The authors thank Mona Chambers, Geoffrey Hidalgo and Maurissa Two Two for their technical assistance. We also thank Dr. Earl White for amino acid analysis, Dr. Roger Simonds for analysis of pollen for pesticides, and Drs. Stanley S. Schneider, Vanessa Corby-Harris and Kirk Anderson for their reviews and discussion of earlier versions of the manuscript and many helpful suggestions.

1. Ottenere beebread da AHB e EHB Colonie <ol><li> Mettere trappole polline sul miele colonie di api e raccogliere il polline. Macinare il polline in una polvere fine (simile a polline far da antere) con un macinino da caffè. </li><li> Stabilire 5 colonie ciascuno di AHB e EHB in un&#39;area recintata di volo (EFA), in modo che le api foraggio solo sul polline fornito. Per evitare che i lavoratori alla deriva tra EHB e colonie AHB, dividere la EFA in sezioni separate, in modo che le api non possono attraversare tra di loro. Mettere EHB individuo o colonie AHB con 3500-4000 api operaie, pettine di cera con nettare, miele, covata immaturo e pettine vuoto in ogni sezione del EFA. NOTA: Le colonie non hanno conservato il polline quando stabilito. La velocità che il polline viene memorizzato può essere aumentato di non includendo una regina, che nelle colonie. </li><li> Feed polline terra per colonie inserendo un vassoio con il polline in ogni sezione del EFA. Diffusione circa 60 g di polline su ciascun vassoio in modo che foraging api possono ritirarla carichi come corbicular e conservare il polline nelle loro colonie come beebread. Continuare fornendo polline fresco su ciascun vassoio giorno per 3 settimane. </li><li> Fare riferimento alle beebread dalle colonie europee beebread europeo (EBB), e da colonie africanizzate come beebread africanizzate (ABB). </li></ol> 2. Api di alimentazione in gabbie <ol><li> Luogo fotogrammi di sigillato covata lavoratore AHB e EHB colonie in gabbie emergenza separati in una camera ambientale fissati a 32-34 ° C e il 40% di umidità relativa .. </li><li> Quando gli operai emergono e sono circa 24 ore di età, stabilire 12 plexiglas biodosaggio gabbie (dimensioni = 11,5 x 7,5 x 16,5 centimetri 3) e aggiungere o 100 EHB appena emerse o 100 nuovi emersi AHB api operaie per ogni gabbia. Mettere una sezione di pettine con un numero noto di cellule sia EBB o ABB (24-30 cellule per gabbia) in ogni gabbia per generare le seguenti combinazioni di trattamento: AHB fed ABB, EHB fed ABB, AHB nutriti EBB e EHB fed EBB. (4 trattamenti; 6gabbie per il trattamento; 24 gabbie in totale). </li><li> Aggiungi fiale di acqua e un miele del 50% e la soluzione di acqua formulati in volume per ogni gabbia. Riempire i flaconi miele e acqua al giorno per il periodo di studio 11 giorni. </li></ol> 3. Api campionamento dei lavoratori e beebread e stima del consumo <ol><li> Esempio 10 recentemente emerse EHB e AHB lavoratori prima di metterli nelle gabbie. Fare riferimento a questi come giorno 0 api e li servono come base per concentrazioni di proteine ​​emolinfa. </li><li> Rimuovere 10 api da ogni gabbia dopo che nutrivano EBB o ABB per 4, 7, e 11 giorni. </li><li> Posizionare le api vive in tubi microcentrifuga individuali e impostare su impacchi di ghiaccio. Selezionare un sottocampione di quattro api per l&#39;analisi della concentrazione di proteine ​​emolinfa. </li><li> Dopo aver assaggiato le api il giorno-11, contare il numero di celle a pettine che contengono ancora beebread. Si tratta di una misura relativa del consumo beebread. </li><li> Rimuovere il beebread restante dalle cellule in ogni gabbia e memorizzare in SEPARmangiato microprovette secondo gabbia. Mantenere i campioni beebread a -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi per pH, concentrazione di proteine ​​solubili, e il contenuto di amminoacidi. </li></ol> 4. Stima pH di polline e pappa reale di api <ol><li> Prendete sei casuali 0,3 g campioni di polline alimentato per le api nel EFA e farla sciogliere in 300 ml di acqua distillata. Misurare il pH con un impermeabile doppia giunzione pH lancia con una precisione di 0,01. </li><li> Prendere 0,3 g campione di beebread che è rimasto dopo il periodo di alimentazione di 11 giorni in ogni gabbia. Sciogliere il beebread in 300 ml di acqua distillata e la misura del pH come descritto per polline (4.1). </li></ol> Analisi 5. Proteine <ol><li> Prendete sei campioni di polline e di un campione di EBB e ABB da ogni gabbia. Conservare i campioni a -20 ° C fino analizzati per la concentrazione di proteina solubile. </li><li> Mescolare 20 mg di una polline o beebread con 1.000 ml di 0,1 M tampone fosfato (PBS). </li><li> VoRTEX la miscela per 10 secondi e centrifugare a 571,2 g per 1 min. </li><li> Rimuovere un campione di 10 ml del surnatante e posto in pozzetti di una ben fondo piatto lastra di polistirene 96 EIA / RIA. Replicare ogni campione in tre pozzi. </li><li> Disegnare emolinfa dalle api raccolte da ogni gabbia inserendo un tubo capillare 20 microlitri (che era stato riscaldato e tirato ad un punto ago-sharp) nella porzione laterale destra del torace vicino al punto di attacco delle ali. Raccogliere emolinfa aggiuntivo, se necessario, inserendo lo stesso tubo nella membrana tra le tergiti addominali. </li><li> Aggiungere 1 ml di emolinfa a 9 ml di 0,1 M PBS. Conservare la soluzione emolinfa a -20 ° C fino all&#39;analisi per proteina solubile. </li><li> Determinare totale concentrazioni di proteine ​​solubili nel polline, pappa reale di api, e campioni emolinfa utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​Bradford commerciale. Seguire le istruzioni del produttore. </li><li> Stabilire una curva standard per stimare proteina solubile concentration nei campioni misurando proteina assorbanza con concentrazioni di proteine ​​note in albumina di siero bovino (BSA). Misurare proteina assorbanza a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro. </li></ol> 6. Amino Acid Analysis <ol><li> Piscina campioni individuali da cellule favo di ogni colonia per creare un campione rappresentativo di EBB e ABB per l&#39;analisi. </li><li> Prendete un 50 mg di polline o campione beebread pesato in vial, e aggiungere 1 ml di acqua distillata al flacone, insieme a 100 ml di una soluzione di 50 ng / ml di standard interno costituito da d 4 -alanina, d 23 Acido -lauric, 13 C 6 Glucosio e d 39 acido -arachidiac. </li><li> Tappare il campione e ultrasuoni per 5 min. </li><li> Presupposti una cartuccia HLB aggiungendo 1 ml di metanolo, equilibrato aggiungendo 1 ml di acqua distillata seguita dalla aggiunta di 1 ml del campione beebread o il polline. Lavare la cartuccia con 1 ml di 5,0% MeOH / H 2 O e Elute con 1 ml di 80% MeOH / H 2 O. </li><li> Evaporare il campione a secco sotto corrente di azoto. Ricostituire il campione con 50 ml di piridina e 100 ml di N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetammide + Trimetilclorosilano (BSTFA + TMCS). </li><li> Cap e incubare il campione a 70 ° C per 30 min. </li><li> Lasciare raffreddare il campione e trasferirlo ad un campionatore provetta pulita. </li><li> Cap e posizionare il campione in un rivelatore selettivo di massa interfacciati ad un gas cromatografo per analizzare i campioni sia per i composti volatili e acidi organici. Separare gli zuccheri e acidi organici seguenti TMS derivatizzazione con BSTFA + TMCS usando una colonna (30 mx 0,25 mm di diametro) con spessore 1,0 micron pellicola. </li><li> Impostare il forno a colonna a 50 ° C per 2 min, quindi aumentare la temperatura linearmente a 290 ° C a 5 C / min. e tenere premuto per 7 min. Impostare l&#39;iniettore GC e GC interfaccia / MS a 250 ° C e 290 ° C rispettivamente. <ol><li> Utilizzare elio come vettore in un flotasso w di 1,0 ml / min. Impostare la temperatura della sorgente di MS a 230 ° C. </li></ol></li><li> Tune e calibrare lo spettrometro di massa ogni giorno con perflurotributilammina (parte dell&#39;PFTBA). Utilizzare una iniezione 1 ml di parte dell&#39;PFTBA nella scansione completa (35-700 amu) modalità ioni positivi per ottenere dati sulla presenza e concentrazione di aminoacidi. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo scoperto che il beebread fatta da AHB è stato consumato in quantità maggiore da parte sia AHB e EHB. Sebbene EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread, AHB aveva maggiori emolinfa titoli di proteine. I risultati basati sui nostri metodi erano simili ai precedenti, dove i livelli di proteina emolinfa in AHB erano superiori in EHB se entrambi sono stati alimentati la stessa dieta 26. Misurando il consumo di EBB e ABB che sono stati consumati a velocità diverse da parte sia EHB e AHB, è stato stabilito che la concentrazione di proteine ​​emolinfa in ogni sottospecie non poteva essere sollevata, aumentando il consumo di cibo. Sembra che ci sia un plateau di concentrazione di proteine ​​emolinfa in lavoratori di età infermiere api e che il set point per l&#39;altopiano è più alto in AHB di EHB. Ci sono diverse condizioni importanti per stabilire colonie per la produzione di pappa reale di api che ottimizzano la velocità di archiviazione polline. Innanzitutto, la colonies bisogno telai con covata aperta. Senza covata aperta per nutrire, i lavoratori non raccoglie molto polline. In secondo luogo, la colonia deve essere queenless quindi non covata addizionale viene prodotto. Brood allevamento richiede grandi quantità di polline, e solo il polline in eccesso viene immagazzinata. Nelle piccole colonie stabilite in EFA, ci sarebbe poco di polline deve essere conservato come beebread se le aree di covata sono state espandendo così le colonie devono essere queenless. Infine, per beebread da effettuare, il polline deve essere raccolto come carichi corbicular e conservato in celle pettine. Se il polline viene raccolto in trappole polline, deve essere ridotta in polvere fine, prima di fare le api modo che possano raccogliere come carichi corbicular. I metodi per misurare il consumo di beebread generato qualitative piuttosto che stime assolute. L&#39;unico consumo che è stato contato è stato quando le cellule sono state completamente svuotate di pane d&#39;api. Una stima più accurata del consumo totale pane ape può essere ottenuta rimuovendo il br apeead dalle cellule e farne una polpetta che potrebbe essere pesati prima e dopo il periodo di studio. Tuttavia, abbiamo voluto mantenere il pane ape nelle cellule in modo che le api potrebbero nutrirsi di esso come farebbero in una colonia e forse continuare l&#39;elaborazione durante il periodo di studio. La differenza di peso delle sezioni pettine prima e dopo lo studio non è stato usato come stima del consumo perché il peso potrebbe aumentare perché api mettere il miele diluito alimentato loro in alcune cellule. I lavoratori potrebbero anche hanno aggiunto alcuni del miele diluito al pane d&#39;api. Per queste ragioni, cellule contenenti approssimativamente uguali quantità di pane ape prima e dopo il periodo di alimentazione sono state contate e generati una misura qualitativa. Tuttavia, vi era una differenza evidente tra i due tipi di beebread del numero di celle vuote ABB contate rispetto EBB dopo 11 giorni. Determinare quando polline conservato diventa beebread può essere difficult perché le api aggiungono continuamente polline per le cellule. Le colonie usate per la produzione di pappa reale di api sono state stabilite con cornici di covata aperte così le api sarebbero raccogliere il polline. Tuttavia, le colonie erano queenless quindi c&#39;erano larve per alimentare solo per circa 9 giorni dopo la colonia è stata stabilita. Per il resto del periodo di 3 settimane, quando le colonie erano in EFA, il polline che le api raccolti sono stati conservati e di essere convertiti in beebread. Mantenere il polline immagazzinato nelle cellule pettine per ulteriori 11 giorni in cui l&#39;alimentazione è per le api in gabbie anche può aver continuato il trattamento di polline beebread. La conversione di polline al pane d&#39;api richiede circa 7 giorni 8. Il beebread alimentato a EHB e AHB aveva minore pH e concentrazioni di proteine ​​ridotte rispetto alla Fed polline. Risultati simili di cambiamenti nel polline dopo beebread conversione sono stati segnalati da altri 7,10,27. I nostri risultati differiscono da precedenti relazioni tuttavia, in che c&#39;erano differenze nelle concentrazioni of alcuni aminoacidi tra beebread e polline. I cambiamenti in entrambe le concentrazioni di acido proteine ​​e aminoacidi potrebbe essere dovuta all&#39;attività di enzimi proteolitici, la cui fonte potrebbe essere le api stesse o delle comunità microbiche stabiliti nel beebread 7,8,28,29. I metodi utilizzati per misurare la concentrazione della proteina erano simili a quelli precedentemente descritti per determinare gli effetti di proteine ​​alimentari su Africanized e api europee 26. Come estensione dei metodi, siamo stati in grado di stimare proteina solubile nel polline e pappa reale di api. Tali metodi hanno generato risultati simili a precedenti rapporti 7,10,27. I nostri risultati forniscono ulteriori prove che AHB più efficiente assimilare proteine ​​nella dieta di EHB, e che questo potrebbe essere un fattore chiave per il dominio ecologico di AHB nella maggior parte delle regioni in cui è emigrato e affermata 30-32.

La nutrizione gioca un ruolo fondamentale nella salute e il vigore di miele colonie di api e nel loro stabilimento come popolazioni. Nutrienti dal cibo forniscono energia e componenti biochimici necessari per allevamento della covata, termoregolazione, foraggiamento e la risposta immunitaria. Per miele colonie di api, i nutrienti necessari per crescere popolazioni delle colonie e mantenere la loro salute viene da nettare e polline. Nettare fornisce carboidrati e polline fornisce le esigenze alimentari restanti quali proteine, lipidi, vitamine e minerali 1. Sottospecie di api possono differire nei parametri a livello di colonia a base nutrizionale come la longevità lavoratore, covata allevamento, e meccanismi di immunità sociale 2-6. Queste differenze possono essere collegati a come il cibo, specialmente il polline viene elaborato dalla colonia e digerito in individui. Il polline è immagazzinato nelle cellule pettine e attraverso microbiologicamente mediato fermentazione lattica viene modificato chimicamente <sup&gt; 7-10. Il polline fermentato si chiama beebread. Ci potrebbero essere delle differenze genotipiche tra sottospecie nella loro capacità di acquisire le sostanze nutritive dal polline che raccolgono e memorizzare e questo potrebbe influenzare la crescita e la sopravvivenza delle colonie. Effetti genotipici sulla trasformazione dei prodotti alimentari e l&#39;acquisizione dei nutrienti sono stati documentati in altri organismi che causano alcuni individui di ottenere più sostanze nutritive e calorie rispetto ad altri consumando gli stessi cibi 11-14. Qui si descrivono i metodi utilizzati per confrontare la composizione e il consumo di beebread fatta da diverse sottospecie di api. Metodi per misurare le conseguenti emolinfa titoli di proteine ​​in api operaie sono anche descritti. Precedenti studi sulla composizione nutrizionale del beebread sono stati fatti con le api europee miele (EHB) 10,15,16. Tuttavia, ci possono essere differenze di beebread fatta da api di diverse sottospecie, anche quando si nutrono lo stesso polline. EHB e AHB sono stati confrontati, perché questi subwooferpecies hanno differenze comportamentali e fisiologiche distinte che potrebbero essere collegati alla trasformazione dei prodotti alimentari e dei nutrienti acquisizione 17. Alcune delle differenze più importanti sono che AHB raccogliere e consumare più polline di EHB e sembrano per convertire più facilmente in covata 18. Colonie AHB hanno tassi più elevati rispetto brulicanti EHB e tentare la fuga, quando le risorse alimentari diventano limitate 19-23. Fuga è rara in EHB. AHB hanno anche tassi metabolici più elevati rispetto EHB 24. La base nutrizionale per le differenze a livello di colonia tra EHB e AHB potrebbe essere correlato al tasso di raccolta del polline e anche per il suo contenuto di nutrienti (ad esempio, aminoacidi e proteine) dopo che è stato convertito in beebread. Consumo beebread e la conseguente acquisizione di proteine ​​anche potrebbero svolgere un ruolo nelle differenze a livello di colonia tra EHB e AHB. Utilizzando i metodi sviluppati, EHB e AHB reso beebread dalla stessa fonte di polline. La pappa reale di api è stata reimmessa alle api di each sottospecie e potrebbe determinare se api acquisiscono proteine ​​da beebread in modo distintivo ai loro sottospecie o alla fonte del beebread.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waterproof double junction pH spear&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td>Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coffee Grinder</td>
			<td>Mr. Coffee&#160;</td>
			<td>model 1DS77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffer solution</td>
			<td>Emd-millipore</td>
			<td>BSS-1005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EIA/RIA polystyrene plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Corning</td>
			<td align="left">CLS3590-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microcapillary pipets</td>
			<td>Kimble Glass Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#500-0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td>Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Synergy HT&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mass Selective Detector&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5973N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HLB cartridge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gas chromatograph&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>6930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;gas chromatography column&#160;</td>
			<td>A J&#38;W Scientific&#160;</td>
			<td>DB-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">d4-alanine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>488917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">d23-lauric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>451401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">13C6-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyridine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide +&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perfluorotributylamine (PFTBA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442747-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">d39-arachidiac acid</td>
			<td>Cambridge Isotope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td>Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for comparing nutrients in beebread made by africanized and european honey bees and the effects on hemolymph protein titers

Le api da miele ottenere nutrienti dal polline che raccolgono e conservare in alveare come beebread. Abbiamo sviluppato metodi per controllare la fonte di polline che le api raccolgono e convertono beebread mettendo colonie in una zona chiusa volo appositamente costruito. I metodi sono stati sviluppati per analizzare le proteine ​​e aminoacidi composizione acida del polline e pappa reale di api. Descriviamo inoltre come il consumo del beebread è stata misurata e metodi utilizzati per determinare operaie adulte titoli proteine ​​ape emolinfa dopo nutrendosi di beebread per 4, 7 e 11 giorni dopo la nascita. I metodi sono stati applicati per determinare se il genotipo riguarda la conversione di polline beebread e il tasso api consumano e acquisiscono proteina da esso. Due sottospecie (api mellifere europee e africanizzate, EHB e AHB rispettivamente) sono stati forniti con la stessa fonte di polline. Sulla base dei metodi sviluppati, beebread fatta da entrambe le sottospecie aveva concentrazioni di proteine ​​più bassi e valori di pH che il polline. In generale, ammino con acidocentrazioni in beebread prese dal EHB o AHB erano simili e si sono verificate a livelli superiori a beebread che nel polline. Sia AHB e EHB consumato significativamente più del beebread fatta da AHB che da EHB. Sebbene EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread, concentrazioni di proteine ​​emolinfa in AHB erano superiori a EHB. Le differenze di acquisizione delle proteine ​​tra AHB e EHB potrebbero riflettere adattamenti ambientali legati alla regione geografica dove ogni sottospecie si sono evoluti. Queste differenze potrebbero contribuire alla creazione di successo delle popolazioni AHB nel Nuovo Mondo a causa degli effetti sulla covata allevamento e la crescita delle colonie.

<html> Beebread stato immagazzinato nel -80 ° C per meno di un mese prima di essere analizzati per pH e la concentrazione di proteine, e per circa 4 mesi prima analisi degli aminoacidi. Beebread differiva dal polline in pH e concentrazione di proteine ​​(Figura 1). Il pH beebread era inferiore al polline era la concentrazione di proteine. Sia EHB e AHB consumato più ABB di EBB (Figura 2). I livelli di proteina solubile nel emolinfa di AHB erano significativamente superiori EHB indipendentemente dal tipo di beebread hanno consumato (figura 3). Queste differenze nei livelli di proteina emolinfa si sono verificati anche se EHB e AHB consumato quantità simili di ogni tipo di beebread. L&#39;età delle api al momento del campionamento influenzato significativamente le concentrazioni di proteine ​​solubili nel emolinfa. Le concentrazioni di proteine ​​erano significativamente più bassi in day-4 api rispetto al giorno 7 o 11 che non differiscono. _content &quot;&gt; Dei 10 amminoacidi che sono essenziali per api, tutti tranne istidina sono stati rilevati nel polline. Nella maggior parte dei casi, le concentrazioni di aminoacidi misurate in beebread erano superiori nel polline (figura 4). Per esempio, le concentrazioni di leucina e treonina erano superiori di circa il 60% in beebread rispetto al polline, e valina concentrazioni erano superiori di circa il 25%. alanina, acido livelli, glutammina, metionina e aspartico anche erano superiori in beebread che nel polline. concentrazioni Aminoacidi non differiscono notevolmente tra ABB e EBB con l&#39;eccezione di fenilalanina e cisteina. livelli di fenilalanina erano circa il doppio in ABB rispetto sia con EBB o polline. Le concentrazioni cisteina erano inferiori in EBB rispetto a ABB o polline. triptofano era l&#39;unico aminoacido presente in concentrazioni più elevate in polline che in EBB o ABB. Le concentrazioni di prolina in polline e ABB erano superiori in EBB. Figura 1: Confronti di pH (A) e le concentrazioni di proteine ​​solubili (B) nel polline e pappa reale di api da parte europea (EHB) o Africanized (AHB) api. Il pH di polline era significativamente superiore alla beebread come determinato mediante analisi della varianza (F 2,12 = 3725, p &lt;0,0001) seguito da un test di confronto multiplo Tukeys W-. La concentrazione di proteine ​​nel polline era significativamente più alta rispetto a beebread fatta da EHB (EBB) o AHB (ABB) (F = 2,27 16.49; p &lt;0.0001). Mezzi seguiti dalla stessa lettera non sono significativamente differenti al livello 0,05. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: La percentuale media di cells contenenti beebread che sono state completamente consumato in un intervallo 11 giorni dalle api in gabbia. La beebread è stata fatta da uno europeo (EHB) o Africanized (AHB) le api utilizzano la stessa sorgente di polline. Mezzi sono stati stimati da cinque gabbie di ogni trattamento; quelli con la stessa lettera non sono significativamente differenti al livello 0,05 come determinato da un&#39;analisi uno della varianza (F 3,16 = 7.3, p = 0,003) e W test di Tukey. Questa figura è stata modificata da 25. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: la concentrazione media di proteine ​​in emolinfa da europeo (EHB) o Africanized (AHB) api mellifere beebread alimentato fatta da africanizzate (ABB) api europeo (EBB) o per 4, 7, e 11 giorni Una analisi ripetute misure di. varianza ha indicato differenze significative tra il 4 treagruppi TIMENTO (F 3,20 = 19,7, p &lt;0.001). I livelli di proteina solubile in AHB fed ABB erano significativamente superiori a EHB fed ABB (p = 0.008) o EBB (p = 0,018). L&#39;età delle api al momento del campionamento influenzato significativamente le concentrazioni di proteine ​​solubili nel emolinfa. Livelli erano significativamente più bassi in day-4 api rispetto ai giorni-7 (p &lt;0,0001) o 11 (p = 0.001). Giorno 7 e Day11 api non differivano (p = 0,149). Questa cifra è stata modificata da 25. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Concentrazioni di aminoacidi (mcg per grammo di polline o beebread) nel polline o beebread fatta da esso EBB è beebread fatta dalle api europee e ABB è stata fatta dalle api africanizzate. Triptofano, cisteina, fenilalanina e prolina sono state tracciate separatamente a fini di chiarezza in presentano loro quantità. Questa cifra è stata modificata da 25.

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Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Views.  USDA-ARS. Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies. 

Video: Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

Agopuntura Effetti monitoraggio cervello umano da fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Ricerca

Biologia

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantificazione di site-specific Protein lisina acetilazione e stechiometria Succinylation usando la spettrometria totale di acquisizione dati-indipendente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...