide a more detailed account of simultaneous neural activity across different cortical layers in the neocortex, but the technique is invasive. Combining EEG and LFP measurements in a pre-clinical model can greatly enhance understanding of the neural mechanisms involved in the generation of EEG signals, and facilitate the derivation of a more realistic and biologically accurate mathematical model of EEG. A simple procedure for acquiring concurrent and co-localized EEG and multi-laminar LFP signals in the anesthetized rodent is presented here. We also investigated whether EEG signals were significantly affected by a burr hole drilled in the skull for the insertion of a microelectrode. Our results suggest that the burr hole has a negligible impact on EEG recordings.

This protocol describes a simple method for concurrent recording of co-localized electroencephalography (EEG) and multi-laminar local field potential in an anesthetized rat. A burr hole drilled in the skull for the insertion of a microelectrode is shown to produce negligible distortion of the EEG signal.

Registrazione simultanea di co-localizzato elettroencefalografia e potenziali di campo locale nel roditore

Although electroencephalography (EEG) is widely used as a non-invasive technique for recording neural activities of the brain, our understanding of the ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes and nanosensors, optimized for repeated use in awake, behaving animals. The microinjectrode system can be configured for multiple purposes: (1) simple arrangement of the cannula for placement of an experimental probe that would otherwise be too fragile to penetrate the dura mater, (2) microfluidic infusion of a drug, either independently or coupled to a cannula containing an experimental probe (i.e., microelectrode, nanosensor). In this protocol we explain the step by step construction of the microinjectrode, its coupling to microfluidic components, and the protocol for use of the system in vivo. The microfluidic components of this system allow for delivery of volumes on the nanoliter scale, with minimal penetration damage. Drug infusion can be performed independently or simultaneously with experimental probes such as microelectrodes or nanosensors in an awake, behaving animal. Applications of this system range from measuring the effects of a drug on cortical electrical activity and behavior, to understanding the function of a specific region of cortex in the context of behavioral performance based on probe or nanosensor measurements. To demonstrate some of the capabilities of this system, we present an example of muscimol infusion for reversible inactivation of the frontal eye field (FEF) in rhesus macaque during a working memory task.

We present a microinjectrode system designed for electrophysiology and assisted delivery of experimental probes (i.e., nanosensors, microelectrodes), with optional drug infusion. Widely available microfluidic components are coupled to a cannula containing the probe. A step-by-step protocol for microinjectrode construction is included, with results during muscimol infusion in macaque cortex.

Sistema di microinietatra per l'infusione combinata di farmaci e l'elettrofisiologia

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes ...

Drug Microinjection with Electrophysiological Recording in a Rat Brain

Source: Lai, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52271">Simultaneous electrophysiological recording and micro-injections of inhibitory agents in the rodent brain.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This protocol outlines the assembly and use of an injectrode for precise drug delivery into targeted brain regions of an anesthetized rat, followed by monitoring of neuronal activity through recorded electrical signals.

Microiniezione di farmaci con registrazione elettrofisiologica in un cervello di ratto

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

In Vivo Electrophysiological Recordings of Brain Activities from Multiple Sites in Rats

Source: Haumesser, J. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55940">Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats.</a> J. Vis. Exp.(2017).
This video demonstrates the detailed procedure for preparing an anesthetized rat for electrophysiological recordings of brain activity from multiple sites. The scalp is dissected to access the skull, and holes are drilled at precise locations to install and secure electrodes. Tungsten microwire electrodes are then inserted into the targeted location to record the data.

Registrazioni elettrofisiologiche in vivo di attività cerebrali da più siti nei ratti

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

A Micro-drive Array Method for Electrophysiological Recording from Multiple Brain Regions

Source: Shikano, Y., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56980">Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates simultaneous electrophysiological recording from multiple brain regions in a rat using an integrative micro-drive array. Recording electrodes are placed in the olfactory bulb, reference electrodes in the frontal cortex, and micro-drive array electrodes in the hippocampus. The rat is allowed to forage freely, and simultaneous recording from all the implanted electrodes is recorded using the array.

Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Riepilogo

Esplora Altri Video