We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Preparazione di vetrini di vetro <ol><li> Sterilizzare 12 millimetri di diametro tondo vetrini, mettetelo a bagno in etanolo al 70% per almeno 10 minuti con agitazione occasionale per garantire l&#39;esposizione totale di tutti i vetrini per l&#39;etanolo. Versare coprioggetto di vetro e l&#39;etanolo in un piatto di coltura cellulare sterile (o sei centimetri o 10 cm di diametro). </li><li> Con un paio di sterili fini 5B pinze, prendere e posizionare ogni singolo vetrino di vetro in un pozzo di una piastra ben cluster di 24. Fate attenzione che i coprioggetti non tocchino le pareti del pozzo e sono circa a metà del pozzo. </li><li> Lasciare la piastra ben grappolo non-coperto 24 con vetrini ad asciugare al gabinetto di flusso. Questo richiede circa 10 min </li><li> Durante questo periodo, preparare la miscela di rivestimento diluendo 10 mg / ml di fibronectina umana in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 0,1 mg / ml. </li><li> Quando i coprioggetti sono asciutti, pipettare 100 ml di soluzione di rivestimento su ciascun co vetroverslip così la soluzione copre solo il vetro senza riunendo intorno alla parte esterna del pozzo. Posizionare la piastra a 24 pozzetti di cluster coperto in un incubatore di coltura cellulare per almeno un&#39;ora. </li><li> Appena prima dell&#39;uso, rimuovere la soluzione di rivestimento. La stessa soluzione di rivestimento può essere trasferito in una provetta sterile e utilizzato fino a tre volte senza perdita visibile di efficacia. </li></ol> 2. Preparazione di endoteliali monostrato cellulare <ol><li> Cellule di coltura umane coronarico endoteliali (EC) in mezzo a 37 ° C e 5% di anidride carbonica. </li><li> Aspirare off terreni di coltura e risciacquare monostrato CE con 10 ml di HBSS </li><li> Aspirare off HBSS e aggiungere 2 ml di 0,5% tripsina, soluzione di EDTA 0,2%. Incubare a temperatura ambiente per circa 5 minuti. </li><li> Quando CE da poter essere rimosse da un rubinetto per il lato del pallone, aggiungere 5 ml di inibitore della tripsina di soia e con pipetta spruzzare la superficie del pallone per rimuovere ulteriormente le cellule. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare la provettaa 200 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet CE in 5 ml di media. Contare le cellule con un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare a 50.000 CE per ml di supporti CE. </li><li> Dispensare 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra ben 24 contenente vetrini rivestiti. Incubare le cellule O / N in colture cellulari incubatore a 37 ° C più il 5% di anidride carbonica. </li><li> Le cellule sono pronte per l&#39;uso negli esperimenti quando un monostrato confluente si forma, entro 3 giorni. </li></ol> 3. Preparazione dei monociti <ol><li> Trasferire cellule HL-60 che sono coltivate in RPMI integrato con siero di vitello fetale al 10%, come coltura in sospensione, in un tubo 15 ml. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 ml media e regolare la concentrazione cellulare con supporti a 2 milioni di cellule / ml. Se si desidera etichettatura fluorescenza del HL-60, risospendere le cellule in RPMI senza siero e proceed come descritto nella sezione 4. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di HL-60 sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti cluster contenente monostrato CE ed incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% di biossido di carbonio per un periodo fisso di tempo scelto tra 1 e 3 h. Poca differenza è osservata tra 1 ora e 3 ore time-point, in cui la saturazione di legame è raggiunto. </li><li> Preparati per cella lavaggio / raccolta: Riempite un tubo da 120 ml con 100 ml di HBSS. Dispensare 1 ml di formalina in ciascun pozzetto di una piastra ben 24 fresco. </li><li> Dopo il periodo di incubazione, utilizzare un paio di pinze taglienti e prendere il vetrino di vetro dal pozzo e tenere premuto il vetrino verticale e tamponare il bordo del vetrino su un pezzo di tessuto in panchina per 3 secondi, facendo attenzione a non toccare la superficie cellulare-coperta del vetrino con il tessuto. </li><li> Tenendo il vetrino saldamente con un paio di pinze, dunk il vetrino dentro e fuori le HBSS cinque volte. </li><li> Dopo il quinto dunkin HBSS, tamponare il bordo del vetrino sul tessuto per 3 sec. </li><li> Ripetere le procedure nelle schiacciate e tamponando descritte in 3.6 e 3.7, per un totale di tre serie di 5 schiacciate seguiti da una piccola quantità. </li><li> Trasferire il vetrino in un pozzo contenente il 10% di formalina per fissare le cellule a RT. Il vetrino è pronto per il conteggio, per la conservazione a lungo termine o da sottoporre ad altre procedure descritte di seguito. </li></ol> 4. Etichettatura di HL-60 celle con Tracker cellulare (facoltativo) <ol><li> Contare e trasferire quantità appropriata di cellule HL-60 (ad esempio, 10 milioni) in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifuga cellule HL-60 a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante. </li><li> Pellet cellulare Risospendere in Tracker cellulare in RPMI media senza siero ad una concentrazione di 1 milione di cellule / ml. Incubare le cellule in coltura cellulare incubatore per 1 ora. </li><li> Cellule centrifugare a 200 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Pellet cellulare Risospendere in media per una concentrazione di 2 milioni di cells / ml. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di cellule Tracker marcati HL-60 in ciascun pozzetto contenente cellule endoteliali coltivate su vetrino di vetro. Continuare a 3.3. </li></ol> 5. enumerazione delle cellule endoteliali Adhesive <ol><li> Mount coprioggetto su vetrini da microscopio con DAPI contro-macchia per identificare le cellule individuali. </li><li> Utilizzando un microscopio rovesciato con un obiettivo 4X o 10X, acquisire immagini di diversi settori (ad esempio, 5 campi) e contare il maggior numero di monociti che si aggregano sulle cellule endoteliali non-irradiati (Questo dovrebbe essere tipicamente 3-5). </li><li> Impostare numero doppio come soglia di monociti su cellule endoteliali a quello definito come cluster. Se necessario, un criterio diverso può essere utilizzata per definire un cluster a seconda della natura dell&#39;esperimento. </li><li> Contare il numero di cluster e il numero di cellule endoteliali nel campo. Dividere il primo da quest&#39;ultimo per ottenere la percentuale di cellule endoteliali adesive. Puntonumerosi campi per ottenere un media e deviazione standard dei conti. </li></ol> 6. Controcolorazione con Anticorpi <ol><li> Dopo il test di adesione e le cellule sul vetrino sono stati fissati in formalina al 10% per 15 minuti a temperatura ambiente, sottoporre i coprioggetti per immunofluorescenza con procedura standard 10 e anticorpi di scelta. </li><li> Aggiungere e rimuovere le varie soluzioni molto delicatamente per evitare di spostare i monociti che sono collegati alle cellule endoteliali. </li></ol> 7. Controcolorazione per senescenza associata beta-galattosidasi Activity <ol><li> Dopo il test di adesione e le cellule sul vetrino sono stati fissati in formalina per 15 minuti, macchia per attività beta-galattosidasi senescenza associata, come descritto nelle istruzioni che accompagnano il kit di colorazione. Aggiungere e rimuovere le varie soluzioni molto delicatamente per evitare di spostare i monociti che sono collegati alle cellule endoteliali. </li></ol>

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	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il dosaggio monociti sopra descritta è stata utilizzata con successo in esperimenti volti a studiare gli effetti biologici delle radiazioni ionizzanti su monostrati endoteliali 10. Anche se questo non è l&#39;unico metodo disponibile per valutare l&#39;adesività di un monostrato endoteliale, è l&#39;unico metodo che consente la quantificazione della proporzione o percentuale di cellule endoteliali in un monostrato che è adesivo. Questa è una distinzione importante come cambiamento quantitativo globale nell&#39;adesione dei monociti, come misurato mediante altri metodi può essere attribuito sia a un aumento generale adesività di tutte le cellule del monostrato endoteliale o all&#39;aumento adesività di un sub-popolazione di cellule endoteliali all&#39;interno del monostrato, come mostrato nell&#39;esempio precedente. Il valore di avere queste informazioni è esemplificato dal fatto che la capacità di quantificare la percentuale di cellule endoteliali che mostravano una maggiore adesività dopo irradiazione portato ai inesconclusione capace che questo effetto non è dovuta a mutazione genetica di un particolare gene come la percentuale di cellule che erano adesivo erano notevolmente sopra (oltre 1.000 volte di più) quella che ci si aspetterebbe da mutazione casuale di un gene da X-radiazione a tale dose . Il fattore che consente una buona riproducibilità dei risultati è il regime di lavaggio. Poiché la procedura di lavaggio prevede l&#39;immersione del vetrino di vetro nel tampone di lavaggio seguito da tamponando su un tessuto, la variabilità nella turbolenza tampone che deriva inevitabilmente dal vecchio metodo di pipettamento del tampone di lavaggio in un pozzo è evitata. Infatti è stato l&#39;osservazione di una eccessiva variabilità tra le repliche ottenuti con il metodo di pipettaggio che ci costretto ad ideare un procedimento di lavaggio che ha rimosso l&#39;elemento di variabilità della fase di lavaggio. Certo, i limiti di questo saggio si trovano nella necessità di effettuare conteggio manuale dei grappoli monociti, che fanno not permettono di essere adattato per analisi ad alta produttività. In secondo luogo, la decisione su quanti monociti costituiscono un cluster deve essere determinato semi-arbitrariamente e il livello può essere troppo elevata e provocare l&#39;esclusione di alcuni cluster veri. La mancanza di forza di taglio in questo metodo può anche essere visto come una limitazione in esperimenti in cui grossolanamente maggiore adesività delle cellule endoteliali è indotta (ad esempio, + TNFa). In altre situazioni, tuttavia, la mancanza di forza di taglio è un vantaggio in quanto permette di rilevare meno esagerato aumento della adesività. Modesto aumento dei monociti adesività può essere particolarmente importante e rilevante. In vivo, monociti non sarebbero (in un tipico tempo sperimentale) può aspettare per fissare in gran numero alle cellule endoteliali con modesto aumento della adesività, in gran parte dovuto al taglio forza. Nel tempo, tuttavia, alcuni monociti probabilmente sarebbe, e questo è più probabile per rappresentare l&#39;ambiente di infiammazione cronica. Come tale,l&#39;assenza di forza di taglio può essere un vantaggio in quanto offre l&#39;opportunità per i piccoli aumenti di adesività delle cellule endoteliali per essere rivelato in tempi sperimentali, che sono in genere di breve e forse troppo fugace per consentire modesto aumento della adesività da osservare sotto sforzo di taglio. La possibilità di sottoporre le cellule dopo questo saggio ad altre analisi come senescenza dosaggio e immunofluorescenza aumenta l&#39;utilità di questo metodo in quanto consente l&#39;associazione di adesività di specifiche cellule endoteliali a particolari proteine ​​cellulari o stati cellulari come dimostrato sopra, una caratteristica che non è disponibile con i saggi di adesione più anziani. Questo metodo è stato utilizzato con celle coronariche umane immortalizzate est2 endoteliali e risultati simili sono stati ottenuti anche con cellule primarie umane endoteliali coronariche 10, dimostrando che non è specifico per un solo particolare linea cellulare. Inoltre, il rumoreption di questo metodo di saggiare adesività delle cellule endoteliali non preclude sottoporre le stesse cellule per saggio di adesione standard che misura la fluorescenza di immunociti etichettati. Insieme, questo rapporto dimostra che questo metodo è versatile, inclusiva e fornisce molte più informazioni di quanto il test di adesione standard.

Infiltrazione di cellule immunitarie quali monociti attraverso lo strato di cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni è un passo importante nel processo di infiammazione 1. In questo modo il homing delle cellule immunitarie (immunociti) a un sito di lesione. In altri casi e luoghi come l&#39;arteria coronarica e carotidea, infiltrazione di monociti attraverso lo strato endoteliale può portare alla residenza indesiderabile lungo termine di queste cellule nella parete dell&#39;arteria, potrebbe condurre alla formazione di placche 2. In tutti i casi di immunocyte infiltrazione, la prima fase prevede l&#39;attivazione delle cellule endoteliali in una regione localizzata del vaso sanguigno. Le cellule endoteliali sono attivati ​​da citochine pro-infiammatorie come TNF-α e IL-6 per aumentare l&#39;espressione di proteine ​​di superficie cellulare come VCAM, ICAM ed E-selectina che facilitano il reclutamento e il fissaggio dei immunociti sulla superficie delle cellule endoteliali 3- 6. 7. Le limitazioni di questo metodo in termini di precisione condotto all&#39;uso di linfociti radio-marcato o monociti, seguita dalla quantificazione del materiale radioattivo corrispondente al linfociti o monociti adesione 4. Questo metodo è stato poi sostituito con un metodo basato sulla fluorescenza, per cui immunociti di interesse sono state marcate con fluorescenza colorante e sottoposti alla stessa procedura come sopra, con la differenza che invece di fluorescenza della radioattività viene misurata 8. Attualmente questo metodo è emerso come il più conveniente ed è venduta in kit da diversi fornitori commerciali. Mentre questo test può misurare i livelli relativi di adesività tra controlli e campioni sperimentali, non rivela se un cambiamento della fluorescenza è causa di un cambiamento uniforme adesività sull&#39;intera epopolazione cellulare ndothelial o se la modifica è dovuta a una differenza di adesività di un sub-popolazione di cellule. E &#39;evidente, inoltre, che il rigore di lavaggio esercita un profondo effetto sul risultato, e, soprattutto, l&#39;uniformità di risciacquo monociti non legate tra diverse monostrati di cellule endoteliali inciderà notevolmente sulla vicinanza dei risultati di repliche e la riproducibilità dei risultati tra i campioni . Più di recente, diversi sistemi che pompano monociti in media attraverso un monostrato di cellule endoteliali sono stati usati per affrontare questo problema 9. Inoltre, questi sistemi di flusso anche ricapitolano l&#39;effetto della forza di taglio sulle cellule endoteliali. Mentre i vantaggi di tali sistemi sono chiare e molto attraente, è anche importante rendersi conto che mentre adesività cellule endoteliali può essere notevolmente aumentata, come nel caso in infiammazione acuta, da fattori come TNFa, alcuni altri attivatori, come le radiazioni ionizzanti 10 suscitare cambia tcappello non sono prontamente rilevate in tempi sperimentali in vitro da questi sistemi molto rigorosi. Mentre tali modifiche minime di adesività delle cellule endoteliali sono facilmente perso o revocati in vitro, non è necessariamente benigna in vivo, in cui tali piccoli cambiamenti in un tempo di vita, che è caratteristico di infiammazione cronica, possono esercitare risultati molto significativi. Quindi un metodo robusto, ma sensibile e specifico per rilevare e misurare è necessaria l&#39;adesività delle cellule endoteliali. Qui riportiamo un metodo per misurare l&#39;adesività delle cellule endoteliali direttamente. Questo metodo non si basa sulla misura della fluorescenza come indicatore indiretto di surrogata adesività cellule endoteliali. Esso rivela se i cambiamenti in adesività sono dovuti al cambiamento uniforme in tutte le cellule o confinato in una sotto-popolazione. Inoltre, esso permette co-colorazione di cellule endoteliali con marcatori come senescenza associata beta-galattosidasi, vitalità cellulare marker, Calcien AM e anticorpi contro superficie delle cellule e proteine ​​intracellulari, permettendo l&#39;associazione di singole cellule endoteliali adesivi per certi stati cellulari o espressione di proteine ​​specifiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Uno dei processi cardinali di infiammazione è l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie dal lume del vaso sanguigno al tessuto circostante. Questo si verifica quando le cellule endoteliali, che rivestono i vasi sanguigni, diventano adesivo circolanti cellule immunitarie come monociti. In vitro degli questo adesività è finora fatto quantificando il numero totale di monociti che aderiscono ad uno strato endoteliale sia come conteggio diretto o attraverso la misura indiretta della fluorescenza di monociti aderenti. Mentre tali misurazioni indicano l&#39;adesività media della popolazione di cellule endoteliali, sono confusi da una serie di fattori, come il numero di cellule, e non rivelano la proporzione di cellule endoteliali che sono effettivamente adesivo. Qui si descrive e dimostrare un metodo che consente l&#39;enumerazione delle cellule adesive all&#39;interno di una popolazione testata di monostrato endoteliale. Le cellule endoteliali sono coltivate su vetrini e seguendo desideratotrattamento sono sfidati con monociti (che può essere fluorescente). Dopo l&#39;incubazione, una procedura di risciacquo, che coinvolge vari cicli di immersione e scarico, le cellule vengono fissate. Cellule endoteliali adesivi, che sono circondate da monociti sono facilmente identificabili e enumerati, dando un indice di adesione che rivela la percentuale effettiva di cellule endoteliali all&#39;interno della popolazione che sono adesivi.

Questo metodo permette la rilevazione di singole cellule endoteliali adesive all&#39;interno di una popolazione. Per esempio, mentre un monostrato di cellule endoteliali non-irradiati mantenuto alcuni sporadici HL-60 monociti seguenti incubazione e lavaggio, monostrato endoteliale a 7 giorni dopo la 10Gy irradiazione prima dell&#39;incubazione con monociti sono stati legati da monociti a grappoli intorno cellule endoteliali singole ( Figura 1). Anche se questo fenomeno è facilmente osservabile al microscopio a contrasto di fase, microscopia a fluorescenza rivela un&#39;immagine ancora più nitida dei cluster monociti. Dopo aver eseguito il test aderenza descritto, è possibile procedere alla colorazione delle cellule per membrana citoplasmatica o nucleare (Figura 2) proteine ​​utilizzando anticorpi appropriati con metodi immunofluorescenza standard. Inoltre, saggio basato enzimi come senescenza associata beta-galattosidasi (Figura 3) può anche essere performed. Poiché ogni cluster monociti corrisponde ad una cellula endoteliale individuale, enumerazione dei clusters rivelerà il numero effettivo di cellule endoteliali adesive all&#39;interno del monostrato (figura 4), ​​e quindi la percentuale di cellule endoteliali adesive all&#39;interno della popolazione (Tabella 1, Figura 6) . Questo è l&#39;unico metodo per data che consente tale quantificazione di adesività delle cellule endoteliali. È interessante notare che le cellule endoteliali utilizzate negli esperimenti qui sono il contatto inibito e non aumentano di numero dopo il raggiungimento di confluenza. Questo elimina la complessità potenziali causati da un aumento del numero di cellule endoteliali a successivi momenti. Se lo si desidera, monociti collegati a monostrati endoteliali da poter essere rimosse dalla soluzione di tripsina-EDTA 0,2% 0,5% (invece di fissazione in 3.9) e loro fluorescenza misurati usando un lettore di piastre, come accade nei metodi contemporanee (Figura 5). </p&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figura 1. Adesione dei monociti in monostrato di cellule endoteliali. In cellule endoteliali non-irradiati, monociti aderito come le singole cellule in maniera sporadica e casuale (pannelli di sinistra) e in cluster su singole cellule endoteliali dei 7 giorni dopo la 10 Gy irradiati monostrato (pannelli di destra). Pannelli inferiori sono immagini di fluorescenza dei pannelli superiori, a conferma che i piccoli e luminosi celle sferiche visibili sotto contrasto di fase sono infatti monociti che sono stati pre-etichettati con Cell-Tracker Verde. Alcuni dei cluster monociti sono indicati con frecce bianche. Le immagini sono state scattate con un obiettivo 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figura 2. La colorazione di cellule endoteliali per il dosaggio delle proteine ​​post-adesione. Dopo aver eseguito il test aderenza descritto, le cellule sui vetrini sono stati sottoposti a immunofluorescenza per la rilevazione di (A) proteina di membrana (CD44), b) proteina citoplasmatica (tubulina) oppure c) proteina nucleare (γ-H2AX). Pannelli di sinistra (A) e (B) (visto con obiettivo 20X) mostrano monociti pre-etichettati con Cell Tracker verde e l&#39;immagine simile ai pannelli di destra rivelano CD44 e microtubuli (rosso) e nuclei DAPI-macchiati (blu). Frecce bianche in (C) punto irradiati nuclei delle cellule endoteliali che sono state colorate con anticorpi contro γ-H2AX. Nuclei monociti, che si sono macchiati di un brillante blu da DAPI sono facilmente distinguibili dai nuclei di forma ovale delle cellule endoteliali. Le immagini sono state scattate con obiettivo 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figura 3. senescenza-associata beta-galattosidasi colorazione di cellule endoteliali. Dopo saggi di adesione, le cellule su vetrini sono stati sottoposti a colorazione per senescenza-associata beta-galattosidasi che provoca lisosomi di cellule senescenti al blu, come è evidente in cellule endoteliali che viene selettivamente vincolato da numerosi monociti, che sono facilmente identificabili causa delle loro piccole dimensioni e la forma sferica. Immagine visto attraverso obiettivo 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. enumerazione dei cluster monociti sulle cellule endoteliali individuali. Dopo saggi di adesione, le immagini delle cellule sono stati presi da diverse posizioni e cluster monociti identificati e cerchiata (in verde). Un cluster è stata definita come un agglomerato di 10 o più monociti su una cellula endoteliale. Il numero di cluster di monociti e il numero di 12 giorni cellule endoteliali post-irradiati (tratteggiata in rosso) nell&#39;immagine sono stati contati e la percentuale di cellule endoteliali aderenti calcolati come indicato nella tabella 1. Immagine presa attraverso obiettivo 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figura 5. Quantificazione della fluorescenza monociti aderenti. Dopo Adhe<html> test sione, celle su vetrini sono stati trypsinised e la fluorescenza dei monociti pre-etichettato con CellTracker Verde è stata misurata, utilizzando un lettore di piastre in fluorescenza, come un indicatore indiretto l&#39;adesività del monostrato endoteliale. I risultati di tali misurazioni a giorni stabiliti post-irradiazione sono state ottenute e, intrecciata sul grafico di cui sopra. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentazione dei punteggi del test di adesione Tabella 1. adesivi cellule endoteliali in cinque luoghi diversi su tre vetrini di vetro sono stati segnati come descritto nella figura 4 e risultati tabulati sopra dimostrando che 12 giorni dopo 10 Gy di irradiazione, dall&#39;8 al 10 per cento del combustibile irraggiato cellule endoteliali divennero adesivo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Percentuale di adesivo cellule endoteliali </td></tr><tr><td></td><td> Disco 1 </td><td> Disco 2 </td><td> Disco 3 </td></tr><tr><td> Campo 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Campo 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Campo 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Campo 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Campo 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Media </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Adesione punteggi del test. Cellule endoteliali adesivi in cinque luoghi diversi su tre vetrini di vetro sono stati segnati come descritto in FIGURA 4 ed i risultati riportati in tabella dimostrano che 12 giorni dopo 10 Gy, da 8 a 10 per cento di cellule endoteliali irradiati divenne adesivo.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Views.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...