Supportato da un sottoprogetto di NIH concedere P20 RR16440 e una borsa di studio ponte presso l&#39;Ufficio West Virginia University di ricerca e gli studi universitari al S. Weed. Assistenza tecnica da L. Lopez-Skinner durante le prime fasi di sviluppo del progetto si ringrazia. Gli autori sono grati per l&#39;assistenza tecnica e OSC19 cellule di J. Myers e M. Younes (Dipartimento di Chirurgia Testa e Collo, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner e K. Secrest (West Virginia University Department of Patologia Banca dei Tessuti) per l&#39;elaborazione istologica e delle procedure, R. Wysolmerski (West Virginia University, Dipartimento di Anatomia e Neurobiologia) per il LifeAct-mCherry costruire e J. Bear (University of North Carolina) per il vettore pLL7.0 lentivirale. L&#39;utilizzo del Fondo per la Virginia Occidentale Imaging Microscopy University (sostenuto da NIH concedere P20 RR16440 e Maria Babb Randolph Cancer Center) e la sua non-lineare laboratorio di microscopia ottica (NLOM, supportato da una collaborazione tra la West Virginia University Center for Neuroscience e la West Virginia University Dipartimento di Fisica / West Virginia nanoscienza Initiative) è anche riconosciuto con gratitudine. Il NLOM è supportato in parte dal NIH concedere P30 RR031155 al Centro di Neuroscienze.

1. Linee cellulari, costruzione del vettore e Produzione lentivirali <ol><li> Testa umana e del collo cellule tumorali linee (OSC19 o UMSCC1) sono state coltivate in mezzi di comunicazione completo, composto di DMEM (cat Cellgro # 50-003-PB) supplementato con 10% siero fetale bovino FBS (Hyclone cat # SH30070.03), 1% penicillina / streptomicina (cat Cellgro # 30-002-CI), e 1% di aminoacidi non essenziali (cat Cellgro # 25-025-CI). </li><li> Per trasferire il LifeAct-mCherry sequenza codificante nel vettore pLL7.0 lentivirale, il Sbf1 sito di riconoscimento del genitore mCherry cDNA è stato modificato con l&#39;introduzione di tre mutazioni in silenzio nella sequenza di riconoscimento mediante mutagenesi sito-diretta (cat Stratagene # 200518-5). La risultante modificato LifeAct-mCherry sequenza è stato poi amplificato mediante PCR con accompagnamento EcoR1/Sbf1 siti e subcloned in pLL7.0 per generare il pLL7.0-LifeAct-mCherry costruire. </li></ol> 2. pLL7.0-LifeAct mCherry-Virus Production <ol><li> Produzione virale è stata condotta secondo l&#39;espressione lentivirali sistemi manuali (versione del sistema Bioscience 2-051018). </li><li> La linea cellulare di packaging 293T/17 cellule (cat ATCC # CRL-11268) è cresciuta al 40% confluenza nei media stesso completo utilizzato per linee HNSCC. </li><li> Le cellule sono state transfettate con il pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 e pVSV-G vettori in un rapporto di 3:02:01, rispettivamente con CalPhos (cat Clontech # 631312). </li><li> Dopo 24 ore, i media iniziale della transfezione è stata sostituita con mezzi freschi. </li><li> Media è stata poi raccolti e rifornito ogni 12 ore per 72 ore e conservati a 4 ° C. </li></ol> 3. Produzione di testa e linee di cellule del collo con Stabile LifeAct-mCherry Espressione <ol><li> I mezzi raccolti è stato girato a 2000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Un ml di supporti contenenti virus è stato chiarito direttamente aggiunto al OSC19 o UMSCC1 celle per 12 ore. Le cellule sono state poi risciacquate, e un ulteriore ml di virus e &#39;stato aggiunto per un altro periodo di 12 ore. </li><li> Le cellule sono state trattate con supporti contenenti 200mg/ml puromicina per due settimane per selezionare le colonie resistenti. </li><li> Cloni sopravvissuti sono stati esaminati visivamente per LifeAct-mCherry espressione al microscopio a fluorescenza. Singole colonie positive sono state typsinized sterile utilizzando dischi clonazione 3 mm (cat Fisher # 0790710A). </li><li> Cellule positive sono state mantenute in un mezzo contenente puromicina 200mg/ml congelati fino alla schiena o utilizzato per l&#39;iniezione ortotopico. </li></ol> 4. Ortotopico di formazione del tumore dello xenotrapianto <ol><li> Tutte le procedure di animali sono state condotte in conformità con un protocollo (09-0821), approvato dalla cura degli animali West Virginia University e Comitato Usa. </li><li> LifeAct-mCherry cellule tumorali che esprimono stati trypsinized, centrifugati e 2,5 x 10 4 cellule sono state risospese in 50 microlitri mezzi di comunicazione completo. </li><li> Le cellule tumorali sono stati caricati in una siringa da un ml collegata ad un 27 ½ gauge. </li><li> Femmina atimici Fox1 nu / nu topi 8 settimane di età (Harlan Laboratories) sono stati anestetizzati con una combinazione di 80mg/kg xylazina ketamina e 10mg/kg. Topi anestetizzati sono stati mantenuti tra i 37-40 ° C su una piastra elettrica. </li><li> Utilizzando pinza sterile, la punta della lingua è stato afferrato delicatamente e con attenzione tirato fuori dalla cavità orale. </li><li> Le cellule sono state iniettate lentamente in un lato di ogni lingua per creare una massa bulbosa nel centro della lingua, evitando le arterie linguale. </li><li> I topi sono stati iniettati con yohimbina 2.1mg/kg e restituito al pad di riscaldamento, dove sono stati monitorati hanno per 2-3 ore durante il recupero dall&#39;anestesia. </li><li> Una volta rianimato, i topi sono stati collocati in gabbie sterili contenenti una dieta morbida pasta transgenici (cat BioServe # S3472). </li><li> I topi sono stati pesati ogni 2-3 giorni e monitorato visivamente per l&#39;insorgenza del tumore. </li></ol> 5. Preparazione delle Lingue del mouse per ex-vivo Imaging <ol><li> I topi ospitare tumori in diversi momenti (di solito 2-4 settimane post-iniezione) sono stati sottoposti ad eutanasia per inalazione di anidride carbonica. </li><li> Lingue sono stati estratti, sciacquati con PBS 1X e fissato su un lato di una cassetta convenzionale incorporare tessuto paraffina (Cat StatLab # H104,) utilizzando filati per cucire monofilamento da un negozio locale hobby e un 8 ago per cucire dimensioni. </li><li> Una volta che le lingue sono stati immobilizzati, l&#39;assemblea intera cassetta è stata posta in un piatto 30 millimetri colture di tessuti e immerso in PBS 1X. </li><li> Lingue trattati sono stati immediatamente utilizzati per la microscopia a due fotoni di eccitazione. </li></ol> 6. Imaging dei Tumori Lingua con microscopia a due fotoni <ol><li> Cassette lingua sono stati immersi in un piatto 60 millimetri contenente PBS 1X fissato in un supporto progettato su un braccio a sbalzo a scomparsa (Camera di Shuttle, Siskiyou strumenti) posizionato sotto l&#39;obiettivo di un microscopio in posizione verticale (Microscopio mobile (MOM); Sutter Instruments). </li><li> Un&#39;acqua 40X/0.8NA immersione lente dell&#39;obiettivo è stata posta direttamente su od oltre tum visibileo lesioni. Lingue sono ripreso al microscopio a due fotoni con il laser Ti: zaffiro (Mira, Coherent) intensità a 60 mW e la lunghezza d&#39;onda di ingresso di 755 nm per ottimizzare il segnale mCherry. </li><li> 1 millimetro di serie immagini di scansione laser sono stati raccolti a 1 micron profondità incrementale su una profondità totale del tessuto tra i 15 ei 100 micron (a seconda del volume del tumore). Le immagini sono state catturate con scanimage, un programma open source basato sulla piattaforma MATLAB che è stato sviluppato dal laboratorio di Karel Svoboda (Janelia Farms, HHMI). Scanimage genera un due canali di uscita raster pattern di scansione per controllare il x / y galvanometrico specchi di scansione, e allo stesso tempo, cattura un massimo di quattro canali di ingresso segnale contemporaneamente da tubi fotomoltiplicatori (PMT) attraverso una scheda di acquisizione dati (PCI-6610S , National Instruments). La PMT segnali sono amplificati da preamplificatori a basso rumore di corrente (SR570, Stanford sistema di ricerca) prima che in NI-DAQ per la visualizzazione sullo schermo del monitor. Scanimage raccoglie z-stack immagini controllando l&#39;asse z dello scopo e raccoglie time-lapse immagini in modalità singola o in bicicletta. Le immagini sono state salvate in un file TIFF a 16 bit di profondità. </li></ol> 7. Immagine Analisi mediante software Amira <ol><li> Amira di imaging per la quantificazione del tumore: Nel software Aimra, aprire il file TIFF che contiene l&#39;insieme di z-stack immagini. </li><li> Evidenziare il nome del file, selezionare e applicare la funzione Voltex per generare un rendering tridimensionale. Una grande immagine primaria del tumore con i più piccoli diversi gruppi dissociato invasiva (IG) di cellule collettivamente invaso è di solito evidente nell&#39;immagine di rendering (vedi Figura 6A). </li><li> Per selezionare la massa tumorale primaria, scegliere &quot;Open Data&quot;, poi &quot;etichettatura&quot;, allora &quot;Campo Label&quot;. </li><li> Della soglia del tumore primitivo-selezionare tutte le z-stack di immagini e scorrere le immagini nel piano z per garantire l&#39;integrazione della sola massa tumorale primaria entro tre dimensioni. Questo è in genere l&#39;immagine più grande imprese del settore e spesso appare segmentato come fotografato è attraversato attraverso il piano z. </li><li> Utilizzare la bacchetta magica / soglia funzione per correggere fluorescenza di fondo ed eliminare dall&#39;immagine senza scartare nessuna delle segnale tumore. Evidenziare il &quot;File Inside&quot; etichetta e fare clic sul pulsante ⊕. Selezionare la casella &quot;Tutte le sezioni&quot; check. Questo produce un bordo colorato intorno alla zona thresholded tumore primario in ogni z-stack incremento. </li><li> Per selezionare IG, scegliere la funzione &quot;Nuovo&quot;. Selezionare un singolo IG e assicurare che non è associato al tumore primario scorrendo il piano z. </li><li> Selezionare &quot;Tutte le sezioni&quot; e fare clic sul pulsante ⊕. Rinominare il file (es: IG 1) </li><li> Ripetere la procedura soglia di 7.4 e il passo evidenziando in 7,5 per il determinato IG. Selezionare un colore di contorno diverso il colore utilizzato per indicare la massa del tumore primario. </li><li> Ripetere se necessario per ogni ulteriore IG tutta l&#39;immagine, la scansione attraverso il piano z per garantire che tutti IG sono indicati. Utilizzando colori diversi per ciascuno identificato IG aiuta nella identificazione futura sull&#39;immagine. </li><li> Una volta che il tumore primario e tutti IG sono selezionati, selezionare &quot;Segmentazione&quot; dal menu a discesa, quindi selezionare &quot;Statistiche Materiale&quot;. Ciò fornisce la misura del volume e la X, Y e X nucleo tumorale coordinate per il tumore primario al fine di calcolare le distanze di IG dal punto centrale del tumore. </li><li> Con il volume calcolato, determinare la distanza di ogni IG dal nucleo centrale del tumore primario. Selezionare &quot;segmentazione&quot;, poi &quot;Statistiche Materiale&quot;. Questo passo calcola tutte le misure in pixel. Convertire i pixel micrometri in base alla calibrazione del microscopio obiettivo ed ogni aumento ulteriore ingrandimento (ad esempio, funzioni di zoom). Per il microscopio e le impostazioni utilizzate in questi esperimenti, l&#39;obiettivo 40X è stato utilizzato senza zoom, dando una calibrazione di 1 pixel = 0,298 micron. Importazione di dati in un foglio Excel, che dà i parametri per il tumore primario in tre dimensioni (X1, Y1, Z1) e per ogni IG (ex: X2, Y2, Z2 per la prima IG). </li><li> La distanza invaso in micron per ogni IG dal centro del tumore primario è calcolato usando la formula √ ((X1-X2) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2). </li><li> L&#39;indice di tumore invasivo (T I) viene calcolato utilizzando la formula T I = N T V x T x D T, dove N T = numero totale di IGS nell&#39;immagine, V T = il volume totale di tutte le IG, D T = distanza totale percorsa di tutti i gruppi invasiva dal centro del tumore primario. </li></ol> 8. Tre rendering tridimensionale con Nikon Software NIS-Elements <ol><li> Tre rendering tridimensionale con maggiore dettaglio topografico può essere generato da importare l&#39;originale a 16-bit dei file TIFF in bianco e nero dell&#39;immagine intero tumore nel NIS-Elements software Nikonpacchetto (Nikon, Melville, NY). Selezionare &quot;File&quot;, poi &quot;ND&quot;, quindi &quot;Crea file ND da sequenza File&quot;. Selezionare la serie Z serie di immagini TIFF e specificare la dimensione appropriata passo. </li><li> Calibrare il documento ND nel piano xy. Specificare la dimensione di un pixel con una calibrazione manuale. </li><li> Scegliere il &quot;View Volume&quot;. Utilizzare la funzione &quot;HQ&quot; per calcolare fette aggiuntive nel piano z per una maggiore qualità. Nella sezione &quot;Impostazioni 3D Renderer&quot;, utilizzare la &quot;Advanced Renderer&quot; con una qualità di &quot;Dettagli Ultra High&quot; e &quot;Risoluzione Full&quot;. Scegliere &quot;Alpha Blending&quot; per accentuare le superfici tumore. </li><li> Ottimizzare l&#39;immagine tridimensionale per la presentazione. Ingrandire il tumore e IG associati e delle colture, se necessario. Ruotare l&#39;immagine nei piani xyz e regolare la LUT. </li><li> Catturare l&#39;immagine per la presentazione. Selezionare &quot;Edit-Create View Snapshot (8 bit RGB)&quot;. Nome e salvare il file di conseguenza. </li></ol> 9. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema generale che illustra le fasi principali della produzione ortotopico tumore della lingua e in situ due immagini fotone. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Iniezione di LifeAct-mCherry OSC19 cellule che esprimono nella lingua del mouse. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 resezione del tumore che contengono la lingua del mouse preparato per due immagini fotone. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Orientamento di un tumore contenente lingua in posizione su un microscopio a due fotoni pronto per l&#39;imaging. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Rappresentante schermo girato da scanimage dimostrando grezzi di acquisizione dati del periodo iniziale di due fotoni immagine. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Analisi delle immagini e quantificazione di invasione tumorale in un tumore OSC19 ortotopico. Rappresentante immagini schermata di rendering Amira Voltex (A) e un singolo thresholded z-sezione (B) con il tumore primario primario delineato in viola, gruppo invasiva 1 (IG-1) delineate nel blu, IG-2 delineato in rosso e IG -3 delineate nel verde come un esempio della procedura di identificazione. Punte di freccia indicano IG in (A) e (B). Parcelle C. di volume rispetto invaso distanza per otto IG individuale utilizzato per calcolare l&#39;indice di invasione del tumore (Ti). <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Immagini rappresentative Figura 7. Dei tumori e invase da gruppi di tumore questo protocollo confronto con le immagini da un approccio tradizionale IHC. Paraffina sezione A. di una lingua topo intero asilo ad un tumore UMSCC1 ortotopico. La colorazione immunoistochimica è stata condotta utilizzando le procedure tradizionali con un anticorpo primario contro il HNSCC specifici marker delle cellule emmprin (Zymed; cat # 34-5600) alla diluizione 1:1000 e visualizzati utilizzando il OmniMap DAB anti-Rb rilevamento kit (Ventana cat # 760 -149), seguita dalla colorazione ematossilina di ferro. Immagini che comprende l&#39;area totale della lingua sono stati raccolti individualmente con ingrandimento 4x su un microscopio Olympus ZX70 Provis con una telecamera CCD MicroFire Optronics e ricostruita utilizzando il pacchetto di imaging StereoINvestigator (Bioscience MBF). Il tumore è evidente la punta della lingua. Una regione che mostra la parte anteriore allargata invasivo e singoli gruppi di cellule tumorali (punte di freccia) è mostrato in (B). C. Nikon NIS-Elements rendering di un tumore OSC19 rappresentante. Dettaglio contorno avanzata e visualizzazione chiara delle IG (punte di freccia) è evidente. Bar a tutte le immagini = 100 micron.

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Modelli murini ortotopico si sono dimostrati utili per studiare molti aspetti della testa e del collo 1,2. Abbiamo combinato un sistema ben stabilito ortotopico di SCOT 3 con immagini di microscopia a due fotoni di cellule mCherry-etichettato come un sistema per studiare gli eventi iniziali della testa e del collo, l&#39;invasione delle cellule tumorali. In questa procedura, abbiamo notato che le cellule possono fuoriuscire dal sito di iniezione del tumore, specialmente nei topi sei settimane o più giovani a causa delle dimensioni della lingua insufficiente. Noi usiamo topi più anziani per evitare questo problema. La dimensione lingua più grandi con i topi aiuta anche a evitare la rottura di una arteria linguale e le emorragie eccessive dalla lingua. Prendere tumore è notevolmente migliorata quando la lingua si gonfia notevolmente nel sito di iniezione iniziale. Questo attenua il gonfiore entro 1-2 ore, come il liquido iniettato viene assorbita. La crescita del tumore appare evidente 1-2 settimane dopo l&#39;iniezione con il numero indicato di cellule iniettate come un piccolo urto bianco sulla superficie della lingua. Notiamo anche che l&#39;obiettivo a 40X utilizzati nei nostri studi qui presentati, non possiamo distinguere le cellule tumorali individuale, ma si identificano IG come gruppi di cellule invasive che ricapitolano la modalità tipica di invasione HNSCC. Ad oggi questo modello è stato ampiamente utilizzato per testare il ruolo di molecole specifiche così come molti farmaci antitumorali sulla crescita SCOT un&#39;invasione, con efficacia misurato con metastasi linfonodali cervicali determinati con IHC o bioluminescenti 4-7. Tumori formati in questo manifesto sistema vicino alla superficie della lingua (Figura 7), che consente l&#39;applicazione della microscopia a due fotoni ai tumori intera immagine in situ, come invasiva multicellulari cluster. La procedura può anche essere utilizzato per visualizzare l&#39;invasione tumorale con risoluzione cellulare. Microscopia a due fotoni è stato precedentemente utilizzato per studiare trattamenti sperimentali per la testa e del collo in 8,9 ortotopica e xenotrapianto 8,10 modelli. Tuttavia, ci sono due differenze sostanziali tra queste relazioni e il nostro protocollo. In primo luogo, questi studi utilizzare le etichette extracellulare per target / identificare le cellule tumorali della testa e del collo, possibilmente limitando il rilevamento solo alle cellule tumorali con ampio accesso alla circolazione. In secondo luogo, l&#39;invasione delle cellule tumorali nei pressi del sito principale che racchiude in sintesi l&#39;attività probabilmente all&#39;inizio del metastatico non è stato valutato come un parametro sperimentale. Il nostro protocollo prevede la possibilità di quantificare direttamente l&#39;invasione delle cellule tumorali in qualsiasi momento durante la progressione del tumore in lingue mouse. Mentre il metodo descritto qui descrive la procedura con lingue sezionato, siamo attualmente in fase di adattare questo metodo per invasione immagine del tumore nei topi dal vivo per l&#39;uso in combinazione con bioluminescenza di monitorare contemporaneamente l&#39;invasione iniziale, locali di coinvolgimento dei linfonodi e metastasi a distanza nel stesso animale. Modifiche al protocollo di imaging in vivo richiede la progettazione di un adeguato livello per il posizionamento e il mantenimento di topi durante l&#39;imaging, così come un pratico sistema per irrigare adeguatamente la cavità orale di topi anestetizzati durante la procedura di imaging. Una volta ottimizzato, questi adattamenti offrirà la possibilità di studiare il ruolo di potenziali molecole pro-invasiva e invasiva di composti anti-test su invasione locale e più distante coinvolgimento metastatico in animali per periodi di tempo prolungati.

multi-photon imaging of tumor cell invasion in an orthotopic mouse model of oral squamous cell carcinoma

Loco-regionale invasione della testa e del collo è legato al rischio di metastasi e presenta una sfida difficile nella progettazione e attuazione delle strategie di gestione del paziente. Ortotopico modelli murini di cancro orale sono state sviluppate per facilitare lo studio dei fattori di impatto che l&#39;invasione e fungere da sistema modello per la valutazione delle terapie anti-tumorali. In questi sistemi, la visualizzazione di cellule tumorali disseminate all&#39;interno dei tessuti del cavo orale è stato generalmente effettuato da istologia convenzionale o con metodi in vivo bioluminescenti. Un inconveniente principale di queste tecniche è l&#39;incapacità intrinseca di visualizzare e quantificare con precisione presto l&#39;invasione delle cellule tumorali che derivano dal sito primario in tre dimensioni. Qui si descrive un protocollo che combina un modello stabilito per il carcinoma a cellule squamose della lingua (SCOT) con immagini a due fotoni per consentire la visualizzazione multi-vettoriale di diffusione del tumore linguale. La OSC-19 testa e collo, tumori linea cellulare è stata stabilmente progettato per esprimere la F-actina LifeAct legame peptidico fuso con la proteina fluorescente mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1 nu / nu topi iniettati con queste cellule affidabile formare tumori che permettono la lingua per essere visualizzate da ex-vivo applicazione della microscopia a due fotoni. Questa tecnica permette di visualizzare ortotopico della massa tumorale e localmente invadere le cellule in lingue asportato senza interruzioni del microambiente tumorale regionale. Inoltre, questo sistema consente la quantificazione di invasione delle cellule tumorali dal calcolo delle distanze che muovono le cellule invase dal sito primario del tumore. Nel complesso questa procedura prevede un sistema potenziato modello per l&#39;analisi dei fattori che contribuiscono all&#39;invasione SCOT e trattamenti terapeutici su misura per prevenire l&#39;invasione locale ea distanza diffusione metastatica. Questo metodo ha anche il potenziale per essere in ultima analisi, in combinazione con altre modalità di imaging in un ambiente nel vivo.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Una panoramica completa delle tecniche coinvolte nella generazione di un modello murino di cancro orale e monitoraggio quantitativo di invasione tumorale all&#39;interno della lingua attraverso multi-fotone microscopia di cellule marcate è presentato. Questo sistema può essere utilizzato come piattaforma utile per la valutazione molecolare e di efficacia dei farmaci anti-invasiva composti.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

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Research

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Medicine

18.9K Views.  Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University. Una panoramica completa delle tecniche coinvolte nella generazione di un modello murino di cancro orale e monitoraggio quantitativo di invasione tumorale all'interno della lingua attraverso multi-fotone microscopia di cellule marcate è presentato. Questo sistema può essere utilizzato come piattaforma utile per la valutazione molecolare e di efficacia dei farmaci anti-invasiva composti.

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An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modello ortotopico di cancro alla vescica Murine

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

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Medicina

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

La radioterapia combinata in un modello di tumore ortotopico cervello di topo

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modellazione e imaging 3-Dimensional Invasion cella Collettiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modello ortotopico tumore della vescica e la valutazione del trattamento intravescicale sarna

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modello di mouse ortotopico di anaplastico della tiroide Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection of E6/E7 mRNA by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) requires RNA extraction which destroys the tumor tissue context critical for morphological correlation and has been difficult to be adopted in routine clinical practice. Our recently developed RNA in situ hybridization technology, RNAscope, permits direct visualization of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue with single molecule sensitivity and single cell resolution, which enables highly sensitive and specific in situ analysis of any RNA biomarker in routine clinical specimens. The RNAscope HPV assay was designed to detect the E6/E7 mRNA of seven high-risk HPV genotypes (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) using a pool of genotype-specific probes. It has demonstrated excellent sensitivity and specificity against the current &#39;gold standard&#39; method of detecting E6/E7 mRNA by qRT-PCR. HPV status determined by RNAscope is strongly prognostic of clinical outcome in oropharyngeal cancer patients.

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The presence of high-risk HPV in head and neck tumor tissue is associated with favorable outcomes. The recently developed RNA in situ hybridization technique called RNAscope allows direct visualization of HPV E6/E7 mRNA in FFPE tissue sections.

RNAscope per<em&gt; In situ</em&gt; Rilevamento di trascrizionale attivo Papillomavirus Umano in Cervico Carcinoma a cellule squamose

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Contrasto dinamico migliorato risonanza magnetica di un modello ortotopico cancro del pancreas mouse

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

A &quot;paziente-Like&quot; ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...