Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01-CA169354 &#160; e R01-047822 &#160; dal National Institutes of Health e un Merit Award dal Department of Veterans Affairs (BCE). RKP è stato sostenuto da NIH T32 CA009287-30A1, un ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Fellowship progetto, e un American Cancer Society Mentored Research Scholar di Grant; BAZ è stato sostenuto da NIH concedere AI079320. JM è stato sostenuto da borse di NIH T-32 borsa di formazione T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 e American Cancer Society borsa di studio post-dottorato PF-12-052-01-CSM.

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità approvato Stanford, Palo Alto VA HCS, e National Institutes of Health istituzionale AnimalCare e uso Comitato le linee guida. 1. Preparazione per Prelievo e Processing (Tempo richiesto: ~ 10-15 min) <ol><li> Seminare murine cellule B16F0 melanoma (0,5-1 x 10 6) per via sottocutanea o vicino alla linea mediana dell&#39;addome in femminile C57BL / 6 topi come descritto in precedenza 6. In alternativa, inoculare le cellule tumorali in altri siti anatomici (es fianco, pad grasso mammario, etc). NOTA: Qualsiasi numero di tumori (impiantato o spontaneo) può essere utilizzato e valutato utilizzando questo protocollo. Ad esempio, altro comunemente usato tumori singenici in C57BL / 6 includono la linea colon MC38, Lewis carcinoma polmonare (LLC), e la linea prostata TRAMP-C2. Mentre xenotrapianti umani in topi immunodeficienti inoculate possono essere valutati in questo modo, va osservato che la profiles dei leucociti infiltranti il ​​tumore necessariamente essere modificati in conformità con lo stato immunodeficienti del mouse ospitante. <ol><li> Utilizzare supporti completo (ad esempio RPMI contenente 10% FBS e additivi) o un altro tampone contenente proteine ​​appropriata (ad es HBSS o PBS + 1% FBS o 1% BCS). Raffreddare i media o tampone a 4 ° C prima euthanization. </li></ol></li><li> Impostare tubi di raccolta e filtri per i tumori asportati; mettere questi su ghiaccio. <ol><li> Utilizzare un tubo da 50 ml conica per tumore sia asportato. Inserire un filtro sospensione di cellule 40-70 micron di ciascuno. In alternativa, utilizzare 15 ml provette coniche con filtro a rete metallica. Utilizzare 5 ml stantuffo della siringa o una penna di spessore per creare un filtro a tazza in cima al tubo 15 ml. </li></ol></li><li> Preparare strumenti per la resezione del tumore e di trasformazione; Utilizzare pinze chirurgiche e forbici sottili per resecare e tumori di processo. Utilizzare 70% di etanolo per pulire gli strumenti tra i campioni resezioni / tumorali. Per numero maggiore ocampioni F (ad esempio&gt; 10), si consiglia l&#39;elaborazione simultanea di campioni da parte di più ricercatori per evitare differenze significative nel tempo di elaborazione tra i campioni tumorali. </li></ol> 2. Tumore resezione (Tempo richiesto: ~ 5 min / tumorale) <ol><li> Euthanize B16 tumore topo, utilizzando singolarmente biossido di carbonio o altro metodo approvato. </li><li> Fissare il mouse su un palco chirurgica. Spruzzare la zona tumorale con il 70% di etanolo e pulire in eccesso; questo aiuta a prevenire la diffusione di tutti i capelli presenti. Per i topi non-nudo, radere l&#39;area pelle intorno al tumore prima della resezione, se necessario. </li><li> Utilizzando pinze e forbici, resecare il tumore sottocutaneo in blocco, compreso sovrastante e la pelle circostante. La quantità di &quot;margine&quot; pelle presa può variare, ma in genere resecare 2-3 mm della pelle intorno al tumore. <ol><li> Pesare tumori resezione (+/- cute circostante), a questo punto. Posizionare la sezione pelle / tumore asportato nel filtro fissato all&#39;interno del pltubo conico astic. </li></ol></li></ol> 3. Preparare una sospensione Tumor singola cella (Tempo richiesto: ~ 5-7 min / tumorale) <ol><li> Utilizzare pinze e forbici per tritare tumore e sovrastante / pelle circostante. Tritare il campione con le forbici fino a quando tutte le grandi sezioni di tessuto vengono trasformati in sezioni 1-2 mm. NOTA: in genere, i tumori interi vengono elaborati; In alternativa, per i tumori di maggiori dimensioni, sezioni rappresentative dei tumori possono essere tritati e trattati. </li><li> Utilizzando un pistone da una siringa monouso 5 o 10 ml, disaggregare meccanicamente il tessuto tumorale tritata contro il filtro garantito. </li><li> Utilizzando una pipetta, lavare il tessuto tumorale trattati con 5-10 ml di mezzi freddo o buffer. Questo filo singole cellule attraverso il filtro. </li><li> Ripetere i due passaggi precedenti più volte, assicurando che il numero totale e volumi di lavaggi sono circa gli stessi per i tumori di dimensioni simili. <ol><li> Dopo aver lavato il tessuto tumorale elaborato, osservarepiccoli frammenti di pelle e / o di altri tessuti connettivi devono essere lasciati nel filtro. </li><li> In alternativa, per i tumori in cui solo disaggregazione meccanica può non essere sufficiente, la digestione con collagenasi e / o altri enzimi può essere eseguita prima della procedura di macinazione. Ciò consentirà una sospensione più approfondita singola cellula. Tuttavia, va notato che tali protocolli di digestione possono influenzare l&#39;espressione dell&#39;antigene di superficie 20, quindi si deve usare cautela nell&#39;interpretazione di questi risultati. </li></ol></li><li> Lavare e agglomerare le cellule aggiungendo media / tampone e centrifugazione a 4 ° C 500 g per 5 min. </li></ol> 4. FACS colorazione di sospensione singola cella (Tempo richiesto: ~ 30-60 min) <ol><li> Risospendere le cellule in tampone FACS ghiaccio freddo (PBS + 1% FBS). </li><li> Contare cellule vitali con trypan blu e un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. </li><li> Determinare la resa di cellule vitali totale per volume. Questi dati possono essere utilizzati per estrapolarenumero assoluto di tumore leucociti infiltranti in combinazione con dati FACS. </li><li> Determinare il numero di celle da colorare e analizzato mediante FACS. Questo sarà influenzato da diversi fattori (ad esempio tumore tipo istologico, età e dimensione del tumore, percentuale media di leucociti infiltranti, etc.). NOTA: In B16 melanoma, abbiamo trovato una bassa percentuale di tumori infiltranti leucociti (TIL, in genere &lt;5%) rispetto alle cellule tumorali. Così, almeno 1 x 10 6 tumore totale (tumori + leucociti infiltranti) le cellule sono state in genere raccolti via FACS per l&#39;analisi. <ol><li> Utilizzando i dati di conteggio Trypan-macchiato, volume calcolato di cellule da colorare per FACS. Ad esempio, se TIL tipicamente costituiscono 5% delle cellule tumorali totali (molte delle cellule tumorali sarà morto macchia trypan), fattore questo nel numero totale di tumore sospensione singola cella da colorare. </li><li> Per sottoinsiemi di leucociti meno comuni esempio CCR9 + pDC) utilizzare un numero maggiore di cellule tumorali totali (ad esempio 2-3 x 10 6) per FACS colorazione, data la bassa frequenza relativa di queste cellule in sospensione di cellule singole. </li></ol></li><li> Colorare la sospensione singola cellula tumorale per FACS. <ol><li> Per discriminazione live / morto, utilizzare una macchia risolvibile o macchia non risolvibile (ad esempio ioduro di propidio) può essere utilizzato. Se cellulare sono macchiati senza discriminazioni live / morti, cautela deve essere informato dato il potenziale di legame non specifico degli anticorpi. </li><li> Colorare la sospensione cellulare per specifici sottoinsiemi di leucociti utilizzando un protocollo di colorazione FACS standard. Cellule blocchi per ridurre vincolante con PBS / FBS contenente siero di ratto 1% e Fc block (anti-CD16 / 32) per 10 min prima della colorazione con anticorpi antigene-specifici anticorpi non specifico. Includere gli anticorpi giusti controllo isotipo per assicurare la colorazione è specifica. </li><li> A questo punto, dopo la colorazione FACS è completa, fissare campioni con 4% di formaldeide o altro agente fissativo simile. Conservare i campioni a 4 ° C in dark (da evitare quenching di fluorofori) fino al momento della raccolta e l&#39;analisi. NOTA: Memorizzazione campioni fissati per lunghi periodi di tempo può provocare l&#39;alterazione del segnale e l&#39;intensità dei fluorofori 21. </li><li> Raccogliere i campioni su un citometro di flusso. Flusso ottimale citometro impostazioni variano a seconda del tipo di strumento e impostazione laser / rivelatore. NOTA: Inoltre, ci può essere la variabilità tra esperimenti, anche se si utilizza la stessa macchina. Quindi, eseguire appropriata configurazione della macchina (ad esempio utilizzando perline di calibrazione) per garantire un&#39;adeguata impostazione della compensazione prima della raccolta e l&#39;analisi di ogni esperimento FACS. </li></ol></li><li> Analisi di sottoinsiemi leukoctye <ol><li> Utilizzando il software di analisi dei dati FACS, per analizzare i dati. Per un live macchia / morto, iniziare gating fuori le cellule morte. Usare anticorpi contro un marcatore specifico dei leucociti (ad esempio anti-CD45) per identificare leucociti all&#39;interno delle cellule vive. <ol><li> Dopo questa operazione, utilizzare vari Gatiregimi ng per identificare sottoinsiemi specifici, a seconda del protocollo di colorazione. Ad esempio, per identificare le cellule CD4 + T, selezionare la regione SSC lo dalla popolazione CD45 + e selezionare le cellule CD19 +-CD3; da queste cellule CD4 + T può essere identificato 22. </li></ol></li><li> Analizzare i dati e presentarli in un certo numero di modi diversi per garantire la coerenza e identificare i modelli o le tendenze (ad esempio utilizzare un totale di numeri, percentuali o rapporti di quantificare sottoinsiemi). NOTA: Per esempio, abbiamo guardato totale CD45 + cellule dal vivo come percentuale di cellule tumorali totali raccolti (Figura 1). Inoltre, abbiamo quindi calcolato la percentuale di ciascun sottogruppo di leucociti (ad esempio, le cellule CD4 + T) all&#39;interno del tumore e confrontato questi come i rapporti tra il controllo e gruppi di test (Figura 3). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Esecuzione di analisi dettagliata del microambiente tumorale è fondamentale nel determinare i meccanismi e gli effetti di immunomodulazione. Con la crescente presenza di immunotherapeutics nel regno clinico umano, comprendere l&#39;impatto di questi agenti sui leucociti infiltranti il ​​tumore sta diventando necessaria per definire il loro meccanismo d&#39;azione. Negli esseri umani, esistono spesso difficoltà cliniche e / o logistiche nell&#39;ottenere e analizzando tessuto tumorale per l&#39;analisi dei leucocit...

L&#39;equilibrio tra la crescita del tumore e la promozione e la regressione è, in parte, dipende l&#39;equilibrio del tumore infiltrante leucociti pro- e anti presenti nel microambiente 1,2. Per studiare il microambiente tumorale (TME) e in particolare individuare le sottopopolazioni di leucociti infiltrante, abbiamo sviluppato un metodo per la valutazione dei tumori sottocutanei in un modello murino di tumore. L&#39;importanza di studiare il microambiente tumorale è ben noto e supportato in letteratura. Numerosi studi hanno dimostrato che l&#39;equilibrio delle cellule immunitarie pro e anti-tumorali infiltranti può influire i risultati di crescita del tumore, non solo nel topo, ma anche studi sull&#39;uomo (recensito in 3,4). Ad esempio, Curiel et al. Hanno dimostrato che hanno peggiorato i risultati clinici nei pazienti con tumore ovarico sono stati correlati con la presenza di percentuali crescenti di regolamentazione cellule T CD4 + infiltranti il tumore (Tregs) 5. Il nostro lavoro ha dimostrato l&#39;effetto di un novel leucociti chemiotattico sul rapporto di sottoinsiemi di leucociti in un modello murino di melanoma 6, che anche correlata con diminuita crescita tumorale. Pertanto, le analisi dettagliate dei sottoinsiemi dei leucociti in un tumore è ora più ampiamente riconosciuto e sempre più importante. Ci sono molti modi per valutare il microambiente tumorale per infiltrazione leucociti; per esempio gruppi hanno ingegnerizzato topi transgenici per esprimere diverse proteine ​​fluorescenti al fine di immagine TME 7, immunoistochimica classica e immunofluorescenza di sezioni conservate 8, comprese varie modalità di imaging quali MRI, PET, la microscopia confocale 9-11 - alcuni con la capacità di monitorare intravitally 10,12. Questi possono essere utilizzati con vari agenti di imaging molecolare, come nanoparticelle 13 o nuovi agenti di contrasto 14 che etichetta cellule immunitarie. Il nostro metodo è un approccio basato citometria di flusso e presenta diversi vantaggi.In primo luogo, l&#39;intero microambiente tumorale può essere campionato; al momento dell&#39;analisi, l&#39;intero tumore sottocutaneo e periferia circostante è chirurgicamente asportati per l&#39;elaborazione. Ciò elimina qualsiasi polarizzazione potenzialmente campionamento all&#39;interno di un singolo tumore e dà un&#39;analisi più &quot;globale&quot; del tumore nel suo complesso. In secondo luogo, noi utilizzando il flusso multicolor citometria di analizzare i sottoinsiemi di leucociti permette di valutare più specificamente il fenotipo dei leucociti infiltranti. A seconda del numero di colori usati, sottoinsiemi molto specifici possono essere identificati. Questo è importante in quanto vi sono diversi sottoinsiemi dei leucociti all&#39;interno di un particolare tipo di cellule - o anche in una classifica generale sottotipo - che hanno funzioni diverse che sono potenzialmente significativo nel determinare il destino del tumore. Ad esempio, le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono stati implicati in antitumorale immunità 15. Tuttavia, il sottoinsieme CCR9 + di pDC ha dimostrato di essere tollerogenico 16, e spostando il balance di tale sottoinsieme può avere un impatto sulla crescita tumorale. Il nostro metodo è appropriato per sottocutanea o altri tumori che possono essere asportate in blocco. Nelle nostre mani, tumori sono stati uniformemente resecati al momento della eutanasia. Tuttavia, è concepibile, come è stato fatto in alcuni studi, che un tumore sottocutaneo potrebbe essere completamente asportato con chiusura della pelle circostante in una chirurgia di sopravvivenza 17, consentendo così la valutazione ulteriore dell&#39;animale. L&#39;analisi viene quindi eseguita sul tumore resecato. Pertanto, i risultati rappresentano un unico tempo di valutazione nello sviluppo del tumore. Mentre questo permette uno sguardo dettagliato nel microambiente, è anche un&#39;immagine statica di ciò che è senza dubbio un processo dinamico. Tuttavia, leucociti isolati (ad esempio via magnetico separazione o gradiente di densità) possono poi essere analizzati separatamente dal epiteli tumore e stroma, o utilizzati in altri, saggi funzionali per definire ulteriormente la loro fenotipo, come è stato previdentemente descritto 18. Questo metodo, quindi, sarebbe utile per eventuali investigatori interessati a comprendere la composizione dei leucociti all&#39;interno del microambiente tumorale in un dato punto di tempo, sia nella cornice del corso malattia naturale, o dopo uno specifico perturbazione terapeutica. Sebbene non sia fatto da noi, variazioni di questo procedimento potrebbe anche potenzialmente essere utilizzati per analizzare porzioni specifiche di un tumore in isolamento. Ad esempio, date le dimensioni del tumore, la zona periferica (s) può essere scisso dalla centrale, eventualmente nucleo necrotico del tumore per dare il ricercatore una visione più spazialmente segregati del microambiente tumorale. Nel settore in rapida crescita del tumore immunologia, non ci sarà senza dubbio un numero esponenzialmente crescente di studi che valutano nuovi agenti immunomodulatori in modelli tumorali murini. Diversi studi hanno messo in evidenza le differenze in funzione dei leucociti specifica all&#39;interno del tumore rispetto al periferico enbiente. Ad esempio, Shafer-Weaver et al. Ha dimostrato in un modello murino che CD8 + cellule T antigene-specifica effettrici, mentre attiva in periferia, sono state trasformate in cellule soppressori CD8 + T, una volta vittime della tratta nel microambiente tumorale 19. Questo è stato in parte dovuto al TGFβ, ma altri fattori sono probabilmente coinvolti pure. Pertanto, la valutazione sottoinsiemi leucociti - numeri e rapporti, nonché lo stato funzionale - entro il tumore stesso darà una rappresentazione più accurata degli effetti di un particolare immunomodulazione sul destino tumore. La nostra tecnica permette un&#39;analisi dettagliata del tumore e fornisce il ricercatore la possibilità di individuare più da vicino i cambiamenti nelle popolazioni di leucociti che approcci precedenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of the Material/Equipment</td>
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			<td style="width:229px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>http://cellgro.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-35</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical scissors/forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>roboz.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-030-CM</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientifice&#160;</td>
			<td>02-671-54&#160;</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td>lieftechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo software</td>
			<td>TreeStar, Inc</td>
			<td></td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

Cellule immunitarie specializzate che infiltrano il microambiente tumorale regolano la crescita e la sopravvivenza di neoplasia. Le cellule maligne devono eludere o sovvertire antitumorali risposte immunitarie per sopravvivere e prosperare. Tumori approfittare di una serie di diversi meccanismi di immune &quot;fuga&quot;, tra cui l&#39;assunzione di tollerogenico DC, cellule T regolatorie immunosoppressori (Tregs), e le cellule mieloidi soppressori di derivazione (MDSC) che inibiscono le risposte antitumorali citotossici. Al contrario, le cellule immunitarie anti-tumorale effettrici possono rallentare la crescita e l&#39;espansione di tumori maligni: cellule dendritiche immunostimolante, cellule killer naturali che ospitano innata immunità anti-tumorale, e le cellule T citotossiche tutti possono partecipare alla soppressione del tumore. L&#39;equilibrio tra pro e anti-tumorali leucociti determina in ultima analisi, il comportamento e il destino delle cellule trasformate; una moltitudine di studi clinici umani hanno portato questo fuori. Pertanto, l&#39;analisi dettagliata di sottoinsiemi di leucociti all&#39;internomicroambiente tumorale è diventato sempre più importante. Qui, si descrive un metodo per analizzare sottoinsiemi di leucociti infiltranti presenti nel microambiente tumorale in un modello di tumore del mouse. Cellule tumorali di melanoma mouse B16 sono state inoculate sottocute in topi C57BL / 6. In un periodo di tempo specificato, i tumori e la pelle circostante sono stati asportati in blocco e trasformati in sospensioni di cellule singole, che sono stati poi macchiati per il multi-color citometria a flusso. Utilizzando una varietà di marcatori leucociti sottoinsieme, siamo stati in grado di confrontare le relative percentuali di infiltrazione sottoinsiemi di leucociti tra controllo e tumori chemerina esprimono. Gli investigatori possono utilizzare tale strumento per studiare la presenza immunitaria nel microambiente tumorale e quando combinato con le misure tradizionali di dimensioni pinza di crescita tumorale, potenzialmente permetterà loro per chiarire l&#39;impatto dei cambiamenti in composizione immune sulla crescita tumorale. Tale tecnica può essere applicata a qualsiasi modello di tumore in cui il tumore ed il suo microambiente cun essere asportato e trattati.

I nostri risultati hanno dimostrato che forzata over-espressione di chemerina nei tumori B16 murini augmented la percentuale di tumori infiltranti leucociti (TILS). Inoltre, sono stati identificati modifiche al rapporto relativo di sottoinsiemi di leucociti rappresentate nel microambiente tumorale associato con espressione chemerina. Re-stampa con il permesso di Pachynski et al. 6. La Figura 1 mostra che c&#39;è stato un significativo aumento totale CD45 +...

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Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

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Medicine

19.9K Views.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

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Medicina

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modello ortotopico tumore della vescica e la valutazione del trattamento intravescicale sarna

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Renale Capsule xenotrapianto e sottocutanea Pellet impianto per la valutazione di carcinogenesi della prostata e dell&#39;iperplasia prostatica benigna

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

Sottocutanea angiotensina II per infusione con osmotica pompe Induce aortica aneurismi nei topi

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Valutazione istomormetrica standardizzata dell'osteoartrite in un modello di topo chirurgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...