La ricerca finanziata dal Dipartimento della Difesa (Defense Advanced Research Projects Agency, Premio Facoltà giovane, il codice di autorizzazione N66001-09-1-2117) e NINDS (R15NS070734).

1. Preparazione chirurgica degli animali 1. I soggetti sperimentali Utilizzare i topi del B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J linea transgenica 9; deformazione JAX # 7612) o di altri topi che esprime il blu sensibile alla luce canale cationico, channelrhodopsin-2, in neuroni corticali cerebrali. Applicazione di luce blu alla corteccia cerebrale del B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J linea transgenica fa sì che i neuroni piramidali che esprimono channelrhodopsin-2 per depolarizzare e sottoposti a potenziali d&#39;azione 9,10. Come conseguenza dell&#39;attivazione delle cellule piramidali, interneuroni locali sono attivati, e la variazione di potenziale viene propagata neuroni oltre il sito di stimolazione 10. Eseguire un intervento chirurgico in condizioni sterili in aderenza alle vigenti linee guida legislative: autoclave strumenti chirurgici e softpacks (campo chirurgico, garze); caldo tallone sterilizzare tutti calore ad elevata dispositivi metallici impiantati (cannule, viti e fili)per 30 secondi; Disinfettare dispositivi impiantabili calore intolleranti (cavo in fibra ottica, connettore di plastica) con un tuffo di 10 secondi in etanolo; colpo etanolo-tuffato articoli secco mediante l&#39;applicazione di aria compressa. 2. Anestesia, posizionamento stereotassico e Liquidazione del Teschio Utilizzare il IMPAC 6 integrato Multi paziente (Vet Equip Inc) sistema per anestetizzare il mouse. Utilizzare 5% Isoflurane/95% Ossigeno per l&#39;induzione e il 3% di ossigeno Isoflurane/97% per la manutenzione durante l&#39;intervento chirurgico. Posizionare l&#39;animale su un ricircolo di acqua coperta impostato a 37 C. Non è necessario controllare la temperatura corporea se la coperta è mantenuta a questa temperatura. 3. Preparazione del Teschio per l&#39;impianto Preparare il sito di incisione con la rasatura tutte le pellicce dalla parte superiore del cranio. L&#39;area rasata dovrebbe estendersi lateralmente da orecchio a orecchio e antero-posteriore dagli occhi fino alla fine posteriore del cranio. Disinfettare la pelle esposta con tre CONSECUTIVItamponi elettronici di betadine seguito da etanolo. Praticare un&#39;incisione mediale sulla parte superiore del cranio, dalle tra gli occhi al retro del cranio. Pulire il cranio con perossido di idrogeno e soluzione salina sterile (0,9% NaCl). Controllare il sanguinamento con uno strumento di cauterizzazione. Individuare e contrassegnare bregma e lambda per determinare le coordinate stereotassiche. Coordinate stereotassiche per elettrodi / optogenetic configurazioni stimolo che abbiamo utilizzato sono riportati in Tabella 1 e illustrato schematicamente nella Figura 1A. 4. Preparazione dei siti d&#39;impianto sul cranio Utilizzare un trapano ad alta velocità dentale con un po &#39;0,5 millimetri palla bava di stabilire ogni sito impianto nel cranio. Smussare il margine esterno di ciascun foro utilizzando una punta 0,7 millimetri palla bave per facilitare l&#39;inserimento delle viti. 5. Inserimento e fissaggio di cannule, EMG Cavi e cavi EEG Inserire le viti EEG (0,8 mm di lunghezza, con 2 cm di naturale 30-calibro-rame stagnato bus fili pre-saldato a vite testa) nei fori e spingerli in con una mano cacciavite a taglio di circa 4-5 giri per ottenere la profondità desiderata. Tenere cannule guida in posizione con un supporto stereotassica cannula e poi applicarle al cranio e ancoraggi con cemento acrilico. Ogni cannula guida deve contenere un manichino cannula / mandrino (Materie plastiche Uno, parte # C312 DC \ 1) dal momento dell&#39;intervento chirurgico al tempo della sperimentazione (10-14 giorni) per mantenere la pervietà. 6. Chiusura del sito chirurgico Una volta EEG e cannule guida sono posizionati nel cranio, collegare insieme con cemento acrilico dentale (Lang Dental - Ortho-Jet cemento). Dopo il set di cemento, posizionare il connettore di plastica (parte tecnologia Pinnacle # 8402) al di sopra del tumulo di cemento secco. Saldare le estremità dei fili provenienti dalla porta EEG ai contatti del connettore di plastica. Racchiudere i conduttori in cemento. Quindi disegnare i fili EMG attraverso il muscolo nucales facendoli scivolare nel cilindro di un ago 21ga trafitto muscolare. Cravatta nodo un chirurgo doppio di 5-0 sutura in nylon intorno a questi fili appena distalmente al cui esce il muscolo. Suturare insieme la pelle che è stata ritratta per accedere al tessuto muscolare con singoli nodi chirurgo interrotto, con una inversione di taglio P-3 e 5-0 aghi sutura in nylon. 7. Analgesia post-operatoria e ripristino Somministrare buprenorfina come analgesico (0,1 mg / kg, per via sottocutanea) e flunixin meglumina (0,1 mg / kg, per via sottocutanea) come un anti-infiammatorio immediatamente dopo l&#39;intervento chirurgico, e al giorno nei giorni 1-2 post-intervento chirurgico. Consentire agli animali di recuperare in condizioni standard abitative colonia per almeno sette giorni prima della sperimentazione. Senza cura supplementare al di là custodia colonie standard, cannule ci si può aspettare di rimanere brevetto per almeno due settimane con i mandrini interiori fissato in posizione. Sensori EEG e EMG può anche essere previsto per conservarefunzionalità per tutta la durata. 2. Generazione di impulsi temporizzato Luce 1. Programmazione dell&#39;unità Stimolo MC Collegare l&#39;MC-stimolo unità (sistemi multi-canale) tramite un collegamento USB a un computer desktop. Utilizzare il foglio di calcolo simile a MC-stimolo interfaccia utente per programmare l&#39;unità MC stimolo. Inserire il desiderato TTL (Transistor-Transistor Logic) di tensione per il periodo on, le durate di impulso e fuori periodi, il numero di cicli al secondo desiderati, e il numero totale di cicli ripetuti per l&#39;intera sessione di stimolo. Per ulteriori dettagli, vedere MC-stimolo manuale tecnico: 3. Produzione / Assemblaggio di fibra ottica PrOBE per la consegna della luce alla corteccia cerebrale <ol><li> Forniture e le apparecchiature necessarie sono disponibili all&#39;indirizzo: <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li><li> Taglio e lucidatura di cavi in fibra ottica. <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li></ol> 4. Montaggio del sistema di stimolazione Optogenetic roditori 1. Interfaccia di MC-Stimolo e Laser Una volta che la MC-stimolo unità è programmata, eseguirlo come uno stand-alone generatore di segnali di un 5-Volt binario segnale ON / OFF. Collegare l&#39;MC-stimolo unità alla abilitato di potenza del laser TTL con connettori BNC. 2. La produzione di uscita laser con cavo in fibra ottica Utilizzare il display digitale e variabile quadrante potenza dell&#39;unità di potenza del laser manualely regolare la potenza del laser. Collegare l&#39;unità di potenza del laser per il laser per mezzo di un cavo a nastro. Collegare la femmina FC (ghiera connettore) Adattatore fibra del laser al connettore maschio FC sul cavo in fibra ottica di patch (a 3 m di lunghezza, 200 micron di diametro di fibra di vetro rivestita di conduzione in luce riflessa acrilato rivestimento polimerico). 3. Trasporto il laser per l&#39;animale: Commutatore rotante Collegare il cavo a fibre ottiche di origine (3 m di lunghezza) e il cavo a fibre ottiche di consegna (45 cm di lunghezza) a estremità opposte del giunto rotante ottica che incassa due lenti collimanti (lenti doriche). La fibra ottica giunto rotante serve come commutatore: l&#39;animale si muove sulla sua gabbia, il giunto rotante ruota per prevenire la rottura dei cavi in ​​fibra ottica. Utilizzare fascette in plastica per fissare il commutatore ad un metallo stare collocato sopra la gabbia cilindrica in cui è alloggiato l&#39;animale. 4. Collegamento in fibra ottica di consegnaCavo a Testa Frena il mouse con una sola mano per bloccare il mouse sotto una palma a coppa. Orientare la testa tra centro dello sperimentatore e l&#39;indice. Rimuovere la cannula fittizia dalla cannula guida posizionato per la cannula in fibra ottica. Deselezionare la cannula guida di detriti utilizzando un ago sterile 25ga. Inserire il cavo in fibra ottica a mano e fissarlo alla cannula guida ottica fibra con un tappo a vite filettato recuperato da una cannula manichino. Controllare la profondità di inserimento del cavo in fibra ottica nel cervello da un nodo sutura legato sul cavo a fibra ottica ad una distanza fissa dal piatto spaccati end. L&#39;apparato sperimentale è mostrato in Figura 1B. 5. Misura di EEG definito sonno e concentrazione di lattato durante la stimolazione Optogenetic 1. Precalibration del sensore Lattato Pre-calibrazione del sensore lattato viene eseguita con un in vitroKit (parte Tecnologia Pinnacle # 7000-K1-T). Il sensore è equilibrata in tampone fosfato (pH 7,4), quindi esposto a tre concentrazioni di L-lattato in modo graduale per i protocolli del produttore. 2. Inserimento del sensore di lattato e cavo EEG Inserire il sensore pre-calibrato nel cranio montato cannula guida lattato in maniera identica alla procedura di cavo in fibra ottica di inserimento (paragrafo 4.4). Collegare il sensore del lattato al preamplificatore del biosensore 8400 Pinnacle bipolari con connettori a spina. Unire questo preamplificatore al connettore a 8 pin sul headmount chirurgicamente impiantati. 3. Stabilire intensità dello stimolo Optogenetic Prima della raccolta dei dati, utilizzare l&#39;intensità del laser manopola di controllo per regolare l&#39;intensità dello stimolo optogenetic. L&#39;ampiezza della risposta EEG varierà tra animali, a causa di fattori che non sono stati studiati sistematicamente, un<html> d deve essere verificata mediante ispezione visiva al momento della comparsa della stimolazione. In pratica, una intensità di 80-120 μWatts genere produrre un aumento dell&#39;ampiezza EEG di circa il 50% alla frequenza di stimolazione. Post-hoc analisi trasformata di Fourier veloce (vedere paragrafo 5.5) è necessario quantificare la grandezza assoluta della risposta. 4. Raccolta dei dati Raccogliere i dati utilizzando il sistema di Pinnacle 8400: <a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html</a> . 5. Elaborazione dati con Neuroscore Classificare dormire stati mediante ispezione visiva dei dati EEG e EMG con l&#39;interfaccia Neuroscore (DataSciences, internazionale: <a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp</a> ) o l&#39;interfaccia Sirenia (Pinnacle Tecnologia:f = target &quot;http://www.pinnaclet.com/sirenia.html&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Dati di processo in dieci secondi epoche come scia, non rapidi movimenti degli occhi del sonno, o rapidi movimenti degli occhi del sonno sulla base di EEG e EMG. Salvare i dati come fogli di calcolo Microsoft Excel per ulteriori analisi e test statistici.

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi qui presentati permettono di misurare la relazione tra sonno e cambiamenti nella concentrazione cervello del lattato glicolitico intermedio su una scala di tempo non possibile in precedenza. Gli animali sottoposti spontaneamente delle transizioni tra veglia, NREMS e REMS. Inoltre, siamo in grado di applicare stimoli optogenetic mentre gli animali sottoposti a queste transizioni. I dati raccolti fino ad oggi dimostrano che l&#39;impatto sia spontanea che indotta onde sulla lettura di un lattato ossidasi a base d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> BASi mouse Guida Cannula </td><td> Pinnacle Tecnologia / BASi Inc </td><td> 7032 </td><td></td></tr><tr><td> Biosensor lattato </td><td> Pinnacle Tecnologia </td><td> 7004 </td><td></td></tr><tr><td> Montato su testina </td><td> Pinnacle Tecnologia </td><td> 8402 </td><td></td></tr><tr><td> Sleep / Sistema di registrazione Biosensor </td><td> Pinnacle Tecnologia </td><td> 8400-K1-SL </td><td> 2 canali EEG, 1 canale EMG, e 1 biosensore </td></tr><tr><td> Mouse Tethered in vitro Kit di calibrazione </td><td> Pinnacle Tecnologia </td><td> 7000-K1-T </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ottica Guida Cannula </td><td> Plastics One </td><td> C312G </td><td> 21 gauge Guide Cannula </td></tr><tr><td> Cannula Dummy </td><td> Plastics One </td><td> C312DC </td><td> 21 Gauge Dummy </td></tr><tr><td> Diamante fibra Scribe </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Fibra Crimp strumento </td><td> Thorlabs </td><td> CT042 </td><td></td></tr><tr><td> Forcazioni Tubi </td><td> Thorlabs </td><td> FT030 </td><td> 03.0 millimetri </td></tr><tr><td></td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Max Dia. 0,012 </td></tr><tr><td> Forcazioni Tubo Stripper </td><td> Thorlabs </td><td> FTS3 </td><td></td></tr><tr><td> Bare Fiber Rivestimento duro Multimodale </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> Nucleo 200 micron, 0,37 NA </td></tr><tr><td> Filo Snips / Kevlar Cesoie </td><td> Thorlabs </td><td> T865 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ottica epossidica </td><td> Thorlabs </td><td> F112 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Fibra Stripper Strumento </td><td> Thorlabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lucidatura di vetro piatto </td><td> Thorlabs </td><td> CTG913 </td><td></td></tr><tr><td> Gomma lucidatura Pad </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td></td></tr><tr><td> Eye Loupe </td><td> Thorlabs </td><td> JEL10 </td><td></td></tr><tr><td> Kim Wipes </td><td> Thorlabs </td><td> KW32 </td><td></td></tr><tr><td> Aria compressa </td><td> Thorlabs </td><td> CA3 </td><td></td></tr><tr><td> Lucidatura Puck </td><td> Thorlabs </td><td> D50-xx </td><td></td></tr><tr><td> Fibra di controllo portata </td><td> Thorlabs </td><td> CL-200 </td><td></td></tr><tr><td> Films lucidatura </td><td> Thorlabs </td><td> LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC connettore finale </td><td> Thorlabs </td&gt; <td> 30126G2-240 </td><td> Alesaggio 240 micron, SS boccole </td></tr><tr><td> MC Stimolo </td><td> Sistemi multi-canale </td><td> STG-4002 </td><td></td></tr><tr><td> MC stimolo Software </td><td> Sistemi multi-canale </td><td> MC-stimolo V 2.1.5 </td><td></td></tr><tr><td> Blue Laser </td><td> CrystaLaser </td><td> CL473-050-0 </td><td></td></tr><tr><td> Laser Alimentazione </td><td> CrystaLaser </td><td> CL2005 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ottica comune Rotary </td><td> Lenti doriche </td><td> FRJ-v4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Materiali di consumo e attrezzature. </td></tr></tbody></table>

simultaneous electroencephalography, real-time measurement of lactate concentration and optogenetic manipulation of neuronal activity in the rodent cerebral cortex

Sebbene il cervello rappresenta meno del 5% della massa del corpo, utilizza circa un quarto del glucosio utilizzato dal corpo a riposo 1. La funzione del sonno non REM (NREMS), la più grande porzione di sonno da tempo, è incerto. Tuttavia, una caratteristica saliente di NREMS è una riduzione significativa nel tasso di utilizzazione del glucosio cerebrale rispetto alla veglia 2-4. Questo ed altri risultati hanno portato alla convinzione diffusa che il sonno ha una funzione relativa al metabolismo cerebrale. Tuttavia, i meccanismi alla base della riduzione del metabolismo del glucosio cerebrale durante NREMS restano da chiarire. Un fenomeno associato NREMS che potrebbero avere un impatto tasso metabolico cerebrale è la presenza di onde lente, oscillazioni a frequenze inferiori a 4 Hz, nel elettroencefalogramma 5,6. Queste onde lente rilevate a livello del cranio o cerebrali riflettono la superficie corticaleoscillazioni dei neuroni sottostanti tra uno stato depolarizzata / e uno stato iperpolarizzato / giù 7. Durante lo stato verso il basso, le cellule non subiscono potenziali di azione per gli intervalli fino a 100 diversi millisecondi. Restauro di gradienti di concentrazione ionici successivi potenziali d&#39;azione rappresenta un carico significativo sul metabolismo della cellula 8; assenza di potenziali d&#39;azione verso il basso durante stati associati NREMS può contribuire ad un metabolismo ridotto rispetto a svegliarsi. Due sfide tecniche dovevano essere affrontate per questo rapporto ipotetico da testare. Prima, è stato necessario misurare cerebrale metabolismo glicolitico con una risoluzione temporale riflettente della dinamica del EEG cerebrale (cioè, più di secondi piuttosto che minuti). Per fare ciò, abbiamo misurato la concentrazione di lattato, il prodotto della glicolisi aerobica, e quindi una lettura della velocità del metabolismo del glucosio nel cervello di topi. Lattato eramisurata con un sensore basato lattato ossidasi tempo reale incorporato nella corteccia frontale. Il meccanismo di rilevamento costituito da un elettrodo di platino-iridio circondato da uno strato di molecole di lattato ossidasi. Metabolismo del lattato dal lattato ossidasi produce perossido di idrogeno, che produce una corrente in platino-iridio elettrodo. Così un dilagare della glicolisi cerebrale fornisce un aumento della concentrazione di substrato per lattato ossidasi, che poi si riflette in un aumento di corrente all&#39;elettrodo di rilevamento. Era inoltre necessario misurare queste variabili mentre manipolando l&#39;eccitabilità della corteccia cerebrale, in modo da isolare la variabile da altre sfaccettature NREMS. Abbiamo messo a punto un sistema sperimentale per la misura simultanea di attività neuronale attraverso il elecetroencephalogram, misura del flusso glicolitico tramite un biosensore lattato, e la manipolazione di attività cerebrale corticale neuronale attraverso l&#39;attivazione optogenetic di piramideneuroni Midal. Abbiamo utilizzato questo sistema per documentare la relazione tra sonno-correlati e le forme d&#39;onda elettroencefalografica momento per momento dinamiche di concentrazione di lattato nella corteccia cerebrale. Il protocollo può essere utile per qualsiasi individuo interessato a studiare, a comportarsi liberamente roditori, il rapporto tra attività neuronale misurata a livello elettroencefalografico ed energetica cellulari all&#39;interno del cervello.

<html> Come mostrato in figura 2, un mouse per la stimolazione optogenetic e lattato / EEG / EMG la raccolta dei dati sono stati sottoposti spontanee sonno / veglia transizioni di stato, mentre EEG, EMG e la concentrazione di lattato cerebrale sono stati monitorati in continuo. Corrente del sensore di aumento della lattato durante i periodi di bassa ampiezza EEG e una diminuzione durante i periodi di alta ampiezza EEG. Come mostrato in figura 3, entrambi i canali del E...

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Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

La procedura è descritta per manipolare l&#39;attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l&#39;elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

simultaneous-electroencephalography-real-time-measurement-lactate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.1K Views.  Washington State University. La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.

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Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

FMRI simultanea ed Elettrofisiologia nel cervello roditori

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

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Neuroscienze

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic field pulses. The initiation of cortical activation or its modulation depends on the background activation of the neurons of the cortical region activated, the characteristics of the coil, its position and its orientation with respect to the head. TMS combined with simultaneous electrocephalography (EEG) and neuronavigation (nTMS-EEG) allows for the assessment of cortico-cortical excitability and connectivity in almost all cortical areas in a reproducible manner. This advance makes nTMS-EEG a powerful tool that can accurately assess brain dynamics and neurophysiology in test-retest paradigms that are required for clinical trials. Limitations of this method include artifacts that cover the initial brain reactivity to stimulation. Thus, the process of removing artifacts may also extract valuable information. Moreover, the optimal parameters for dorsolateral prefrontal (DLPFC) stimulation are not fully known and current protocols utilize variations from the motor cortex (M1) stimulation paradigms. However, evolving nTMS-EEG designs hope to address these issues. The protocol presented here introduces some standard practices for assessing neurophysiological functioning from stimulation to the DLPFC that can be applied in patients with treatment resistant psychiatric disorders that receive treatment such as transcranial direct current stimulation (tDCS), repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS), magnetic seizure therapy (MST) or electroconvulsive therapy (ECT).

The protocol presented here is for TMS-EEG studies utilizing intracortical excitability test-retest design paradigms. The intent of the protocol is to produce reliable and reproducible cortical excitability measures for assessing neurophysiological functioning related to therapeutic interventions in the treatment of neuropsychiatric diseases such as major depression.

Stimolazione magnetica transcranica combinata e l'elettroencefalografia della corteccia prefrontale dorsolaterale

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

Cryosectioning simultanea di più cervelli roditore

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...