Il trapianto di isolotto è uno degli approcci più promettenti per il trattamento del diabete mellito di tipo I. E la ricerca di un sito adatto per il trapianto di isolotto è in corso. Il trapianto di isolotto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale è un metodo semplice ma efficace che può avere implicazioni cliniche.
L'estrapolazione di questa procedura alla clinica può portare allo sviluppo di una cura per i diabetici di tipo I. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sul trapianto clinico di isolotto in quanto il linguale è stato determinato per non essere un sito ideale per l'innesto di isolotto. È importante seguire attentamente ogni fase della procedura, in particolare i passaggi chiave, come la digestione del pancreas.
La dimostrazione visiva aiuterà i ricercatori a migliorare la tecnica per determinare meglio come eseguire l'isolamento dell'isolotto e la trasmutazione. Per la raccolta dell'isolotto, spruzzare per la prima volta la pelliccia di un topo C57 nero di 10 settimane con 75% di etanolo e riempire una siringa da cinque millilitri con una soluzione di collagenasi preparata al momento. Dotare la siringa di un ago perfusione smussato piegato calibro 32 e posizionare il mouse in posizione supina su un sacchetto di ghiaccio.
Usa forbici oftalmiche a punta dritta per fare un'apertura trasversale nella pelle dell'area pubica ed estendere l'incisione verso la testa dell'animale. Aprire completamente l'addome attraverso un'incisione a V dalla regione pubica al processo xifoide e spostare il fegato per esporre la cistifellea e l'intera lunghezza del condotto biliare comune. Quindi utilizzare un morsetto vascolare per chiudere l'apertura duodenale del condotto biliare comune e tagliare una piccola apertura nella cistifellea.
Cannulate il condotto biliare comune attraverso l'apertura con l'ago perfusione precedentemente preparato e iniettare circa due millilitri di soluzione di collagenasi nel pancreas. Quando tutta la collagenasi è stata consegnata, utilizzare due paia di micro pinzette non invadenti per separare il pancreas perfuso dall'intestino, dallo stomaco e dalla milza e posizionare il pancreas in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Una volta raccolti tutti i campioni, aggiungere 100 microlitri di Dnase I per pancreas ai tubi da 50 millilitri e scuotere vigorosamente ogni tubo circa 40 volte per un periodo di 10 secondi prima di posizionare i tessuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti con scuotimento moderato.
Alla fine dell'incubazione, aggiungere fino a un volume finale di 50 millilitri di Stop Solution per arrestare la digestione. E centrifugare i tubi a una velocità di 750 volte G a quattro gradi Celsius prima di fermare rapidamente la centrifuga. Dopo aver scartato i supernatanti, lavare i pellet due volte in 15-25 millilitri di Stop Solution per lavaggio nelle stesse condizioni di centrifugazione appena dimostrate.
Dopo il secondo lavaggio, mettere a punto tre pellet per tubo in nuovi tubi conici da 50 millilitri. E rimospendò le cellule pancreatiche in un volume totale di dieci millilitri di Histopaque 1119. Successivamente aggiungere con cura cinque millilitri di Histopaque 1077 lungo il lato di ogni tubo, seguiti da cinque millilitri di HBSS.
Separare le cellule per centrifugazione e utilizzare una pipetta Pasteur da cinque millilitri per raccogliere gli isolotti dall'interfaccia HBSS Histopaque 1077. Mettere in comune gli isolotti in un nuovo tubo conico da 50 millilitri in un volume finale di 50 millilitri di Stop Solution per la centrifugazione degli impulsi e scartare il supernatante. Resuspend il pellet in 30 millilitri di soluzione stop fresca per una centrifugazione di un minuto e rimospend gli isolotti in 30 millilitri di mezzo di coltura.
Decantare gli isolotti in un piatto di coltura a tenuta di luce di 10 centimetri per tubo. E metti il piatto al microscopio stereo. Utilizzando 200 punte di pipetta a caricamento in gel di microliter, preleviare a mano gli isolotti sferoiferici bianchi dalla soluzione.
Mettere gli isolotti in un piatto di coltura cellulare non trattato contenente 10 millilitri di mezzo di coltura man mano che vengono raccolti. Controllare la purezza degli isolotti raccolti a mano mediante colorazione ditizone al microscopio leggero. E rilevare la vitalità degli isolotti mediante fluoresceina diacetato propidio ioduro colorazione sotto un microscopio fluorescente.
Quindi coltura gli isolotti isolati nel mezzo di coltura fresco a 37 gradi Celsius in aria al 95% e 5% di anidride carbonica fino al trapianto. A partire dai giorni tre e quattro dopo l'induzione del diabete, forare la vena caudale di ogni maschio C57 nero di otto settimane iniettato dalla streptozotocina intorno alle 10:00 a.m. per raccogliere un campione di sangue da ogni animale ricevente.
Utilizzare uno strumento di monitoraggio della glicemia di base per determinare il livello di glucosio nel sangue non a digiuno di ogni topo e quindi aggiungere il sangue sulle singole strisce di prova. Quando un animale ha dimostrato un livello di glucosio nel sangue di almeno 20 millimoli per litro due giorni di fila, pesare e contrassegnare il topo ricevente e confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale negli animali anestetizzati. Posizionare un'aliquota di idrogel da meno 20 gradi Celsius stoccaggio sul ghiaccio per lo scongelamento.
E trasferire da 450 a 500 equivalenti di isolotto per ricevente in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di mezzo per tubo su ghiaccio. Tamponare l'area inguinale sinistra del ricevente con il 75% di etanolo e posizionare il mouse in posizione supina. Fissare gli arti con nastro chirurgico e utilizzare i tosaerba per rimuovere i capelli intorno al sito chirurgico.
Tamponare l'area chirurgica con iodoforo e fare un'incisione verticale nella pelle disinfettata. Identificare l'arteria e la vena epigastrica inferiori all'interno dell'ISWAT e creare una piccola tasca sopra i vasi. Sedimentare gli isolotti per centrifugazione e rimuovere il più possibile il supernatante.
Aggiungere 20 microlitri di idrogel scongelato ad ogni tubo e rimostrare delicatamente gli isolotti, facendo attenzione ad evitare bolle. Una volta ottenuta una sospensione omogenea, utilizzare una punta di pipetta da 200 microliter per consegnare con cura l'intera miscela di idrogel di isolotto da un tubo in tasca. Quando l'idrogel si è completamente solidificato, aggiungere 20 microlitri di cefalosporina al sito di trapianto e chiudere il muscolo e la pelle con una sutura chirurgica continua 5-0.
Quindi posizionare il destinatario in una gabbia pulita su un cuscinetto termico con monitoraggio fino alla piena rimiglia. Dopo l'elaborazione dell'isolotto murino come dimostrato, gli isolotti murini isolati saranno sufficientemente puri per il trapianto. Solo gli isolotti isolati con un'alta vitalità dovrebbero essere utilizzati per il trapianto.
Dopo un'accurata miscelazione degli innesti di isolotto con idrogel, l'innesto può essere impiantato nel sito ISWAT. Dopo circa un mese di trapianto nell'ISWAT, gli innesti di isolotto invertono l'iperglicemia mentre il peso corporeo dei topi riceventi aumenta gradualmente. A 100 giorni dal trapianto, la rimozione degli innesti si traduce in un aumento immediato delle 10:00 a.m.
livello di glucosio nel sangue non a digiuno. L'analisi istologica in questo momento, rivela che gli innesti di isolotto sono rimasti intatti. E la colorazione immunofluorescente di insulina e glucagone indica che anche gli isolotti trapiantati sono funzionali a 100 giorni dopo il trapianto.
Fare attenzione a non scuotere troppo robustamente le cellule del pancreas profuse, altrimenti la capacità degli isolotti ottenuti sarà compromessa. Gli isolotti isolati possono essere trapiantati sotto la capsula renale come controllo per confrontare gli effetti del trapianto isolato nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale in loco. La procedura aggiungerà l'avvio di studi clinici di trapianto di isolotto ad altri siti oltre al fegato.
