The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

Nota: utilizzare schede di monitorare tutte le fasi del protocollo; schede esempio dati sono riportati nel materiale supplementare Tabelle S2-S4. 1. Curva Preparazione standard <ol><li> Preparare uno stock di lavoro del reagente curva standard (ad esempio, Armored RNA EPA-1615) diluendo dalla concentrazione fornita dal produttore ad una concentrazione di 2,5 x 10 8 particelle / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) utilizzando TSM tampone III. Dividere il brodo di lavoro in 250 aliquote microlitri utilizzando provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C. NOTA: vedere supplementare protocollo materiali Passo S1 per le istruzioni sulle preparare scorte di lavoro dei virus e plasmidi per l&#39;uso come reagenti curva standard alternativi. </li><li> Scongelare una o più delle stock aliquote di lavoro. Preparare cinque diluizioni seriali di 10 volte utilizzando provette da 1,5 ml microcentrifuga, dando concentrazioni di 2,5 x 10 7, 2,5 x 10 6, 2.5 x10 5, 2,5 x 10 4, e 2,5 x 10 3 GC / ml. <ol><li> Preparare la prima diluizione con l&#39;aggiunta di 25 ml di / ml di brodo di lavoro 2,5 x 10 8 GC a 225 ml di buffer di TSM III. Mescolare per 5-15 secondi utilizzando un vortex. </li><li> Preparare la diluizione successiva con l&#39;aggiunta di 25 ml di diluizione preparata al punto 1.2.1 a 225 ml di buffer di TSM III. Mescolare di nuovo e continuare un processo simile per preparare i prossimi tre diluizioni 10-fold. </li></ol></li><li> Estrarre l&#39;RNA dallo stock di lavoro curva standard e cinque diluizioni immediatamente utilizzando la procedura nella sezione 3. </li></ol> 2. Concentrazione Terziario <ol><li> Preparare un concentratore centrifugo (30.000 molecolare cutoff peso) per ciascun campione raccolto aggiungendo almeno 10 ml di PBS 1x, 0,2% di albumina di siero bovino (BSA) per camera campione superiore. Assicurarsi che la soluzione ha riempito la sottile camera di concentrazione di canali, e quindi tenere O / N a 4 ° C. <ol><li&gt; Eliminare il fluido. Risciacquare il concentratore una volta con almeno 10 ml di acqua per reagenti sterile per rimuovere l&#39;eccesso di BSA e quindi eliminare l&#39;acqua. </li></ol></li><li> Aggiungere una quantità di concentrato acqua secondari di ogni campione di prova pari a S, il saggio Volume campione in concentratori centrifughi separati. <ol><li> Calcola S con l&#39;equazione 1, <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Dove D è il volume di Campione d&#39;acqua originale dosati, TSV è il volume del campione totale e FCSV è la Finale concentrato volume del campione. Vedere materiali supplementari S2 per un esempio di calcolo del S. </li></ol></li><li> Centrifugare ogni campione sottoposto ad 3,000-6,000 xga 4 ° C in un rotore bucket oscillante per 20 - 30 min. Controllare il volume nel sottile camera di concentrazione di canali. <ol><li> Se il volume è superiore a 400 ml, centrifugare nuovamente per 20 minuti o più. Continuare centrifugazione fino a quando il campione in the camera di concentrazione canale sottile è stato ridotto a meno di 400 ml. Non rimuovere il surnatante. </li></ol></li><li> Lavare lati del concentratore centrifugo con 1 ml di soluzione sterile di fosfato di sodio 0,15 M, pH 7-7,5 per aumentare il recupero virus. Centrifugare nuovamente a 3,000-6,000 xg e 4 ° C fino a quando il campione è stato ridotto a meno di 400 microlitri. Ripetere questa fase di lavaggio una volta in più. </li><li> Usando una micropipetta 100-200 microlitri, misurare accuratamente e trasferire ciascun campione concentrato in una provetta da 1,5 ml (cioè, trasferire 200 ul alla provetta e quindi misurare il concentrato rimanente regolando la micropipetta finché il liquido rimanente può essere completamente elaborata nella punta pipetta). Aggiungere 0,15 M di fosfato di sodio, pH 7-7,5, per regolare il volume finale a 400 ± 2 microlitri. </li><li> Estrarre acido nucleico immediatamente procedendo al punto 3. Tenere i campioni concentrati che non possono essere Processid immediatamente a 4 ° C per non più di 24 ore. </li></ol> Isolamento 3. acidi nucleici <ol><li> Aggiungere 200 ml di tampone di estrazione preparato come descritto al punto 3.3 e 200 ml di concentrato terziaria da ogni campione di prova dal punto 2.5 o diluizione curva standard dal punto 1.3 per isolare etichettato 1,5 ml microprovette. Congelare rimanendo concentrati terziarie pari o inferiore a -70 ° C. Estrarre i acidi nucleici da ciascun campione secondo le istruzioni del kit del produttore estrazione degli acidi nucleici per il protocollo di rotazione per i campioni di sangue con le seguenti eccezioni. </li><li> Non aggiungere proteasi ai campioni di acqua o utilizzare il tampone di estrazione fornita con il kit estrazione degli acidi nucleici. </li><li> Preparare tampone di estrazione con carrier RNA <ol><li> Aggiungere 310 pl di tampone di diluizione carrier RNA ad una fiala contenente 310 mg di carrier RNA. Mescolare per sciogliere e poi dividere in 6 aliquote contenenti circa 50 ml. Conservare a -20° C. </li><li> Aggiungere 28 ml di scongelati carrier RNA per ml di tampone di estrazione per ottenere una concentrazione carrier RNA di 0,027 mg / mL. Utilizzare il tampone di estrazione RNA modificato vettore al posto di quella fornita con il kit di estrazione. </li></ol></li><li> Preparare una soluzione maestro di tampone di eluizione aggiungendo ribonucleasi (RNasi) Inhibitor ad una concentrazione finale di 400 unità / ml per il tampone di eluizione fornito con il kit di estrazione. <ol><li> Eluire RNA dall&#39;acido nucleico vincolante Spin Column ponendo 50 ml di tampone di eluizione con RNasi inibitore nella colonna. Attendere per 1 min, e quindi si centrifuga a 6000 xg per 1 min a RT. </li><li> Ripetere il passaggio 3.4.1 e poi rimuovere ed eliminare la colonna. </li></ol></li><li> Preparare aliquote degli estratti di RNA dal punto 3.4.2. Preparare 6 aliquote dello stock di lavoro curva standard e ogni diluizione curva standard contenente almeno 15 ml ciascuno. Preparare 4 aliquote di tutti gli altri campioni di RNA contenenti almeno22 ml ciascuno. Conservare un&#39;aliquota di ciascun campione e curva standard di controlli a 4 ° C, se possono essere elaborati mediante trascrizione inversa entro 4 ore; altrimenti, memorizzare tutti aliquote pari o inferiore a -70 ° C. </li></ol> 4. trascrizione inversa (RT) <ol><li> Preparare 100 mM soluzioni madre di ciascun primer oligonucleotide e sonda elencati nella Tabella 1 aggiungendo un volume di acqua PCR-grade ad ogni flacone utilizzando una quantità (in microlitri) pari a dieci volte il numero di nanomoli (nmol) di oligonucleotide presenti nel fiala (come indicato sull&#39;etichetta del flacone o nella scheda tecnica del produttore (ad esempio, risospendere un primer contenente 36,3 nmol in 363 ml). Mescolare per sciogliere. <ol><li> Diluire 100 micron soluzioni 1:10 con acqua PCR-grade per preparare 10 micron soluzioni di lavoro. </li></ol></li><li> Preparare RT Master Mix 1 e 2 in una camera pulita utilizzando la guida nella tabella 2. Dispensare 16,5 ml di RT MasteR Mix 1 per ogni piastra PCR bene con una pipetta multicanale. </li><li> Thaw, se bloccato, gli estratti acidi nucleici da ciascun campione di campo e di laboratorio fortificata matrice del campione (LFSM, cioè, campione di matrice acqua testa di serie). <ol><li> Diluire ciascun campo e LFSM campione 1: 5 e 1:25 in tampone di eluizione contenente 400 unità / ml di inibitore RNasi. </li><li> Thaw, se congelato, ma non diluire Lab fortificato Blank (LFB, cioè un controllo di qualità positivo con acqua distillata teste di serie), Lab reagente Bianco (LRB, cioè, un controllo negativo di qualità con acqua distillata), Performance Evaluation (PE , cioè campioni di acqua distillata seminato utilizzati per valutare le prestazioni di laboratorio prima dell&#39;inizio di uno studio), Performance Test (PT, cioè campioni di acqua di grado reagente seminato con titoli sconosciuti a un analista che vengono utilizzati per valutare le prestazioni di laboratorio durante uno studio ), NA batch di controllo di estrazione negativo, o RNA estratto dal set curva standard. </li></ol&gt; </li><li> Mettere 6.7 ml di RNA da ogni campione di prova, controllo e curva standard in pozzetti separati piastra PCR, utilizzando pozzi triplicato per i campioni di test e controlli e pozzetti duplicati per le curve standard (vedi Figura S1 per un esempio piatto RT). <ol><li> Mettere 6.7 ml di tampone di eluizione in diversi pozzetti della piastra PCR per controlli NTC (NTC). Includere 2-8 NTC per piastra RT, utilizzando due per il primo campione e quindi più di due per ogni quarto campione aggiuntivo. </li><li> Distribuire l&#39;estrazione controlli negativi e NTC tutta la piastra. </li></ol></li><li> Sigillare la piastra PCR con un piatto resistente al sigillante di calore. Mescolare i campioni per 5-10 secondi e poi centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Incubare la piastra per 4 min a 99 ° C e poi raffreddare rapidamente a 4 ° C in un termociclatore. Centrifugare di nuovo a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Rimuovere con cautela la guarnizione della piastra e poi aggiungere 16,8 ml di RT Master Mix 2 di ogni bene. Seal piatto di nuovo con un foglio sigillante resistente al calore, seguita da miscelazione e una breve centrifugazione a ≥ 500 x g. </li><li> Porre la piastra in un termociclatore ed eseguire per 15 min a 25 ° C, seguita da 60 minuti a 42 ° C, 5 min a 99 ° C, e poi da un 4 ° ciclo C attesa. </li><li> Processo immediatamente o entro 8 ore dalla qPCR (punto 5), o conservare i campioni pari o inferiore a -70 ° C fino a che non può essere elaborato. Conservare i campioni che possono essere elaborati entro 8 ore a 4 ° C. </li></ol> 5. Real-time PCR quantitativa (qPCR) <ol><li> Determinare la media epatite valore di G Cq per ogni lotto di epatite G reagente prima di eseguire eventuali campioni di prova. <ol><li> Eseguire un test RT utilizzando 10 replicati preparato come descritto per i controlli NTC (Fase 4.1.1). Eseguire l&#39;epatite G qPCR saggio come descritto di seguito (i passaggi da 5.2 a 5.5.3). Calcolare il valore medio Cq delle 10 repliche. </li><li> Regolare l&#39;epatite G quantità di reagente in RT Master Mix 1 (tabella 2), Se necessario, per ottenere un valore medio Cq tra 25 e 32 unità. Compensare l&#39;importo sollevato o abbassato modificando il volume di acqua aggiunta per mantenere il RT Master Mix 1 volume finale di 16,5 ml per saggio. </li><li> Confermare le regolazioni ripetendo i punti da 5.1.1 a 5.1.2 e al cambiamento tabella 2 in modo da riflettere i quantitativi corretti. </li></ol></li><li> Preparare qPCR Master Mix in una stanza pulita utilizzando le guide nella Tabella 3 per enterovirus, Tabella 4 e Tabella 5 per norovirus genogruppo I, tabella 6 per norovirus genogruppo II, Tabella 7 per norovirus murino (norovirus genogruppo V), e la Tabella 8 per l&#39;epatite G. Mix ogni master mix e poi centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Aggiungere i Master Mix PCR nei rispettivi pozzetti di una piastra di reazione ottica etichetta, utilizzando 14 microlitri per bene e piatti separati per ciascun saggio qPCR (si veda la Figura S2 </strong&gt; per un possibile layout per un saggio qPCR base alla disposizione RT in Figura S1). </li><li> Scongelare la piastra RT dal punto 4.8 a temperatura ambiente, se congelato. Mescolare con un mixer piatto e poi centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Dispensare 6 ml di cDNA adeguato alle pozzetti, all&#39;interno della piastra di reazione ottica. Mescolare i campioni nella piastra di reazione ottica e centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. <ol><li> Eseguire l&#39;epatite G qPCR test sul campo non diluito e diluito e campioni LFSM prima di eseguire tutti gli altri saggi qPCR. Utilizzare la diluizione più basso di campo o campione LFSM che è &lt;1 valore Cq maggiore del valore medio epatite G Cq per gli enterovirus e norovirus saggi qPCR. </li><li> Impostare il software termociclatore PCR quantitativa in base alle istruzioni del produttore. Identificare i campioni della curva standard come standard e per ogni diluizione curva standard, inserire i valori di copia genomici indicati nella tabella 9. </li><li&gt; eseguire il piatto nel termociclatore PCR quantitativa per 10 min a 95 ° C, seguita da 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. </li></ol></li><li> Determinare se ogni curva standard soddisfa i valori accettabili indicati nella tabella 10. Vedere la sezione materiali supplementari S3 per gli esempi. <ol><li> Calcolare la deviazione standard globale (StdDev) per la curva standard utilizzando Equazione 2, <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> dove Cq è il valore riportato per ciascun replicato curva standard, Cq è il valore medio per ogni serie di repliche, #Cq è il numero totale di valori Cq per tutte le repliche di controllo standard che hanno valori positivi (cioè non indeterminato), e # Stds è il numero di controlli standard che hanno valori positivi. </li><li> Se il software termociclatore PCR quantitativa non calcola la pendenza per ogni curva standard, calcolare la pendenza utilizzando equazione 3,60; <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> dove Cq è il valore medio delle diluizioni alti e più bassi utilizzati e log GC è il registro del valore di copia genomica per le diluizioni alti e più bassi utilizzati dalla tabella 9. </li><li> Calcolare il valore di R 2 usando l&#39;equazione 4. <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> dove Cq è la media di tutti i valori Cq e Log GC è il valore medio registro GC per ogni replica. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza% utilizzando Equazione 5: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Registrare i valori GC calcolati dal software termociclatore per tutti i campioni di prova basati su curve standard che soddisfano i criteri specificati nella Tabella 10 ei valori GC medi per ogni campione. Eseguire nuovamente tutti i campioni con le curve standard che non soddisfano i criteri di cui <strong&gt; Tabella 10 o dove vi siano controlli negativi (LRB, NA batch di controllo di estrazione negativo, o NTC) sono positivi. Rielaborare i campioni che non soddisfano i criteri o sono controlli falsi positivi durante la ripetizione. </li><li> Determinare il GC per litro (GC L) per ciascun campione usando Equazione 6: <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> dove GC è la media del numero di copie genomico dal punto 5.7, il fattore &#39;199&#39; è il fattore di diluizione totale delle riduzioni di volume che si verificano durante la concentrazione terziaria, estrazione di RNA e gradini RT-qPCR, DF è il fattore di diluizione che compensa l&#39;inibizione , e D è il volume di campione originale dosati in litri. Vedere materiali supplementari sezione S4 per un esempio di calcolo del GC L. </li><li> Calcolare il GC totale di LFB e LRB campioni moltiplicando il valore GC media dal punto 5.5 da 199 e dividendo per 0,3. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment,+using+real-time+reverse+transcription-PCR:+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II.">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li><li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus.">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li><li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish.">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li><li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure.">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li><li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay,+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR.">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li><li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples.">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. 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Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li><li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters.">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li><li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples.">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li><li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water,+using+Salmonella+as+a+model+organism.">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li><li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt,+humic+acid,+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters.">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Larga scala studi nazionali di contaminazione virale di acque di fonte e bere richiedono l&#39;utilizzo di più laboratori di analisi. In queste condizioni è necessario un metodo standard per garantire che i dati generati dai diversi laboratori è paragonabile. Ci sono molti metodi molecolari pubblicati di individuazione del virus, ma molto pochi metodi molecolari standardizzati. Metodo EPA 1615 è un metodo standardizzato specificamente progettato per il rilevamento di enterovirus e norovirus in matrici di acqua mediante RT-qPCR. Metodi molecolari standardizzati sono disponibili per il rilevamento di virus negli alimenti (CEN / TS 15216-1 e ISO CEN / TS 15216-2 ISO, 7 Aprile 2013) 16,17 e sono state applicate al rilevamento di virus dell&#39;epatite A e norovirus in primavera acqua 16. Tutti i metodi standard devono comprendere controlli delle prestazioni di qualità e criteri per ridurre al minimo inter- e variazione intra-laboratorio e dati falsi positivi dovuti a contaminazione da laboratorio. Per ridurre ulteriormente i dati falsi, EMetodo PA 1615 segue la guida di EPA sui metodi molecolari, 18, ​​che prevede la separazione del lavoro durante la lavorazione e un modo flusso di lavoro. Esso comprende una epatite G 1,19 procedure di controllo e di ridurre al minimo risultati falsi negativi a causa di inibitori della RT-qPCR 15 interno. Esso utilizza analisi quantitative con volumi standardizzati sia di acqua campionata e acqua analizzata in modo che tutti i dati di campo è espressa in copie genomiche per litro del campo o di bere acqua campionata. Sebbene efficiente tubo singolo (one-step) saggi di RT-PCR sono disponibili in commercio, il metodo utilizza intenzionalmente test separati. Questo ha lo svantaggio di minimizzare la quantità di campione che può essere analizzato in ciascuna reazione, ma offre una maggiore flessibilità di impiego di più set di primer. Saggi di RT-qPCR sono limitati da e solo buono come primer e le sonde utilizzati e probabilmente senza primer rileveranno tutte le varianti del virus all&#39;interno di un gruppo. Il set di primer enterovirus è stato scelto perchéesso si rivolge la regione codificante 5&#39;-non conservati, 20,21 rileva una vasta gamma di sierotipi enterovirus e virus rilevati da esso sono associate con effetti sulla salute dal consumo di acque sotterranee non trattate 1. Due set di primer sono utilizzati per il rilevamento di genogruppo I norovirus 22,23. Il primo è stato scelto a causa della forte correlazione tra gli effetti sulla salute nei bambini e rilevato il virus 1. Il secondo genogruppo I set di primer e il set di primer utilizzato per genogruppo II norovirus sono stati scelti perché rilevano la più ampia varietà di ceppi 24,25. Nonostante i principali vantaggi di procedure qPCR e RT-qPCR per la rilevazione di RNA virale in acqua, ci sono diverse limitazioni. In primo luogo, entrambe le particelle virali infettive e non infettive, comprese quelle inattivato da disinfettanti, possono essere amplificati da tali regimi. I risultati di Borchardt suggeriscono che si tratta di meno di un problema per le acque sotterranee non trattate facquiferi rom simili a quelli nelle comunità studiate che per le acque superficiali disinfettati 1. Per i virus coltivabili questo problema può essere superato utilizzando PCR in combinazione con la cultura 26,27. Il problema è stato affrontato anche per alcuni virus attraverso l&#39;uso di acido nucleico reticolanti agenti 28-30. Quest&#39;ultimo approccio è più efficace per i virus inattivati ​​ipoclorito e non efficaci per coloro inattivato da UV. Una seconda limitazione di queste procedure molecolari è che il volume di campione concentrato che possono essere analizzati in genere è molto più piccolo di quello utilizzato per le procedure di coltura 6,31. Questo problema è spesso effettuata o sostituendo una procedura basata glicole-polietilene per la concentrazione secondaria standard con flocculazione organica, che permette al campione da risospeso in un volume più piccolo, o con l&#39;aggiunta di una concentrazione del campione terziaria passo 6,32,33 . Metodo 1615 utilizza centrifultrafiltrazione ugal per fornire la concentrazione terziaria. Ultrafiltrazione centrifuga rimuove l&#39;acqua e componenti meno di 30.000 Daltons conseguente sia la concentrazione di qualsiasi virus in campioni di prova e una riduzione in piccoli inibitori peso molecolare di saggi molecolari. Questo terziarie risultati fase di concentrazione in un fattore di concentrazione&gt; 10 5 per qualsiasi virus che era presente nell&#39;acqua in fase di test. Una terza limitazione è la presenza di inibitori di procedure molecolari in campioni ambientali. Sebbene siano stati sviluppati numerosi approcci per rimuovere inibitori, nessun metodo è efficace per tutte le matrici acqua e virus tipi 6,34,35, rendendo l&#39;uso di controlli interni volti a stimare il livello di inibizione essenziale. Il reagente epatite G utilizzata in questo metodo soddisfa questa esigenza fornendo un livello costante di RNA virale in tutte le reazioni e un saggio RT-qPCR per stimare inibizione. Quando il meglio di tegli inibitore approcci rimozione non riescono a rimuovere l&#39;inibizione, concentrati campione possono essere diluiti fino a quando le concentrazioni di virus sono più alti di inibitori concentrazioni 14,15. La procedura curva standard qui descritta presenta vantaggi e una limitazione importante. Un vantaggio è che il reagente utilizzato fornisce tutti i componenti necessari in un unico reattivo, consentendo un unico comando da utilizzare per tutti i saggi. Questo reagente è particolarmente un vantaggio per le analisi norovirus. Norovirus particelle possono essere ottenuti solo da individui infetti che rende molto difficile ottenere particelle virali per l&#39;uso come standard. Un altro importante vantaggio è che fornisce uno standard per tutti i virus RNA RNA target in un reagente, come avente un livello di RNA è essenziale per la quantificazione accurata di RNA 36. Tuttavia, la sua capacità di quantificare virus precisione è limitata dal fatto che gli effetti di matrice non vengono presi in considerazione. Ciò significa che la copia genomicaI valori numerici non possono essere considerati assoluta e devono essere considerati solo in termini relativi. Si raccomanda che un numero sufficiente di curva standard di Stock Working aliquote (punto 1.2) essere pronta a coprire studi completi. Per esempio, ogni 250 microlitri aliquota fornisce reagente sufficiente per 6 piastre RT. Se è noto che uno studio richiederà analisi di 500 campioni, sarebbe necessario un minimo di 12 aliquote (500 campioni / 7 campioni per piastra RT / 6 piatti RT per aliquota). Metodo EPA 1615 è un metodo basato sulle prestazioni. Molti produttori fanno reagenti equivalenti a quelle specificate e questi reagenti possono essere sostituiti a condizione che siano rispettati i criteri di performance. La curva standard, che serve anche come controllo positivo RT-qPCR, è di valore in problemi di prestazioni di risoluzione dei problemi. Le prestazioni possono diminuire a causa di degradazione dell&#39;RNA, shelf life del reagente, il fallimento di congelatori, calibrazione dello strumento, e errore tecnico. Problemi di prestazioni devono essere sospettied se curve standard differisce da quella illustrata nella figura 4 o se non sono conformi alle specifiche prestazioni per curve standard. Il test RT-qPCR è abbastanza robusto; completo fallimento è probabilmente dovuto a un uso improprio di RNA o errore tecnico (ad esempio, un reagente mancante). Grande cura dovrebbe essere presa in gestione di campioni di RNA tra l&#39;estrazione e il passo RT per ridurre la degradazione dell&#39;RNA da ribonucleasi. Recuperi poliovirus di acque sotterranee e di grado reagente e recuperi norovirus murini dalla falda incontrato il metodo EPA 1615 criteri di accettazione delle prestazioni (Tabella 11), e sono simili a quelli riportati da altri 33,37,38. Recuperi norovirus murini da campioni LFB erano molto inferiori a quelli dei poliovirus e non avrebbero soddisfatto i criteri di accettazione specifici poliovirus. Le ragioni di basso recupero norovirus murino di acqua distillata sono sconosciuti. Simili ai risultati nel presente documento, Karim e Colleagues segnalato un recupero per norovirus GI.1 del 4% da acqua di rubinetto 39. Lee et al. 37 riportato recuperi medi di norovirus murino e GII.4 norovirus umana del 18% e il 26% da acqua distillata con filtri a disco, rispettivamente. Utilizzando condizioni simili a Lee e colleghi, Kim e Ko osservato recuperi del 46% e del 43% per questi virus, rispettivamente, 38. Gibbons et al. 40 ottengono circa 100% di recupero di GII.4 norovirus umana da acqua di mare, ma Kim e Ko 38 hanno trovato che l&#39;aggiunta di sale e l&#39;acqua distillata a concentrazioni simili o superiori di mare significativamente ridotta recuperi del virus murino e portato in una riduzione di due volte nel recupero GII.4.

PCR quantitativa (qPCR; vedi materiali supplementari per le definizioni dei termini utilizzati in questo manoscritto) e trascrizione inversa-qPCR (RT-qPCR) sono strumenti preziosi per il rilevamento e la quantificazione dei virus enterici umani in ambientale e acque potabili, e soprattutto per molti virus che fanno Non replicare o replicare male in sistemi di colture cellulari. Entrambi gli strumenti hanno dimostrato che molti tipi di virus sono presenti nelle acque potabili ambientali e in tutto il mondo 1-6. Il loro utilizzo insieme con il sequenziamento dei frammenti genomici amplificati durante indagini sui focolai di malattie ha fornito prove per la trasmissione del virus per via d&#39;acqua, come hanno dimostrato che il virus trovato in acqua potabile è identica a quella capannone dai pazienti scoppio 7-10. Sia qPCR e RT-qPCR sono utili strumenti di sanità pubblica. Ad esempio, i dati provenienti da studi condotti dalla US Environmental Protection Agency (EPA) ha dimostrato una forte relazione siale misure degli indicatori tween di qPCR e gli effetti sulla salute nelle acque ad uso ricreativo. Come risultato, finale 2012 Criteri di Qualità dell&#39;acqua ricreativo dell&#39;EPA include un metodo qPCR per monitorare le spiagge ricreativi 11,12. Borchardt e colleghi hanno anche trovato una forte relazione tra gastroenterite acuta in comunità con le acque sotterranee non trattate e il virus nelle acque sotterranee, come misurato mediante RT-qPCR 1. Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere la componente analisi molecolare del metodo EPA 1615 13,14. Questo test utilizza RT-qPCR per fornire una stima quantitativa di enterovirus e copie genomiche norovirus (GC) per litro in base al volume originale di acqua ambientale o bere passato attraverso un filtro elettropositivo. Una panoramica della procedura molecolare è mostrato in Figura 1 punto. Protocollo 1 particolari le procedure per preparare la curva standard. Questi standard sono preparati da un reagente che contiene un RNUna copia della sequenza target per tutti i set di primer / sonda. Sezione 2 descrive la procedura di concentrazione terziaria. Sezione 3 illustra la procedura per estrarre RNA da campioni di acqua e di controllo concentrati. L&#39;RNA da ogni campione viene inversione trascritto mediante saggi in triplo e primer casuali per innescare la trascrizione (sezione 4). Il cDNA da ogni reazione trascrizione inversa è suddiviso in cinque saggi specifici per il virus separate che vengono analizzati in triplice copia da qPCR (sezione 5; Figura 2). Il test utilizza primer e sonde dalla letteratura scientifica (Tabella 1) che sono progettati per rilevare molti enterovirus e norovirus e un reagente contenente epatite G RNA per identificare i campioni di prova che inibiscono RT-qPCR 15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#176;C cool brick</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BRIK-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N8080130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td>Must be a manual defrost freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70 &#176;C or colder freezer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MBF700LSAO-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA EPA-1615</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Used for quantifying the RT-qPCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA Hepatitis G virus</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>42024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Steris</td>
			<td>Amsco Lab Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>NuAir Laboratory Equipment Supply</td>
			<td>Labgard 437 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10856</td>
			<td>Crystalline grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026956</td>
			<td>Carrier RNA dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19073</td>
			<td>Extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier RNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Use carrier RNA supplied with Buffer AVL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-23 or 05-562-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotors</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339080, 336380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool safe box</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CSF-BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 Probes Master kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>4707494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td>Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcide III</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>99R-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSA5001</td>
			<td>Heat resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;F&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSA1001</td>
			<td>Freezer resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-plate spinner</td>
			<td>Labnet International</td>
			<td>MPS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical reaction plate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR nucleotide mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3315932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>D9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>MicroPlate Genie</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-381-27E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>367501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515 or N2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II or III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18064-022 or 18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-058-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator units</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>VS2022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. part iii. virus detection by rt-qpcr

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

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12.6K Views.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Video: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

A Procedura piccolo volume per concentrazione virale da Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

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Ambiente

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Evento in acqua per la cultura e RT-qPCR. I. Raccolta di campioni di virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di cultura e RT-qPCR. II. Totale coltivabili Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Rimozione di Oligoelementi per Cupric nanoparticelle di ossido di uranio da<em&gt; In Situ</em&gt; Recupero Bleed Acqua e il suo effetto sulla vitalità cellulare

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, un metodo migliorato per Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Misura di particolato e sciolto composti elaborati da Alimentatori sospensioni attive

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

Procedura ottimizzata per determinare l'adsorbimento di fosfonati su idrossido ferrico granulare utilizzando un metodo di determinazione del fosforo miniaturizzato

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Rilevamento di Tilapia Lago Virus mediante RT-PCR convenzionale e SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

Progettazione di microplot e preparazione di campioni di piante e suolo per 15Analisi dell'azoto

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

Metodo elettrostatico per rimuovere il particolato organico dal suolo

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

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