This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates - Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates - Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.

NOTA: Gli animali utilizzati in questa procedura sono stati accuditi in conformità con il Consiglio canadese Animal Care (CCAC) le linee guida. Etica sono stati approvati dal Comitato dell&#39;Università di Calgary Animal Care. 1. Preparare una siringa per iniettare <ol><li> Sciogliere Lysolecithin a una soluzione all&#39;1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH 7,4) e conservare a -20 ° C in piccole aliquote (75 microlitri). Scongelare una fiala di RT. NOTA: se lisolecitina è disciolto, sonicare il tubo in ultrasuoni (40 kHz) per circa 30 minuti per formare una soluzione uniforme. </li><li> Maneggiare il capillare di vetro pre-tirato con estrema cautela per evitare di danneggiare la punta delicata. Svitare il dado di una siringa da 10 microlitri iniezione e infilarlo sull&#39;estremità piatta del capillare seguito da 2 ghiere, assicurando che le estremità di accoppiamento dei puntali allineano e il capillare è aderente nella boccola conica (figura 1). Sciacquare la siringa con isopropalcool ile e rimuovere il pistone. Una volta asciutto, avvitare il gruppo ago mano stretta sulla siringa iniezione. </li><li> Applicare l&#39;ago hub metallo siringa di attivazione. Pierce un disco di gomma con l&#39;ago e farlo scorrere fino alla base. Riempire la siringa di attivazione con lisolecitina. Deprimere delicatamente la siringa di attivazione fino a quando il liquido è visibile sulla punta dell&#39;ago. Questo assicura bolle d&#39;aria non saranno introdotti nella siringa iniezione. </li><li> Inserire l&#39;ago hub metallo della siringa di attivazione nella siringa iniezione. Fare una tenuta ferma con il disco di gomma, lentamente deprimere la siringa adescamento fino a quando il capillare si riempie per la punta con la soluzione. Rimuovere accuratamente la siringa di attivazione premendo contemporaneamente per riempire il cilindro della siringa iniettare senza introdurre bolle d&#39;aria. Inserire lo stantuffo nella siringa iniezione e garantire soluzione fluisce dalla punta del capillare come lo stantuffo viene premuto delicatamente. NOTA: Se le bolle d&#39;aria sono visibili nel tappoIllary o iniettando siringa, la preparazione siringa deve essere ripetuta dall&#39;inizio. Fluido continuo nell&#39;apparato iniezione è fondamentale per garantire volumi di iniezione accurati. </li><li> Attaccare la siringa iniettare completato al braccio di un micromanipolatore stereotassica. Questo apparato completato sarà in grado di iniettare 15-20 animali prima di dover essere ricaricata. </li><li> Eliminare il lisolecitina rimanente dalla siringa di attivazione. Ritirare e deprimere alcool isopropilico più volte, e staccare l&#39;ago hub di metallo. Attendere alcune ore per l&#39;alcool isopropilico rimanga nella siringa priming evapori prima di riempire di nuovo. </li></ol> 2. Preparare animali per la procedura chirurgica NOTA: Questa procedura è descritta per femmine C57BL / 6 topi, di età compresa tra 8-10 settimane. <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) o per la cura degli animali regolamenti istituzionali. Piano per ilanimale ad essere sotto anestesia per circa 1 ora se si utilizza l&#39;anestesia iniettabile. </li><li> Prova che l&#39;animale è profondamente anestetizzato con fermezza pizzicare il piede. Un animale adeguatamente anestetizzato non risponderà al pizzico. </li><li> Utilizzando Clippers, radere un cm 2 zona 2-3 sul lato dorsale dell&#39;animale, vicino alle orecchie. Fare attenzione a non danneggiare le orecchie. </li><li> Pulire la zona pulita con il 70% di etanolo applicato ad un tampone di garza. Assicurarsi che tutti i capelli tagliati è stato rimosso dalla zona. Disinfettare la zona con iodio. </li><li> Applicare vaselina per gli occhi contro l&#39;essiccamento durante tutta la procedura. </li><li> Mantenere l&#39;animale in una camera di recupero riscaldata fino al momento di iniziare la procedura. </li></ol> 3. Eseguire l&#39;intervento chirurgico NOTA: Assicurare un&#39;adeguata tecnica asettica per tutte le fasi della procedura. Ciò include l&#39;uso corretto dei guanti, retine per capelli, maschere e tende. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati prima di venire in Contact con l&#39;animale. <ol><li> Spostare l&#39;animale ad un telaio stereotassico, lato dorsale up, elevata a metà sezione per asciugamani di carta piegati esagerare la curvatura della colonna vertebrale. Fissare le braccia e la coda con nastro adesivo chirurgico e fissare la testa con un morsetto dente. Barre stabilizzatrici orecchio non sono necessari per questa procedura. </li><li> Utilizzare un bisturi per fare un tre centimetri incisione mediana, iniziando appena sotto le orecchie e taglio in direzione caudale. </li><li> Individuare il divario tra le 2 grandi strutture adipose e utilizzare una pinza sottile in ogni mano per tirare questi pezzi. Stendere divaricatori per aprire il campo operatorio. </li><li> Sotto un microscopio operatorio, individuare il processo conseguenza di spicco della vertebra T2 (Nota: questa funzione è caratteristica del ceppo C57BL / 6 del mouse). Eseguire una dissezione smussa con forbici primavera chiusi attraverso la muscolatura sovrapposizione per visualizzare meglio T2. Utilizzando le pinze, sentire per le superfici dure di T3 e T4 per confermare il corretto posizione anatomica. </li><li> Utilizzando forbici primavera, tagli laterali poco profonde (2-3 mm di profondità) del tessuto connettivo tra T3 e T4. Grazie alla distanza naturale tra vertebre nella parte toracica superiore della colonna vertebrale del mouse, una laminectomia non è necessario rivelare il midollo spinale. Essere consapevoli che troppo profondo un taglio trafiggerà e danneggiare il cavo. NOTA: Una piccolo grado di sanguinamento è comune durante questa fase. In questo caso, tenere una lancia spugna nella zona fino a quando i sussidi sanguinamento (30-60 sec). </li><li> Visualizza il midollo spinale. Sarà coperto con uno spesso strato di dura visibile se questo strato meningea non è stato ancora tagliato, esponendo il cavo. Un vaso di sangue di primo piano corre caudale / rostrale attraverso la linea mediana approssimativa del midollo spinale. NOTA: Questo vascolare non deve essere utilizzato come punto di riferimento per la linea mediana. Invece, illuminazione adeguata dovrebbe rivelare i limiti della materia grigio-bianco che fiancheggiano colonna dorsale, e questi dovrebbero essere usati per stimare la linea mediana. </li><li> Se la durarimane intatto, fare graffi laterali dolci con un ago di metallo G 32 fino a quando non viene cancellato. L&#39;obiettivo è quello di rimuovere la dura, mentre non tagliare le meningi sottostanti rimanenti, che non sono così spesse e più difficile da vedere. NOTA: Rilascio di liquido cerebrospinale indica una violazione del arachnoid e mentre questo può avvenire senza danni meccanici al tessuto, liquido cerebrospinale accumulato deve essere rimosso con una lancia spugna per visualizzare meglio la superficie del cavo. </li><li> Spostare la siringa per iniezione in posizione e abbassare lentamente fino alla punta del capillare appena tocca appena il midollo spinale immediatamente laterale di entrambi i lati della linea mediana. Bloccare il braccio in posizione. </li><li> Utilizzare le misure graduate del braccio stereotassica direzione Z per fare una misura della posizione della linea di base. Da questa lettura, sottrarre 1,3 millimetri. Con un movimento rapido e superficiale verso il basso per perforare il tessuto e abbassare accuratamente il capillare fino al raggiungimento della nuova misurazione. Opzionale: se lo si desidera,lesioni della colonna dorsale possono essere prodotti dallo stesso movimento foratura sulla linea mediana e una profondità di 0,3 mm (vedi la discussione per ulteriori informazioni). NOTA: Questi valori sono specifici per l&#39;iniezione tra T3 e T4. Se optando per eseguire l&#39;iniezione in qualsiasi altro luogo nel midollo spinale, questi valori devono essere derivati ​​da qualsiasi atlante del cervello del mouse disponibili. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per deprimere lisolecitina nella sostanza bianca del midollo spinale ventrale. Effettuare 1 rotazione del micromanipolatore ogni 5 secondi per 2 minuti, risultando in un volume finale di 0,5 ml. Lasciare il capillare sul posto per 2 minuti supplementari per impedire il riflusso di soluzione, e poi rimuovere con attenzione il capillare. </li><li> Legare un singolo sutura nel tessuto muscolare / adiposo sovrapponendo la colonna vertebrale. Utilizzare una sutura non interrotta per chiudere la pelle. Applicare più di iodio al sito di incisione. </li><li> Posto l&#39;animale in una camera di recupero Scaldare fino recupera, per poi tornare alla sua gabbia. Applicare analgesici post-operativamente secondo le norme per la cura degli animali istituzionali. Ulteriori cure post-operatorie di solito non è necessaria in quanto gli animali sono completamente ambulatoriale e in grado di auto-alimentazione e il bere non appena il recupero dall&#39;anestesia. </li><li> Ripetere la procedura per gli altri animali. NOTA: Con competenza, l&#39;operazione può essere completato in 10-15 min per animale, in particolare con l&#39;aiuto di una seconda persona legatura suture. Lo stesso capillare di vetro può essere utilizzato per circa 15-20 ambulatori prima della punta diventa smussata e deve essere sostituito. Ambulatori di controllo possono essere eseguite in modo identico come descritto, con una iniezione di PBS nel midollo spinale anziché lisolecitina. Si sconsiglia la pulizia dei capillari per un uso futuro. </li></ol> 4. Tissue Processing and Analysis <ol><li> Sacrificio degli animali con una overdose intraperitoneale di ketamina (500 mg / kg) e xilazina (25 mg / kg) in punti di tempo desiderati. Le lesioni di solito si evolvono nel follmaniera causa: 1-3 giorni, demielinizzazione attiva; 3-7 giorni, OPC reclutamento; 7-10 giorni, la differenziazione degli oligodendrociti; 10-21 giorni, rimielinizzazione attiva 2,10,11. </li><li> Per preparare il tessuto per l&#39;esame istologico, prima eseguire una perfusione transcardial 12 con 20 ml di RT PBS seguita da 20 ml ghiacciata 4% paraformaldeide in PBS. Per la preparazione di resina tessuto embedded per sezionamento semi o ultrasottili, vedere il punto 4.9. </li><li> Rimuovere il midollo spinale con le forbici osso curve per tagliare attraverso ogni vertebre partire dalla fine cervicale della colonna vertebrale e lavorando al livello toracica inferiore. Fissare i midolli spinali O / N a 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C. Passare i cavi al 30% di saccarosio in PBS a 4 ° C per almeno 72 ore. </li><li> Identificare il sito di iniezione come una anomalia sulla superficie dorsale del midollo spinale. Tagliare un pezzo 3 millimetri di tessuto (con il sito di iniezione al centro) e allineare i pezzi in cryomolds contenenti temperatura ottimale di taglio (OCT) compound. Sospendere parte inferiore delle cryomolds in una miscela raffreddata di 2-metilbutano e ghiaccio secco fino PTOM è completamente congelato. Conservare a -80 ° C fino al momento di sezione. </li><li> Sezione midollo spinale su un criostato ad una larghezza di 20 micron su vetrini da microscopio e lasciare asciugare O / N prima di riporre i vetrini a -20 ° C. </li><li> Rileva posizione della lesione e le dimensioni utilizzando un eriocromo cianinico macchia istologica della mielina 13. Eseguire tutti i passaggi a RT. Diapositive asciugare per 30 min. Collocare i vetrini in agente per 1 min seguito da reidratazione in soluzioni graduate etanolo (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, acqua) compensazione per 1 min ciascuna. <ol><li> Collocare i vetrini in eriocromo soluzione Cyanine per 15 minuti, seguita da un 1 min di lavaggio con acqua. Differenziare in idrossido di ammonio 0,5% per 10 sec, seguito da un 1 min lavata con acqua. Disidratare in soluzioni di etanolo graduate (ordine inverso come descritto sopra) per 1 min ciascuna, coprioggetto con mezzo di montaggio, e l&#39;immagine su un luminoso mi-campocroscope. </li></ol></li><li> Utilizzare immunoistochimica per visualizzare assoni e mielina. Diapositive asciugare per 30 min. Disidratare con etanolo graduata (acqua, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) per 2 min a ciascuna RT, allora ordine inverso nuovo in acqua. Questo passaggio si traduce in una maggiore risoluzione dei singoli anelli mielina 14. <ol><li> Bloccare interazioni anticorpo non-specifici utilizzando siero di capra 10% e lo 0,25% triton X-100 in PBS per 60 minuti a RT. Diluire gli anticorpi primari (topo anti-SMI312 1: 2.000, coniglio anti-MBP 1: 1.000) in PBS e incubare su vetrini O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare 5 volte per 5 min con PBS a RT. Diluire anticorpi secondari (Alexa 488 anti-coniglio 1: 500, Alexa 546 anti-topo 1: 500) in PBS e incubare su vetrini per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare 5 volte per 5 min con PBS a RT. Montare i vetrini con copri-oggetto usando gelvatol e immagine su un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li><li> Utilizzare immunoistochimica per visualizzare cellule della linea oligodendrociti. Seguire la procedura per step 4.7, omettendo la fase di disidratazione / reidratazione, e l&#39;utilizzo di siero di cavallo del 10% invece del siero di capra. Utilizzare i seguenti diluizioni di anticorpi primari: capra anti-PDGFRα 1: 100, mouse anti-CC1 1: 200, coniglio anti-Olig2 1: 200. Utilizzare i seguenti diluizioni degli anticorpi secondari: Alexa 488 anti-capra 1: 500, Alexa 594 anti-topo 1: 500, Alexa 647 anti-coniglio 1: 500. </li><li> Per preparare il tessuto per sezionamento parzialmente o ultrasottile, prima eseguire una perfusione transcardial 12 con 20 ml RT PBS seguiti da 20 ml ghiacciata 4% paraformaldeide / 1% glutaraldeide in PBS. Rimuovere midollo spinale come descritto al punto 4.3. Fix O / N a 4% paraformaldeide / 1% glutaraldeide in PBS a 4 ° C. </li><li> Identificare il sito di iniezione come descritto al punto 4.4. Tagliare un pezzo 1 millimetro di tessuto che contiene il sito di iniezione. Ulteriori 1 millimetro blocchi su entrambi i lati della lesione possono essere preparati e se desiderato. </li><li> In una cappa aspirante, aggiungere 10 volte il volume 1% tetrossido di osmio / ferrocianuro di potassio 1,5% per ogni blocco su ghiaccioper 60 min. NOTA: tetrossido di osmio è una sostanza altamente tossica e deve essere maneggiato con estrema cura. Tutti i materiali a contatto con tetrossido di osmio siano messi in olio di mais (due volte il volume come soluzione di osmio tetrossido) per la neutralizzazione. </li><li> Lavare cavi 3 volte con 0,2 M cacodilato per 10 minuti a RT, scartando in olio di mais. Disidratare con etanolo soluzioni graduate (acqua, 50%, 70%, 90%, 2 volte con 95%, 2 volte con 100%, 2 volte con ossido di propilene) per 10 minuti a RT. </li><li> Cavi Incorpora in resina come da istruzioni del produttore. </li><li> Tagliare i blocchi su un ultramicrotomo e montare le sezioni sul gocce d&#39;acqua su vetrini da microscopio. Collocare i vetrini su una piastra calda (circa 50 ° C) fino a secco. </li><li> Visualizza mielina aggiungendo qualche goccia di 1% blu di toluidina soluzione di borace / 2% sui vetrini per 10-15 secondi a 50 ° C. Risciacquare con acqua, secchi, e coprioggetto con supporti di montaggio. Sezioni di immagine su un microscopio in campo chiaro. </li></ol>

<ol>
	<li>Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+in+the+spinal+cord+of+the+cat+following+intraspinal+injections+of+lysolecithin.">Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin.</a> J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).</li><li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+mouse+spinal+cord+axons+demyelinated+by+local+injection+of+lysolecithin.">Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin.</a> J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).</li><li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Schwann-cells+into+the+spinal-cord+of+rat+following+local+injections+of+lysolecithin.">Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).</li><li>Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+occurs+as+extensively+but+more+slowly+in+old+rats+compared+to+young+rats+following+gliotoxin-induced+CNS+demyelination.">Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination.</a> Glia. 28 (1), 77-83 (1999).</li><li>Patrikios, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+is+extensive+in+a+subset+of+multiple+sclerosis+patients.">Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).</li><li>Keough, M. B., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+therapy+for+multiple+sclerosis).">Remyelination therapy for multiple sclerosis).</a> Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).</li><li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+injections+of+lysophosphatidyl+choline+into+white+matter+of+the+adult+mouse+spinal+cord.">The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord.</a> J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).</li><li>Miron, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+microglia+and+macrophages+drive+oligodendrocyte+differentiation+during+CNS+remyelination.">M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.</a> Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).</li><li>Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+impairs+oligodendrocyte+remyelination+following+lysolecithin-induced+demyelination.">Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination.</a> Glia. 35 (3), 202-212 (2001).</li><li>Lau, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycans+in+demyelinated+lesions+impair+remyelination.">Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination.</a> Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).</li><li>Fancy, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+Wnt+pathway+inhibits+timely+myelination+and+remyelination+in+the+mammalian+CNS.">Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS.</a> Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li><li>Skihar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+oligodendrogenesis+and+myelin+repair+using+the+multiple+sclerosis+medication+glatiramer+acetate.">Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).</li><li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor-responsive+neural+precursors+give+rise+to+myelinating+oligodendrocytes+after+transplantation+into+the+spinal+cords+of+contused+rats+and+dysmyelinated+mice.">Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice.</a> Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).</li><li>Chong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+inhibitor+Nogo-A+establishes+spatial+segregation+and+extent+of+oligodendrocyte+myelination.">Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).</li><li>Sturrock, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+mouse+corpus+callosum.">Myelination of the mouse corpus callosum.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).</li><li>Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+dynamics+in+the+healthy+adult+CNS:+evidence+for+myelin+remodeling.">Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling.</a> Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).</li><li>Woodruff, R. H., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+and+remyelination+of+the+caudal+cerebellar+peduncle+of+adult+rats+following+stereotaxic+injections+of+lysolecithin,+ethidium+bromide,+and+complement/anti-galactocerebroside:+a+comparative+study.">Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study.</a> Glia. 25 (3), 216-228 (1999).</li><li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropillar+assays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis.">Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li><li>Powers, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+reporter+reveals+prolonged+refinement+of+spontaneously+regenerated+myelin.">Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).</li><li>Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+remyelination+restores+secure+conduction.">Central remyelination restores secure conduction.</a> Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).</li><li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+deficits+induced+by+experimental+spinal+cord+demyelination+are+abolished+by+spontaneous+remyelination.">Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination.</a> Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).</li><li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery.">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un certo numero di modelli animali è stato sviluppato per studiare MS, più riconoscibile l&#39;encefalomielite autoimmune (EAE) modello sperimentale. In EAE, roditori sono immunizzati contro un frammento di un peptide mielina e subiscono lo sviluppo della lesione infiammatoria che si manifesta in paralisi ascendente. Anche questo modello è stato utile per i test pre-clinici di farmaci immunomodulatori SM, non è l&#39;ideale per studiare la rimielinizzazione per tre ragioni principali: in primo luogo, la posizione delle lesioni infiammatorie è un po &#39;casuale, e la localizzazione di lesioni in caso di trattamento di tessuto per semi o ultrasottili sezioni possono essere impegnativo. La seconda è che remyelination si verifica in un corso di tempo specifico, e l&#39;età esatta di una singola lesione EAE non può essere conosciuto senza continuo non invasivo risonanza magnetica. La terza è che remyelination è un fenomeno naturale nei roditori, e la prova di remyelination seguente trattamento farmacologico in EAE non può essere un risultato primaria del farmaco, ma inSTEAD un fenomeno secondario di ridurre l&#39;infiammazione. Un altro metodo comune per produrre demielinizzazione è ottenuta introducendo il chelante cuprizone rame nella dieta. Ciò si traduce in diffusa demielinizzazione, soprattutto nel corpo calloso. Ci sono limitazioni nello studio del corpo calloso come sito di rimielinizzazione per i seguenti motivi: in primo luogo, i diametri e spessori (assoni quindi mielina) sono più piccoli rispetto ad altre regioni del SNC, e guaine quindi sottilmente remyelinated possono essere indistinguibili da quelli che non sono mai stati demyelinated. In secondo luogo, perché il corpo calloso del mouse corpus contiene&gt; 70% assoni amieliniche 16, può essere chiaro se un segmento remyelinated vale la riparazione della mielina danneggiata o de novo sintesi della mielina nel adulta, che si verifica normalmente 17. E &#39;nostra convinzione che il miglior modello per studiare la rimielinizzazione è l&#39;iniezione diretta di tossine, sia lisolecitina, ethidbromuro di ium, o altri, nei peduncoli cerebrali caudali 18 o la sostanza bianca del midollo spinale. La prima posizione è raggiunta solo precisa iniezione stereotassica 3-dimensioni, ed è limitata a grandi roditori (ratti) a causa delle piccole dimensioni dei peduncoli cerebellari. Ciò esclude la vasta risorsa di topi transgenici in studio de- e rimielinizzazione. Il midollo spinale, tuttavia, contiene molte grandi tratti di sostanza bianca che sono facilmente accessibili chirurgicamente. Gli spazi tra vertebre nel segmento toracico rostrale permette di esposizione del midollo spinale, senza la necessità di una laminectomia, che è un passo necessario in procedure chirurgiche toraciche caudale. Un vantaggio del destinatario principale la sostanza bianca ventrale è che gli assoni sono uniformemente più grande della sostanza bianca dorsale, rendendo la quantificazione di rimielinizzazione un compito simile alle sfide connesse con il corpo calloso meno ambigua. Inoltre, la sostanza bianca ventrale costituisce una t molto più grandeArget zona per iniettare; diverse centinaia di micron lateralmente nella regione dorsale sarebbero collocare il capillare all&#39;esterno della colonna, mentre la stessa deviazione ventrale sarebbe ancora produrre una lesione demielinizzante prominente. Alcuni protocolli iniettare lisolecitina sia nel dorsali e ventrali colonne dello stesso animale 19. Ciò può aumentare sia la probabilità di corretto posizionamento capillare e il numero di lesioni quantificabili in meno animali. Mentre i dati attuali sono presentati 8-10 settimane di età degli animali al momento del funzionamento, abbiamo anche avuto successo con la stessa procedura su 8-10 mesi di età i topi, in cui la rimielinizzazione è descritto come notevolmente più lento 4. La quantificazione di rimielinizzazione non è un&#39;impresa banale. Un dogma centrale postula che segmenti remyelinated sono più brevi di lunghezza e più sottile, in media, rispetto ai loro omologhi sani, e quindi i calcoli g-ratio (diametro assone diviso per assone + diametro mielina) di sezione trasversale semi osezioni r ultrasottili sono diventati procedura standard. Tuttavia, è noto che i segmenti remyelinated addensare nel tempo 2 e un recente studio utilizzando un reporter transgenico di oligodendrociti rimielinizzanti suggerisce che molti internodi fine diventano indistinguibili dal controllo 20. Quantificare il numero di oligodendrociti maturi all&#39;interno della lesione è un modo indiretto per misurare la riparazione, come oligodendrociti sono in grado di effettuare un ampio numero di internodi, e una percentuale significativa di-remyelination seconda del modello utilizzato, può verificarsi da cellule di Schwann 3. Naturalmente, come rimielinizzazione è stata collegata al ripristino della conduzione saltatory 21, la metrica finale di riparazione sarebbe il recupero funzionale dei deficit neurologici. Mentre rimielinizzazione è stata collegata al recupero della funzione in alcune specie 22,23, non è diventata una procedura standard in studi Lysolecithin murini. Ciò è probabilmente dovuto ad una mancanza di osservati palesedeficit in grado di lesioni o dorsali o ventrali, rispetto ai modelli demielinizzazione più robusti, come EAE e anche cuprizone. Noi crediamo che i deficit funzionali derivanti da Lysolecithin iniezione, e il successivo recupero di rimielinizzazione, saranno solo osservabile utilizzando test sensibili di finissima funzionamento sensomotoria. Una ricerca PubMed di &quot;rimielinizzazione&quot; a fianco uno dei modelli animali di cui sopra, anche se un approccio metodologico brusco, mostra un minor numero di colpi di ricerca per Lysolecithin (109) rispetto al EAE (188) e cuprizone (197). Se la nostra tesi che Lysolecithin demielinizzazione è l&#39;approccio superiore per studiare rimielinizzazione, perché è il meno discusso? Forse un timore per utilizzare questo metodo deriva da una credenza di difficoltà tecnica nello svolgimento dell&#39;operazione chirurgica. In realtà, questa procedura è veloce e conveniente, e non è più difficile di dissezione dei tessuti di routine, che richiedono materiali che sono tutti commercialmente disponibili. La nostra speranza è che questo protocollo si rivela utile per coloro che desiderano aggiungere questo potente modello per il loro repertorio per studiare il campo interessante e in espansione di riparazione della mielina.

La sclerosi multipla (SM) è una malattia demielinizzante cronica del sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da infiltrazione di cellule immunitarie e placche contenenti perso mielina, oligodendrociti e neuroni, gli assoni. La maggior parte dei pazienti hanno un decorso della malattia consiste di ricadute infiammatorie accompagnati da una vasta gamma di sintomi neurologici, seguiti da periodi di remissione. Oltre la metà di questi pazienti eventualmente passare a una fase progressiva secondaria con ricadute evidenti ma continuo declino neurologico. Si ritiene che questo progressivo deterioramento è causa di danni assonale e perdite, contribuito in parte da demielinizzazione cronica. Strategie per ripristinare perso mielina sono quindi considerati un approccio terapeutico promettente per ritardare la progressione della malattia e forse invertire sintomi neurologici. Rimielinizzazione è una risposta di riparazione endogena nel sistema nervoso centrale in cui le nuove guaine di mielina sono generate da cellule precursori degli oligodendrociti reclutate(OPC) che si differenziano in oligodendrociti-mielina. Rimielinizzazione è stato dimostrato in modelli animali di essere abbastanza robusto 1-3, però, la sua efficacia diminuisce con 4 anni. Infatti, remyelination si verifica negli esseri umani, anche se è incompleta nella maggior parte dei pazienti con SM 5. Tutti i farmaci attualmente disponibili per la SM si rivolge principalmente la componente immunitaria anomala della malattia e, mentre efficaci nel ridurre le ricadute, non marcatamente ritardare la progressione della malattia. La prossima generazione di strategie terapeutiche per la gestione della SM integrerà progressi nella immunomodulazione con la valorizzazione di rimielinizzazione endogena, al fine di evitare che sia ricadute e la progressione 6. Un metodo per studiare de- e remyelination nel SNC comporta l&#39;iniezione diretta del lisofosfatidilcolina detergente (lisolecitina) nel midollo spinale sostanza bianca 1,3,7. Questa procedura produce un demyelinat ben caratterizzatoing lesioni costituito principalmente da macrofagi / microglia infiltrazione e l&#39;attivazione 8,9, astrogliosi reattiva, perturbazione dell&#39;omeostasi assonale / danno assonale, e OPC proliferazione e la migrazione 10. La lesione evolve prevedibilmente nel corso del periodo di alcune settimane ed è finalmente in grado di completamente rimielinizzanti. Questo metodo è stato particolarmente utile per studiare la coreografia degli eventi coinvolti nella de- e rimielinizzazione. Inoltre, è stato adottato come strumento di test pre-clinica di terapie candidati per accelerare riparazione dopo un insulto demielinizzante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:239px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">retractor</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">17003-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">clippers</td>
			<td style="width:199px;">Philips</td>
			<td style="width:163px;">QG3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heating recovery chamber</td>
			<td style="width:199px;">Peco Services</td>
			<td style="width:163px;">V1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">surgical tape</td>
			<td style="width:199px;">3M</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel blade</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td>No. 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sponge spear</td>
			<td style="width:199px;">Beaver Visitec</td>
			<td>581089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 Vicryl sutures</td>
			<td style="width:199px;">Ethicon</td>
			<td>J511G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">curved ToughCut spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15123-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32 gauge metal needle</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">needle holders</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">angled forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:199px;">Puritan</td>
			<td style="width:163px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze pads</td>
			<td style="width:199px;">Safe Cross First Aid</td>
			<td style="width:163px;">3763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 &#956;L syringe</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">7635-01</td>
			<td style="width:239px;">make sure to purchase the microliter, not gastight syringe</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">compression fitting</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">55750-01</td>
			<td style="width:239px;">contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 &#956;L syringe is a tighter fit</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">priming kit</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">PRMKIT</td>
			<td style="width:239px;">contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pre-pulled glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">WPI</td>
			<td style="width:163px;">TIP10TW1 (pack of 10)</td>
			<td style="width:239px;">contains capillaries with 10 &#956;m inner diameter. 30 &#956;m inner diameter also work (TIP30TW1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereotactic frame</td>
			<td style="width:199px;">David Kopf instruments</td>
			<td style="width:163px;">Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Tissue-Tek intermediate cryomold</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bright field microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultramicrotome</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysophosphatidylchoine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">L1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methylbutane</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-SMI312 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Covance</td>
			<td style="width:163px;">SMI-312R</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-MBP antibody</td>
			<td style="width:199px;">Abcam</td>
			<td style="width:163px;">AB40390</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-PDGFR&#945; antibody</td>
			<td style="width:199px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:163px;">AF1062</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-Olig2 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:163px;">AB9610</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-CC1 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:163px;">OP80</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11003</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">705-546-147</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">715-586-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">711-606-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ketamine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">xylazine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iodine</td>
			<td>West Penetone</td>
			<td>2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vaseline petroleum jelly</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA05971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III) chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acrytol</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3801700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrisolv</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">osmum tetroxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cacodylic acid</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">propylene oxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>20401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMBED kit</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eriochrome cyanine solution</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">0.8 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">400 mL 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III)chloride</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">20 mL 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">80 mL</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year.</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelvatol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>140 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>40 g</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">*mix well, place at&#160; 37 &#176;C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental demyelination and remyelination of murine spinal cord by focal injection of lysolecithin

La sclerosi multipla è una malattia infiammatoria demielinizzante del sistema nervoso centrale caratterizzata dalla formazione di placche contenenti oligodendrociti perso, la mielina, gli assoni, e neuroni. Rimielinizzazione è un meccanismo di riparazione endogena quale nuova mielina è prodotta successivamente alla proliferazione, il reclutamento e la differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti in oligodendrociti-mielina, ed è necessario per proteggere gli assoni da ulteriori danni. Attualmente, tutti terapie per il trattamento della sclerosi multipla bersaglio componente immunitaria aberrante della malattia, che riducono recidive infiammatorie ma non impedisce la progressione verso irreversibile declino neurologico. E &#39;quindi indispensabile che le strategie-rimielinizzazione promuovere essere sviluppati che possono ritardare la progressione della malattia e forse invertire sintomi neurologici. Esistono diversi modelli animali di demielinizzazione, compresa l&#39;encefalomielite autoimmune sperimentale e curprizone; Tuttavia, ci sono limitazioni nel loro utilizzo per lo studio rimielinizzazione. Un approccio più robusto è l&#39;iniezione focale di tossine nel sistema nervoso centrale, compreso il lisolecitina detersivo nella materia bianca midollo spinale di roditori. In questo protocollo, abbiamo dimostrato che la procedura chirurgica coinvolti nell&#39;iniettare lisolecitina nella sostanza bianca ventrale dei topi è veloce, conveniente, e non richiede materiali aggiuntivi rispetto a quelli disponibili in commercio. Questa procedura è importante non solo per studiare gli eventi normali coinvolti nel processo remyelination, ma anche come strumento di pre-clinico per lo screening candidati terapie-rimielinizzazione promozione.

Iniezione focale Lysolecithin nella sostanza bianca ventrale produce una lesione demielinizzante discreta che è rilevabile su una distanza di circa 3 mm (figura 2). La colorazione immunoistochimica del nucleo lesione per mielina (MBP) e assoni (SMI312) mostra assoni che sono stati privati ​​di mielina a 7 giorni (figura 3). Per 14 giorni, molti assoni sono circondati da anelli MBP-positivi, il che suggerisce la presenza di rimielinizzazione. Colorazione per cellule della linea oligodendrociti (PDGFRα, Olig2, CC1), vi è un aumento significativo sia del numero totale di cellule a 14 giorni rispetto a 7 giorni, così come la distribuzione di oligodendrociti maturi rispetto alle OPC (Figura 4) . Coerentemente con questo risultato, sezioni semisottile colorate con blu di toluidina rivelano la presenza di guaine di mielina sottili a 14 giorni raramente rilevati a 7 giorni (Figura 5), indicando che questi sono i remyelinatednternodes. La procedura è altamente riproducibile tra animali. Variation si verifica quando il respiro pesante altera la posizione fissa del capillare questo di solito non è un problema di adeguata sedazione. Danneggiamento assoni risulta minimo, tranne nel centro della lesione, che è stato descritto in quanto il primo utilizzo del modello 1. Crediamo che questo sia lesioni meccaniche dal capillare di vetro, come è anche osservabile in PBS iniettato controlli. Tuttavia, la variabilità tende ad essere piccolo, e noi e altri che utilizzano una procedura simile hanno rilevato differenze tra le condizioni sperimentali con il minor numero di 4 animali per gruppo 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig1.jpg" /> Figura 1. Montaggio della siringa iniezione. (A) Il dado della siringa iniezione è avvitato t<html> egli estremità piatta del capillare di vetro, seguito dal 2 ghiere tale che il loro accoppiamento termina interblocco. Una volta che il capillare viene saldamente aderente nella boccola conica, il complesso viene avvitato mano stretta sull&#39;estremità della siringa iniezione. (B) pezzo centro di un disco di gomma con l&#39;ago mozzo metallico attaccato alla siringa di attivazione e scorrere verso il basso per la base. (C) Per il prelevamento lisolecitina soluzione nella siringa adescamento. (D) prema delicatamente la siringa di attivazione fino alla prima goccia di lisolecitina è visibile sulla punta dell&#39;ago. (E) Inserire la siringa di attivazione nella canna della iniezione siringa, facendo una guarnizione costante con il disco di gomma. Premere leggermente la soluzione fino a che corre alla fine del capillare. Sfilare delicatamente la siringa adescamento mantenendo la pressione sullo stantuffo per rimuovere l&#39;ago hub metallo senza introdurre bolle d&#39;aria nella siringa iniezione.caricare / 52679 / 52679fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentante lisolecitina lesione macchiato di eriocromo cianina. Sezioni seriali (distanziati di 400 micron a parte) di una caratteristica lesione lisolecitina a 14 giorni, colorati con eriocromo cianina di visualizzare mielina (blu). Si noti che demielinizzazione è limitata alla materia bianca ventrale e che la lesione si estende circa 3 mm nella rostrale / caudale. Bar Scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig3.jpg" /> Figura 3. Gli assoni e mielina inil modello lisolecitina. (A) A farsa (PBS) iniettato nel midollo spinale a 7 ​​giorni Mostra assoni sani che sono circondati da anelli di mielina. (B) A lisolecitina lesione a 7 ​​giorni Mostra assoni denudato e mielina degradato. (C) dopo 14 giorni, una proporzione di assoni (esempi denotati con frecce bianche) sono associati con la ricomparsa di anelli mielina. Bar Scala = 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig4.jpg" /> Figura 4. cellule Oligodendrocyte lignaggio nel modello lisolecitina. (A, C) A 7 giorni, vi è una maggiore rappresentazione PDGFRα + OPC (barre bianche) rispetto a CC1 oligodendrociti + (barre magenta); i numeri all&#39;interno delle barre rappresentano percentuali. Olig2 stato sondato aconfermare colorazione di cellule lignaggio oligodendrociti. (B, C) ​​A 14 giorni, non vi è un aumento significativo del numero totale di cellule lineage oligodendrociti rispetto a 7 giorni (p &lt;0,05, due code t-test, n = 4 per gruppo ). C&#39;è anche un aumento significativo nella distribuzione di oligodendrociti alle OPC a 14 giorni rispetto a 7 giorni (p &lt;0,0001, test esatto di Fisher). Bar Scala = 10 micron. Ogni campo viene catturato con un ingrandimento originale di 60X. I valori sono media ± SD. * Significa p &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig5.jpg" /> Figura 5. rimielinizzazione nel modello lisolecitina. (A) Un blu toluidina trasversale macchiato sezione della sostanza bianca ventrale semisottile in un healthy mouse mostra assoni su una vasta gamma di calibro di rispettivi spessori mielina. (B) A 7 giorni, una mancanza di guaine mieliniche si osserva adiacente ad un&#39;area inalterata (in basso a destra). (C) A 14 giorni guaine mieliniche sottili ( esempi contrassegnati da frecce rosse) appaiono in tutta la lesione, indicativa di segmenti remyelinated. Bar Scala = 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin at JoVE.com

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

experimental-demyelination-remyelination-murine-spinal-cord-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K Views.  Hotchkiss Brain Institute at University of Calgary. Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Video: Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the spinal cord, tumor resections, or tissue defects resulting from traumatic accidents can aid in facilitating general tissue repair as well as regenerative growth of nerve fibers into and beyond the affected area. Two experimental treatment strategies are presented: (1) implantation of a novel microconnector device into an acutely and completely transected thoracic rat spinal cord to readapt severed spinal cord tissue stumps, and (2) polyethylene glycol filling of the SCI site in chronically lesioned rats after scar resection. The chronic spinal cord lesion in this model is a complete spinal cord transection which was inflicted 5 weeks before treatment. Both methods have recently achieved very promising outcomes and promoted axonal regrowth, beneficial cellular invasion and functional improvements in rodent models of spinal cord injury.
The mechanical microconnector system (mMS) is a multi-channel system composed of polymethylmethacrylate (PMMA) with an outlet tubing system to apply negative pressure to the mMS lumen thus pulling the spinal cord stumps into the honeycomb-structured holes. After its implantation into the 1 mm tissue gap the tissue is sucked into the device. Furthermore, the inner walls of the mMS are microstructured for better tissue adhesion.
In the case of the chronic spinal cord injury approach, spinal cord tissue - including the scar-filled lesion area - is resected over an area of 4 mm in length. After the microsurgical scar resection the resulting cavity is filled with polyethylene glycol (PEG 600) which was found to provide an excellent substratum for cellular invasion, revascularization, axonal regeneration and even compact remyelination in vivo.

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Strategie sperimentali per colmare grandi lacune tessuto nel midollo leso spinale dopo acuta e cronica Lesione

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti negli interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...