Il laboratorio Yeh è sostenuto da fondi per la ricerca da un American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) assegnato alla Hollings Cancer Center presso MUSC, da finanziamenti per la ricerca da un Dipartimento della Difesa di sovvenzione (W81XWH-11-2- 0229) a MUSC, e un premio dalla Fondazione Concern (a ESY).

Il protocollo segue le linee guida e gli standard di cura degli animali della Medical University of South Carolina (MUSC) e la sua Animal Care istituzionali e del Comitato uso (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Mammaria dissezione del tumore (opzionale a seconda degli obiettivi di studio e se analisi tumore primario o coda vena iniezione è stata eseguita). <ol><li> Euthanize mouse utilizzando una dose letale di anestesia isoflurano secondo IACUC e regolamentazione università. Confermare euthanization da lussazione chirurgica. </li><li> A bordo della gomma piuma, poli con perni dissezione mettendo mouse sulla sua schiena con gli arti diffusione. </li><li> Spray mouse con etanolo al 70%. </li><li> Utilizzando pinze, afferrare la parte inferiore dell&#39;animale al centro. </li><li> Usando forbici, tagliare verso l&#39;alto verso il collo attraverso la pelle, facendo attenzione a non forare la cavità peritoneale del mouse. </li><li> Tagliare la pelle agli arti per rivelare tessuto tumorale. </li><li> Sezionare tessuto tumorale e preserve dal metodo preferito, come il congelamento o fissazione, per ulteriore analisi (non discusso ulteriormente in questo protocollo). </li></ol></li><li> Dissezione tessuto polmonare. <ol><li> Se il tessuto tumorale è stato raccolto come descritto sopra, definire con precisione qualsiasi eccesso di pelle. </li><li> Utilizzando pinze, afferrare peritoneo alla estremità inferiore dell&#39;animale e iniziare il taglio verso l&#39;alto verso la base del collo. </li><li> Tagliare con cautela lungo i lati sinistro e destro della gabbia toracica facendo attenzione ad evitare eventuali recidere vasi sanguigni che possono sanguinare nella cavità toracica. Rimuovere le costole tagliando a sinistra ea destra attraverso il diaframma e superiore porzioni della gabbia toracica. </li><li> Utilizzando pinze afferrare la trachea del mouse e tirare avanti. </li><li> Sever la trachea con le forbici dissezione e rimuovere polmoni di mouse. Nota: Il cuore può rimanere attaccato al polmone. In questo caso, sezionare accuratamente cuore lontano dai polmoni avendo cura di raccogliere tutti i cinque lobi (vedi Figura 1 </strong&gt;). </li><li> Lavare delicatamente con PBS per rimuovere il sangue in eccesso. </li></ol></li><li> La valutazione al lordo del tessuto polmonare. <ol><li> Opzione 1: imaging in vivo. <ol><li> Per l&#39;imaging luciferasi, ~ 10 minuti prima di imaging, dare un 150 animali dose mg / kg di luciferina da intraperitoneale (ip) iniezione. Polmoni Immagine in vivo in animali anestetizzati o dopo la rimozione dopo la dissezione (Figura 2) 5. </li></ol></li><li> Opzione 2: valutazione lorda. <ol><li> Esaminare polmoni sotto stereo microscopio per visualizzare noduli tumorali. Nota: Se le cellule sono GFP etichettati, uno stereomicroscopio capace fluorescenza contenente un cubo di luce con i massimi di eccitazione / emissione appropriata (ad esempio vicino 470/510 nm) per rilevare GFP può essere utilizzato per esaminare polmoni stereoscopicamente per fluorescenza prima della lavorazione. </li></ol></li><li> Se i polmoni devono essere analizzati immediatamente, passare alla sezione &#39;RNA Isolation&#39;. In caso contrario, far scattare il tessuto freeze usando sapone liquidid azoto o ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. RNA Isolation Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, l&#39;RNA è stato isolato utilizzando un kit di isolamento di RNA (vedi Lista dei materiali). Mentre l&#39;analisi attuale utilizza prodotto uno specifico produttore, una varietà di kit di isolamento sono disponibili da diversi fornitori affidabili. Inoltre, i metodi di centrifugazione non a base di kit sono anche un&#39;opzione. cDNA dovrebbe anche essere preparata da un campione di controllo di RNA positivo, come una linea cellulare o plasmide, per l&#39;analisi della curva standard. In alternativa, un controllo positivo specifica per il set di sonde di primer può essere acquistato (vedi Materiali List). <ol><li> Se si utilizza il tessuto precedentemente congelato, raccogliere tessuto congelato in ghiaccio secco. </li><li> Omogeneizzare tessuto utilizzando uno dei seguenti metodi come: mortaio e pestello macinazione eseguito a mano in ghiaccio secco dopo il congelamento del tessuto in azoto liquido; omogeneizzatore tessuto o un dispositivo meccanico di dissociazioneda suggerimento del produttore; sonicazione, o altro metodo preferito. Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, il metodo preferito di omogeneizzazione è sonicazione. <ol><li> Per l&#39;analisi presentata nella figura 3, preparare tampone di lisi (fornito nel kit di isolamento di RNA) e 2-mercaptoetanolo ad un rapporto di 20 microlitri 2-mercaptoetanolo per ogni 1 ml di tampone di lisi. Tessuto risospendere in 300 microlitri tampone di lisi completato con 2-mercaptoetanolo per ogni 30 g di tessuto e ultrasuoni per 10 sec con sonicatore fissata al 30% di ampiezza. </li><li> Se si usa mortaio e pestello, il tessuto terra risospendere in tampone di lisi 300 ml dopo la rettifica. </li></ol></li><li> Aggiungere 10 ml proteinasi K a 590 microlitri tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Aggiungere 600 microlitri soluzione proteinasi K per ogni 300 ml (ossia per ogni 30 mg) di tessuto. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Nota: il tempo di digestione può variare. </li><li> Centrifugare i campioni a ≥13000 g per 10 minuti per rimuovere i detriti. </li><li> Trasferire il surnatante di nuovi tubi. </li><li> Aggiungere 450 microlitri di etanolo (96% -100%) per ogni 900 ml di surnatante di precipitare l&#39;RNA. </li><li> Trasferire 700 microlitri della miscela lisato / etanolo alla colonna. </li><li> Centrifugare i campioni a ≥13,000 g per 1 minuto per legare l&#39;RNA alla colonna. </li><li> Smaltire i rifiuti liquidi e aggiungere restante surnatante in colonna e far girare di nuovo. </li><li> Una volta che tutto il lisato viene centrifugato attraverso la colonna, aggiungere 350 ml di tampone di lavaggio 1 alla parte superiore dei campioni colonna e centrifugare a ≥13,000 g per 30 sec. </li><li> Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore. </li><li> Preparare DNase mescolando 5 unità di DNasi I dell&#39;enzima con 5 ml di 10x DNasi e 40 ml di DNasi / RNasi acqua libera per campione (volume totale di 50 microlitri / campione). </li><li> Aggiungere 50 ml di DNasi mescolano a ogni colonna e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 350 ml di tampone di lavaggio da 1 a colonna e centrifugare samples a ≥13,000 g per 30 sec. </li><li> Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore. </li><li> Aggiungere 600 ml di tampone di lavaggio 2 alla colonna e spin 30 sec a ≥13,000 g. </li><li> Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone di lavaggio 2 e centrifugare per 2 min a ≥13,000 g. </li><li> Mettete parte di colonna in nuovo tubo di raccolta ed eliminare vecchio tubo di raccolta. </li><li> Aggiungere 50-100 ml di RNasi / DNasi acqua libera alla colonna e incubare per 1 min. </li><li> Spin per 1 min a ≥13,000 g. </li><li> Eseguire nuovamente eluato raccolte attraverso colonna per aumentare la resa di RNA. </li><li> Per l&#39;uso immediato, mantenere i campioni sul ghiaccio e procedere alla quantificazione. Per un uso successivo, scatto congelamento ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare a -80 ° C freezer fino al momento. </li></ol> 3. First Strand Synthesis Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, la trascrittasi inversa (RT) è stata eseguita una reazione Fkit di sintesi irst Strand cDNA progettato per QRT-PCR (vedi Lista dei materiali). <ol><li> Se i campioni sono stati raccolti in precedenza, scongelare i tubi su ghiaccio. </li><li> Misurare la quantità di RNA utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Utilizzando 0,5-2 mg di RNA totale, eseguire prima sintesi filone utilizzando trascrittasi inversa per generare cDNA magazzino. <ol><li> In sterili, tubi RNasi / PCR-free DNasi / piastre, preparare la miscela di reazione (Tabella 1). Mescolare delicatamente e centrifugare. Programmare una macchina di PCR standard (Tabella 2). </li></ol></li><li> Diluire reazione finito al volume desiderato (generalmente 50-100 ml) con acqua priva di nucleasi sterile. </li></ol> 4. Real-time PCR Nota: Per l&#39;analisi rappresentante, è stato utilizzato SYBR green. Tuttavia, qualsiasi metodo preferito può essere sostituito a discrezione dell&#39;utente. <ol><li> Usando un cDNA controllo positivo, impostare una curva standard per ogni set di primer. <ol><li> Per l&#39;analisi illustrato in Figura 3, preparare la curva standard per HER2 umano con il produttore raccomandato cDNA controllo positivo (vedi Lista dei materiali). Per il mouse GAPDH, utilizzare il negativo cDNA di controllo del polmone per generare una curva standard. Per ciascuna sonda, in serie diluire il cDNA 1: 4 per generare 5 standard. </li></ol></li><li> Calcolare il numero di campioni totali, che dovrebbe includere la curva standard e campioni sperimentali. Nota: Per l&#39;analisi qui descritta, 2-3 repliche sperimentali per campione sono stati analizzati. Analisi della curva standard è stata eseguita per generare un modello di regressione lineare semplice che può essere applicato per determinare la quantità relativa di HER2 e GAPDH per campione calcolare quantità normalizzata finale. Questa analisi inoltre garantire che l&#39;efficienza primer è adeguata per l&#39;analisi a mano. </li><li> In una, RNasi / tubo-free DNasi sterili, preparare master mix (Tabella 3). <ol><li> Calcola Master Mix Amount per campione. Scala per più di un campione. Utilizzare un master mix per ogni gene sperimentale di interesse, così come un controllo interno, come GAPDH. Utilizzare primers per GAPDH ad una concentrazione finale di 200 nM. Nota: Il controllo interno è particolarmente utile quando si cerca di distinguere tra l&#39;origine delle cellule umane e mouse. Nota: concentrazione Primer per HER2 è stata ottimizzata e determinato dal produttore. </li></ol></li><li> Preparare piastra di prova contenente 1 cDNAs microlitri corrispondenti a ciascun campione standard o sperimentale. Allocare almeno 1 cDNA campione / bene per ogni sonda primer. Aggiungere 19 ml di Master Mix per pozzetto per ogni sonda primer. Nota: Per i dati rappresentativi della figura 3, i campioni di cDNA sono stati analizzati in duplicato per ciascuna sonda primer e graficamente come media dei due campioni. </li><li> Reazione Esegui in macchina QRT-PCR utilizzando consigliato o precedentemente testato protocollo PCR. Vedere la Tabella 4 </sTrong&gt; per il protocollo PCR utilizzato per i dati rappresentativi in Figura 3 e Figura 4. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY e MAA non sono dipendenti di FirstString Research Inc. e non detengono alcun interesse finanziario nella società. FirstString Research Inc. ha fornito i dati di imaging luciferasi che è stato presentato in questo manoscritto. GSG è presidente e CEO di FirstString Research. CLG è un dipendente di FirstString Research. GSG e CLG hanno stock option emesse dalla FirstString Research.

Questo protocollo descrive l&#39;uso di QRT-PCR per valutare mammaria le metastasi delle cellule tumorali al polmone utilizzando un modello murino di xenotrapianto. Si riconosce che altre tecniche, tra cui l&#39;imaging bioluminescente, sono disponibili e sono anche efficaci per la rilevazione di metastasi pur avendo i propri valori e limiti. I dati presentati indicano che QRT-PCR fornisce una misura efficace di rilevamento dell&#39;mRNA derivate da tumore all&#39;interno di tessuto polmonare per la quantificazione dell...

Analisi RT-PCR si propone come un metodo per valutare metastasi tumorali. Questo metodo si propone come alternativa per gli utenti che sono interessati a valutare le metastasi, ma non possono avere accesso alle attrezzature specifiche quali attrezzature imaging in vivo o una fluorescenza stereoscopio capace. Una discussione dei metodi comunemente usati è presentato seguita da una dimostrazione di come l&#39;analisi RT-PCR può essere usato sia come separato o come un metodo per valutare guidata metastasi. Questa procedura ha il potenziale per fornire un&#39;analisi quantitativa di carico metastatico. Metodi standard di analisi lordo, tra cui la visualizzazione dei polmoni allo stereomicroscopio nonché sezionamento seriale seguita da ematossilina eosina (H &amp; E) la colorazione del tessuto polmonare, sono quantificabili ma fanno molto affidamento su parametri definiti dall&#39;utente per il conteggio 2-5. Nel valutare i polmoni interi utilizzando uno stereomicroscopio, solo le grandi metastasi di superficie sono visibile e analisi richiede l&#39;investigatore di avere ragionevole conoscenza della struttura anatomica del polmone a determinare ciò che costituisce una lesione metastatica. Marcatura fluorescente di cellule tumorali con un marcatore, come GFP e l&#39;uso di uno stereomicroscopio che contiene un cubo di luce con i massimi appropriata di eccitazione / emissione (ad esempio vicino 470/510 nm per GFP) aiuta in questo processo, ma solo noduli tumorali superficie sono rilevabili . Inoltre, la fluorescenza dalla contaminazione del sangue, che è visibile sotto gli stessi parametri GFP, può portare a false identificazione di possibili lesioni metastatiche. Sezionamento del polmone seguita da colorazione H &amp; E di visualizzare metastasi polmonari è un metodo utile per valutare micrometastasi e altri processi microscopici, tra cui l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie, ma spesso richiede l&#39;uso di tutto il tessuto polmonare per paraffina, sezionamento, e procedure di colorazione. Pertanto, le procedure a valle non sono ideali seguendo questo method. Sebbene quantificabile, questa procedura richiede al ricercatore di valutare un gran numero di sezioni polmonari colorate per animale per garantire che l&#39;analisi dei bilanci dell&#39;intera struttura 3D del polmone. Di conseguenza, questo tipo di esame è molto tempo, può portare ad errori di conteggio e analisi dipende fortemente investigatore discrezione. Diversi in tecniche di imaging in vivo (ad esempio la risonanza magnetica, PET, SPECT) sono attualmente utilizzate per eseguire o testare i processi biologici in modelli di roditori sperimentali 8. Imaging in vivo bioluminescente è un metodo comune utilizzato per acquisire una visione lordo di metastasi 9. Questa tecnica è generalmente applicato per valutare la presenza di attività della luciferasi dovuto all&#39;accumulo di cellule tumorali, che sono progettati per contenere un elemento di risposta luciferasi, che risiedono in organi specifici come la ghiandola mammaria dopo l&#39;impianto delle cellule tumorali e il polmone su metastasi spontanea 10. La visualizzazione di attività della luciferasi è indotta dalla presenza del substrato luciferina (D-luciferina). Luciferasi catalizza la decarbossilazione ossidativa di D-luciferina per oxyluciferin generare bioluminescenza. Mentre informativo, questo metodo è limitata da diversi fattori tra cui la stabilità del substrato (es emivita breve), adeguata distribuzione di substrato, che dipende da come viene consegnato a animali da esperimento, e la bassa sensibilità di rilevazione 9. Un merito principale di questa tecnica è che è non invasivo, può essere eseguita su animali vivi, e può portare alla rilevazione di metastasi delle cellule tumorali in diversi organi che non può essere normalmente raccolte a dissezione 9,10. Un aspetto positivo delle tecniche di imaging in vivo è che il tessuto polmonare è indisturbato permettendo per le procedure secondari come paraffina o come presentato qui, analisi QRT-PCR. Tuttavia, poiché QRT-PCR è Theoretically una misura più sensibile di rilevazione, la valutazione lordo non può rivelare un basso numero di cellule presenti nel polmone tumore. Mentre utile, le tecniche di imaging sopra descritti possono essere sostituiti o integrati con il metodo RT-PCR attualmente descritto. QRT-PCR ha il potenziale per fornire una misura sensibile di mRNA derivate da tumore all&#39;interno di un polmone.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

La malattia metastatica è la diffusione delle cellule tumorali maligne dal sito cancro primario di un organo lontana ed è la causa primaria di cancro associato alla morte 1. Comuni sedi di diffusione metastatica includono polmone, linfonodi, cervello, ossa e 2. Meccanismi che guidano le metastasi sono zone intense di ricerca sul cancro. Di conseguenza, le analisi efficaci per misurare onere metastatico in siti distanti di metastasi sono strumentali per la ricerca sul cancro. Valutazione delle metastasi polmonari in modelli di tumore mammario viene generalmente effettuata attraverso l&#39;osservazione qualitativa lordo del tessuto polmonare dopo dissezione. Metodi quantitativi per valutare le metastasi si limitano attualmente ex vivo e in tecniche di imaging basato vivo che richiedono parametri definiti dall&#39;utente. Molte di queste tecniche sono al di organismo intero piuttosto che il livello cellulare 3-6. Anche se i metodi di imaging più recenti che utilizzano la microscopia multi-fotone sono in grado di valutare metastasiTASIS a livello cellulare 7, questi altamente eleganti procedure sono più adatti a valutare i meccanismi di diffusione piuttosto che la valutazione quantitativa degli oneri metastatico. Qui, un semplice metodo in vitro per valutare quantitativamente metastasi è presentato. Utilizzando quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR), cellule tumorali mRNA specifico può essere rilevato all&#39;interno del tessuto polmonare del mouse.

Al di là del tempo necessario per eseguire l&#39;inoculazione iniziale di cellule tumorali in animali sperimentali e se si esegue, in analisi primaria del tumore in vivo, la raccolta dei tessuti, isolamento dell&#39;RNA, e l&#39;analisi RT-PCR è una procedura 1-2 giorni (figura 1) . Un esempio di analisi lordo è l&#39;imaging bioluminescente valutare cellule tumorali nel tessuto polmonare....

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Questo protocollo descrive come utilizzare quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR) per rilevare l&#39;mRNA specifici di cellule tumorali rappresentano metastasi all&#39;interno del tessuto polmonare del mouse.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Views.  Medical University of South Carolina.  Questo protocollo descrive come utilizzare quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR) per rilevare l'mRNA specifici di cellule tumorali rappresentano metastasi all'interno del tessuto polmonare del mouse. 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di<em&gt; De Novo</em&gt; Metastasi del cancro del mammario

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Medicina

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging in vivo per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Riepilogo

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Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di