Questo lavoro è stato sostenuto dal D. Paul Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dalla University of Pennsylvania IACUC. 1. Dissezione EDL e preparazione (circa 30 min) <ol><li> Anestetizzare topi per garantire che essi sperimentano nessun dolore o disagio durante la procedura, ma che i muscoli rimangono ben ossigenato dalla circolazione. Noi abitualmente uso un cocktail ketamina / xilazina (100/10 mg / kg) iniettata tramite IP. Piano di anestesia chirurgica è determinata dalla completa assenza di pedale o riflessi di astinenza palpedral, o mancanza di risposta dell&#39;orecchio contrazione. </li><li> Immobilizzare gli arti posteriori con nastro medico, e rimuovere la pelle della hindlimb inferiore anteriore per esporre i muscoli di questa zona. Mantenere i muscoli umido con l&#39;applicazione di PBS a intervalli regolari. </li><li> Sotto un ambito dissezione, fare una piccola incisione laterale al ginocchio per esporre il tendine prossimale del muscolo EDL. Ci sono due tendini in questa regione, ed entrambi dovrebbero essere tagliati per consentire ririmozione della EDL. </li><li> Alla caviglia mediale, tagliare il tendine del muscolo TA per esporre i tendini distali del EDL, che si estendono lungo le tarso meta. Sollevare il muscolo TA di mezzo, facendo attenzione a non tagliare o toccare la parte inferiore EDL. Torna ai tendini distali del EDL, snip ognuno e farli passare attraverso la caviglia, poi afferrare i tendini, tirare delicatamente la EDL lontano dal resto dell&#39;arto. Si dovrebbe rilasciare dall&#39;estremità prossimale liberamente, ma se non, tornare alla incisione laterale per garantire che il tendine è tagliato. Rimuovere il muscolo e mettere in un piatto pieno di dissezione refrigerati Ringers ossigenati. Pin il muscolo attraverso i tendini a lunghezza approssimativamente di riposo, che è la lunghezza presenti in vivo. La lunghezza è troppo breve quando il muscolo è flaccido nel piatto, e troppo a lungo se il muscolo sta tirando sui perni dissezione. </li><li> Euthanize il mouse immediatamente dopo la rimozione del muscolo per dislocazione cervicale. </li><li> Legare ai dieci punti di suturaDons, il più vicino possibile al muscolo, ma senza toccare il muscolo. Pin il muscolo alla lunghezza di circa di riposo con i punti di sutura. </li></ol> 2. Membrana dissezione e preparazione (circa 30 min) <ol><li> Euthanize i topi prima di questa procedura per dislocazione cervicale in anestesia, se il mouse stesso è sottoposto a due dissezioni, o CO 2 seguita da conferma con dislocazione cervicale. </li><li> Fare una incisione nella pelle per esporre la cavità addominale e toracica. Aprire la cavità addominale, e tagliare la parete del corpo appena sotto le costole. Usando forbici ossee, e l&#39;inserimento di partenza sopra diaframma, taglio intorno alla gabbia toracica intera seguendo la linea delle costole, e tagliare la colonna vertebrale. Tagliare vasi sanguigni che attraversa il centro del diaframma in modo che il diaframma può essere rimosso facilmente. </li><li> Rimuovere la membrana dal mouse, e mettere in un piatto pieno di dissezione Ringers ossigenati. Agitare delicatamente il DiAPhragm nel piatto per lavare via il sangue. Refresh soluzione di Ringer come necessario. </li><li> Tagliare una piccola striscia di diaframma del tendine centrale alle nervature lungo l&#39;orientamento delle fibre nella porzione centrale dei hemidiaphragms laterali. La striscia deve essere compreso tra 2-4 mm di larghezza. Usando forbici osso, tagliare la nervatura su entrambi i lati del nastro, lasciando circa 1-2 mm sporgenza della nervatura ai lati della striscia diaframma. </li><li> Legare punti di sutura al tendine centrale. Legare sutura a ciascuna delle estremità sporgenti lateralmente nervatura, e quindi legare questi insieme per fare un grande anello. </li><li> Due strisce possono essere ottenute da qualsiasi dato diaframma (una per ogni lato). </li></ol> 3. Muscoli di montaggio a Bath Meccanica <ol><li> Afferrare le suture e utilizzare questi per fissare il muscolo di un post rigida ad una estremità, e di un trasduttore di forza sull&#39;altra estremità. </li><li> Regolare la lunghezza per assicurarsi che il muscolo non è allentato, ma non è tesa. Una buona approssimazione è il musc riposole lunghezza come al punto 1.4 - 1.5. </li><li> Bagno deve essere riempito con soluzione di Ringer ossigenato mantenuta a 22 ° C per prolungare la stabilità muscolare per il test. Muscoli dovrebbe riposare per 5 min in questo bagno prima del test funzionale in modo che la temperatura muscolare è equilibrato a 22 ° C. </li></ol> 4. Contrazioni isometriche <ol><li> Creazione delle condizioni di stimolazione sovramassimale. Dopo un muscolo viene posto nel bagno, utilizzare singoli impulsi di stimolazione 0,5 msec per generare una contrazione, e monitorare uscita forza. Aumentare gradualmente la forza di corrente fino a raggiunge un livello massimo ma costante. Aumentare la corrente al 10% più di questo livello per gli esperimenti rimanenti. </li><li> Stabilire la lunghezza ottimale. Utilizzando stimolazioni contrazione isometrica, regolare la lunghezza del muscolo gradualmente fino a una forza massima viene ottenuta. Appoggiare il muscolo ~ 10 secondi tra ogni contrazione. Lunghezza muscolare ottimale (L o) si ottiene quando la forza contrazione è massima. Record lunghezza del muscolo (la lunghezza ègiunzioni tra il miotendiniche per EDL e tra la centrale di giunzione mio-tendinea tendine e l&#39;inserzione del muscolo alla costola) con pinze Vernier. </li><li> Massima forza isometrica tetanica. Stimolare muscolo fissato a L o per un periodo di 500 msec, con una serie di impulsi di 0,5 msec con stimolazione sopramassimale ea frequenza fusione (dal plateau della frequenza forza relazione (Rif. es:. 8) Il plateau di muscoli EDL è tipicamente raggiunto con 120 Hz, e per muscoli del diaframma con 100 Hz.. Stimolare 3 volte alla frequenza relativa con periodi di riposo di 5 minuti tra i periodi di stimolazione per ogni muscolo. </li></ol> 5. Contrazioni eccentriche <ol><li> Lasciare riposare muscolare 5 minuti tra l&#39;esecuzione di contrazioni isometriche ed eccentriche. </li><li> Stimolare i muscoli a 80 Hz isometricamente per le prime 500 msec, seguito da un tratto L 10% o in finale stimolazione 200 msec (un tasso di allungamento di 0,5 L o/ Sec). </li><li> Ripetere modello stimolazione con 5 min pause tra per il numero desiderato di contrazioni eccentriche. </li><li> Misurare la forza per ogni contrazione nel periodo di tempo precedente al tratto. Calcolare la caduta in vigore tra la contrazione e il cognome. </li></ol> 6. Cancellazione dal Apparato muscolare <ol><li> Accorciare la lunghezza del muscolo per consentire la rimozione delicata del muscolo dal trasduttore e postare e versarla in un piatto dissezione con Ringer. </li><li> Rimuovere punti di sutura dei muscoli. </li><li> Per il muscolo EDL, asciugare il muscolo due volte, poi pesare, prima della trasformazione successiva (ad esempio, il congelamento, fissaggio, ecc.) Questo sarà importante per calcolare l&#39;area in sezione trasversale, e la forza specifica. </li><li> Per il muscolo diaframma, immergere nello 0,1% Procion arancione, un colorante impermeant membrana per 15-20 min. Ciò fornirà un indice di danno dissezione. </li><li> Sezionare il muscolo, allontanandosi dall&#39;inserzione ossea, così come il centtendine ral. Questo è necessario per fornire un peso esatto del muscolo. Asciugare come sopra prima della pesatura e successiva preparazione. </li><li> Calcola area della sezione trasversale (CSA): CSA (mm 2) = massa (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)], dove L / L o è la fibra muscolare rapporto lunghezza (0,45 per EDL, 1,0 per il diaframma) 5 1,06 ed è la densità del muscolo. </li></ol>

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B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Aurora scientifico.

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di fornire indicazioni su come eseguire la funzione muscolare isolato su due muscoli di topo - l&#39;EDL e il diaframma. La valutazione di questi muscoli può fornire una conoscenza o meno di nuovi candidati terapeutici per le malattie muscolari sono utili. Per entrambi i muscoli, il fattore principale per ottenere dati affidabili è una dissezione pulito. Pertanto, la pratica e perfezionare il passo iniziale isolamento è essenziale prima di passare i test funzionali. Inoltre, l&#39;istituzione di parametri funzionali per il muscolo normale è fondamentale prima di fare paragoni al muscolo distrofico, o tra i trattamenti. Ciò assicurerà che i risultati dello studio non sono soggetti a variabilità impartita dalla capacità di chi esegue gli esperimenti. L&#39;uso di un colorante impermeant membrana può aiutare con ottimizzare la preparazione dissezione, per incubazione di qualsiasi muscolo in una soluzione contenente un colorante segnerà fibre più danneggiate, e può servire come un indice di dissection successo. Minimizzando il numero di fibre danneggiate nel muscolo aiuterà ad ottimizzare la misurazione. Le fibre danneggiate da dissezione fluorescenza molto più brillantemente di quelli danneggiati da contrazione eccentrica, e quindi, se il colorante è utilizzato anche durante il processo meccanica, si può usare l&#39;intensità del colorante per distinguere tra i due tipi di danni. Dissezione di strisce diaframma sarà quasi sempre danno fibra, semplicemente perché tagliando lungo la lunghezza delle fibre, alcune inevitabilmente vengono distrutte. Assorbimento colorante è forte in quei fibre danneggiate, e questi sono normalmente limitati ai bordi esterni della preparazione. In media, si osserva una banda di fibre danneggiate che è ~ 3 fibre in larghezza (~ 120 micron) su entrambi i lati della striscia muscolare. Se la banda danneggiato comprende più del 15% del muscolo, i dati vengono scartati. La preparazione diaframma ha anche vincoli sulla dimensione ottimale per le misure funzionali. Abbiamo trovato che i pezzi di diaphragm che sono più larghi di 5 mm iniziano a piegare su se stesse, perché il legame tendine centrale è solo in un punto. Ciò si traduce in una riduzione della forza specifica nella preparazione. Abbiamo anche trovato che strette strisce hanno anche bassa forza specifica, che riteniamo sia perché il numero di fibre danneggiate durante la dissezione comprendono una quota maggiore del numero totale di fibre. Per esempio, se 0,1 millimetri per lato è danneggiato, allora è 5% (2x0.1 mm / 4 strip mm) della preparazione muscolare che non contribuisce alla forza, mentre se la striscia è solo 1 mm, quindi 20 % della preparazione muscolare è danneggiato. Così, sia la larghezza della zona danneggiata e la larghezza della intera preparazione sono fattori importanti da controllare. Misure di massima tensione isometrica richiedono che tutte le fibre muscolari di un muscolo vengono stimolati. Poiché non vi è variabilità enorme componenti di un apparato funzione, questo deve essere determinato per ogni singola serieup. Per esempio, dimensione bagno o il tipo di stimolatore può influenzare l&#39;intensità di stimolazione. Stimolazione Twitch è un modo ragionevole per determinare le condizioni di stimolazione sovramassimale. Una volta che questo è stabilito per una configurazione specifica e muscolo, può essere utilizzato per studi successivi. Al contrario, la lunghezza ottimale di qualsiasi muscolo dato deve essere misurato per ciascun preparato mediante il processo iterativo sopra descritto. Questo assicura che si sovrappongono a filamento spessi e sottili è ottimale e il massimo potenziale di capacità di generazione di forza è misurata. Procedure alternative possono fare affidamento sui modelli di diffrazione associati con le striature muscolari, ma questo richiede attrezzatura supplementare non descritto qui. Noi abitualmente uso 500 msec durata di stimolazione, che rientra nella fascia media di questo parametro utilizzato da altri ricercatori in questo campo. Anche se questo potrebbe causare affaticamento del muscolo durante la contrazione, che è evidenteda un &quot;abbassamento&quot; della produzione di forza massima, questo di per sé può essere informativo. Per esempio, una differenza di affaticamento potrebbe essere raggiunto da diversi tipi di terapie comprese quelle che movimentazione bersaglio di calcio, di conseguenza l&#39;abbassamento in vigore durante contrazione attiva può servire come un indice di miglioramento. In alternativa, la perdita di forza potrebbe indicare che le suture sui tendini non sono abbastanza stretto, e che stanno scivolando durante la contrazione. Il muscolo deve essere rimosso dal bagno e le suture devono essere ri-legato se questo si verifica. Abbiamo anche utilizzare una serie di contrazioni tetaniche 3, che aiuta a valutare la stabilità del preparato. Anche in questo caso, scivola sutura porterebbe alla perdita di forza tra le contrazioni, che richiede sutura ri-legatura. Muscoli di grandi dimensioni possono anche generare nuclei anossici, che portano a perdite di forza durante il protocollo. Massa muscolare è un fattore limitante per l&#39;esecuzione di test di funzionalità muscolare isolato, in cui i muscoli EDL con masse superiori a 20 mg perdere forza con ogni contrazionezione, e non può essere supportata da superfusione in un bagno. Strisce membrana non soffrono le stesse complicazioni perché sono abbastanza sottili da avere vitalità prolungata nel bagno. Altri muscoli possono essere utilizzati per la funzione muscolare isolato, compreso il muscolo soleo, che è comunemente usata, ma non descritti qui. Molte delle stesse procedure possono essere adottate per i soleo in termini di preparazione e il collaudo funzionale. Tuttavia, le differenze principali sono la frequenza di stimolazione, ed i parametri per contrazioni eccentriche. Utilizzare del soleo per funzione complementare a quello degli altri due muscoli, e quindi dovrebbe essere considerata come parte di un &quot;pacchetto standard&quot; per la valutazione topi distrofici 4, 7. Contrazione eccentrica fornisce un indice di fragilità contrattile, ed è importante utilizzare un protocollo che comporta modesta perdita di forza nei muscoli da animali di tipo selvatico e di una notevole perdita di forza inmuscoli distrofici non trattati in modo che ci sia una vasta gamma dinamica per i confronti. La mancanza di qualsiasi perdita di forza nei muscoli normali suggerisce che la contrazione eccentrica è troppo dolce, e non sarà sufficiente per distinguere tra terapie che non sono efficaci e quelle che sono veramente vantaggioso. Tuttavia, una perdita di forza nei muscoli normali sottoposti a contrazione eccentrica potrebbe essere troppo grande per prendere in giro le differenze associate alla malattia. Il nostro protocollo per l&#39;EDL e il diaframma di 0,5 utilizza Lo / sec velocità di allungamento per produrre un cambiamento di lunghezza del 10%. Noi di solito eseguire 5 contrazioni eccentriche, che si traducono in una piccola perdita di forza nei muscoli normali e una significativa perdita di forza nei muscoli distrofici. Certamente, tutti questi parametri possono essere variati per aumentare la variazione di lunghezza totale, il tasso di allungamento, o il numero di contrazioni eccentriche per distinguere differenze tra muscolo malato e sano, nonché sugli effetti di uno specifico tipo di mutazione o tRATTAMENTO che si studia. Fino a quando non vi è una netta differenza tra i muscoli normali e malati, poi c&#39;è un gold standard da raggiungere in termini di trattamenti. In sintesi, questo protocollo definisce le linee guida per l&#39;esecuzione di contrazioni isometriche ed eccentrico, e identifica spera potenziali insidie ​​da evitare quando si imposta questa tecnica nel vostro laboratorio.

Misurazioni funzione muscolare contribuiscono alla valutazione dei potenziali trattamenti per patologie muscolari, nonché alla determinazione dei meccanismi sottostanti fisiologia di questo tessuto. Per la malattia muscolare, l&#39;uso di modelli murini sono diventati un elemento centrale per la comprensione dei rapporti tra genotipo e fenotipo, e per estendere la conoscenza nella progettazione e la sperimentazione di terapie potenziali. Le distrofie muscolari, in particolare, hanno fatto affidamento sui topi per valutare questi agenti e stabilire dati preclinici necessari per andare avanti per studi clinici su pazienti. Una misura di esito frequente utilizza isolato funzione muscolare per determinare la forza, che è applicabile ad una vasta gamma di studi. Un&#39;altra misura è l&#39;uso di eccentrico, o allungamento, contrazioni determinare i cambiamenti di integrità della membrana muscolare, che è carente nella distrofia muscolare di Duchenne, e il modello di mouse per questa malattia (mdx). Pertanto, è essenziale che questi tipi di misuratore digenitori di essere sensibile e riproducibile. Il mouse estensore lungo delle dita (EDL) muscolare è stato ampiamente utilizzato per la funzione muscolare isolato a causa della sua geometria ideale e dimensione, compreso l&#39;orientamento delle fibre uniformi e tendini definitive 2, 5, 6, 10, 12. Metodi per muscoli EDL isometriche misurazioni funzionali sono stati descritti in una precedente pubblicazione JoVE 8, così come nel Treat-NMD SOP 1. Abbiamo esteso la descrizione di questi metodi per includere entrambe le contrazioni isometriche ed eccentriche. Caratteristiche della malattia sono evidenti nel EDL, inclusi i cicli heighted di degenerazione / rigenerazione e uscita forza diminuita. Il diaframma del mouse mostra la progressione più rapida patologica di distrofia muscolare rispetto ad altri muscoli del topo 11. 6 mesi di età, fibrosi cumulativo comprende circa il 50% del muscolo. Ciò provoca significativamente impaired forza di uscita 11. Pertanto, agenti terapeutici che possono prevenire l&#39;infiltrazione fibrotica può essere valutato in modo efficiente nel diaframma. La perdita di distrofina nel muscolo porta ad un aumento fragilità e le accresciute danni contrattile in tutti i muscoli 9. Pertanto molte terapie per la distrofia muscolare di Duchenne sono orientati per la sostituzione distrofina. Come tale, un saggio che è diventata essenziale per valutare queste strategie è contrazione eccentrica, che può distinguere tra muscolare normale e distrofiche, oltre a determinare quale utilità particolare strategia ha per proteggere un muscolo distrofico da danni contrattile 2, 3, 4, 12. Questa procedura richiede o un dual-mode servomotore che può modulare / lunghezza di registrazione e forza, o un metodo di regolazione della lunghezza rapidamente separata da un trasduttore di forza.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> nel sistema di test muscolare in vitro </td><td> Aurora scientifico </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE sorgente di luce </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici per dissezione </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Angolari forbici dissezione </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Manico bisturi </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10003-12 </td><td> alternativo strumento di dissezione </td></tr><tr><td> Curve lame di bisturi # 12 </td><td> Scienza fineStrumenti </td><td> 10012-00 </td><td> alternativo strumento di dissezione </td></tr><tr><td> Bone forbici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T sutura legatura forcipe </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinza SS - angolo </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Intrecciato sutura seta TAGLIA 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nastro medico </td><td> TRANSPORE </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina cloridrato 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Ultima dose è di 80 mg / kg </td></tr><tr><td> Iniezione TranquiVed (xilazina 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Ultima dose è di 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reattiva arancione 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Componenti della soluzione Ringers </td><td></td><td></td><td> La soluzione è a gas equilibrata con 95% O 2 e il 5% di CO 2, pH finale 7,4 </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Concentrazione finale: 118 mm </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Concentrazione finale: 4,7 mm </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio diidrato </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Concentrazione finale: 2.5 mM </td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Concentrazione finale: 1,2 mm </td></tr><tr><td> Solfato di magnesio </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Concentrazione finale: 0,57 mm </td></tr><tr><td> 4 - (2-idrossietil) TuboRazine-1-etansolfonico (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Concentrazione finale: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Concentrazione finale: 5.5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Critico per la valutazione delle terapie potenziali per malattia muscolare sono valutazioni fisiologiche sensibili e riproducibili di funzione muscolare. Poiché molte prove precliniche si basano su modelli murini per queste malattie, la funzione muscolare isolato è diventato uno degli standard per Go / NoGo decisioni in movimento farmaci candidati in avanti nei pazienti. Dimostreremo la preparazione del estensore lungo delle dita (EDL) e muscoli del diaframma per i test funzionali, che sono i muscoli predominanti utilizzati per questi studi. La geometria muscolo EDL è ideale per preparazioni muscolari isolate, con due tendini facilmente accessibile, e una piccola dimensione che può essere supportato da superfusione in un bagno. Il diaframma presenta profonda progressiva patologia negli animali distrofici, e può servire da piattaforma per valutare molti potenziali terapie contrastare la fibrosi, e promuovere la stabilità miofibre. I protocolli per i test di routine, tra cui isometrica ed eccencontrazioni triche, verrà mostrato. Forza isometrica fornisce una valutazione della forza, e le contrazioni eccentriche aiutare a valutare la stabilità sarcolemma, che si interrompe in molti tipi di distrofie muscolari. Il confronto tra i risultati attesi fra i muscoli da muscoli di tipo selvatico e distrofiche, saranno fornite anche. Tali misure possono integrare le misurazioni morfologiche e biochimiche di omeostasi tissutale, nonché valutazioni intere di animali della funzione muscolare.

Valori attesi per le forze isometriche dei muscoli EDL da 12 animali settimane vecchi sono mostrati nella Figura 1. Poiché i muscoli mdx esporre ipertrofia compensatoria, totale forza tetanica può essere maggiore nei muscoli mdx rispetto all&#39;età di tipo selvatico controlli abbinati. Tuttavia, una misura più appropriata di uscita funzionale è forza specifica (figura 2), dove viene normalizzato vigore per sezione trasversale per calcolare questo valore. Forza specifica dipende dalla capacità intrinseca funzionale del muscolo, dove la debolezza nei muscoli distrofici è più evidente quando sia la forza assoluta e l&#39;area trasversale sono contabilizzate. Nelle nostre mani, i muscoli di topi mdx EDL generare circa il 20 - 25% inferiori rispetto a quelli delle forze specifiche di età corrispondente di tipo selvatico topo 10-26 settimane di età. Per il diaframma, solo forza specifica è rilevante per il confronto perché la preparazione è un pezzo di muscolo dipende dalla diffuction. Confronto della forza specifica tra tipo selvatico e muscoli del diaframma mdx riflette la patologia progressiva in questo tessuto. Uscita forza isometrica diminuisce con l&#39;età (Figura 3), in modo che da 6 mesi di età, muscoli del diaframma di topi mdx non producono più della metà della produzione funzionale di strisce diaframma da pari età di tipo selvatico controlli. Un esempio di contrazioni eccentriche di testing diaframma è mostrato in Figura 4. Ad ogni successiva contrazione eccentrica, uscita forza diminuisce in strisce a membrana da entrambi di tipo selvatico (C57) e topi mdx. Tuttavia, la perdita di forza è più drammatico in campioni di muscolo dal topo mdx, presumibilmente dalla mancanza di distrofina e le sue proteine ​​associate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figura 1. Isometrica forza tetanica in di tipo selvatico e mdx EDL f muscoli<html> rom 12 topi settimana fa. Forza assoluta può essere più elevata nei pari età mdx muscoli EDL a causa di ipertrofia compensatoria. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figura 2. Forza isometrica tetanica normalizzati per area muscolare in sezione trasversale è forza specifica, e rivela depresso capacità funzionale dei muscoli EDL da topi mdx rispetto a quelli di tipo selvatico topo. Tracce sono da topi stessi in Figura 1. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figura 3. La perdita progressiva della capacità di forza generatrice valutata con la forza specifica è più evidente nel diaframma di topi mdx (barre rosse) rispetto al tipo selvatico (C57 in linea blu). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. La perdita di forza in funzione del numero di contrazione eccentrica per muscoli del diaframma da 12 settimane vecchio C57 e topo mdx. I dati sono media ± SEM per N = 4 muscoli per genotipo.

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Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Misurazioni funzione muscolare contribuiscono alla valutazione dei potenziali terapie per patologie muscolari, nonché alla determinazione dei meccanismi sottostanti fisiologia di questo tessuto. Si dimostrerà la preparazione del muscolo estensore lungo delle dita e muscoli del diaframma per i test funzionali. Protocolli per contrazioni isometriche ed eccentriche verrà mostrato, così come le differenze nei risultati tra muscoli distrofici, che rappresentano uno stato patologico, e muscoli di tipo selvatico.

Isometrica ed eccentrica valutazione della forza dei muscoli scheletrici Isolato da modelli murini di distrofie muscolari

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

32.5K Views.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. Misurazioni funzione muscolare contribuiscono alla valutazione dei potenziali terapie per patologie muscolari, nonché alla determinazione dei meccanismi sottostanti fisiologia di questo tessuto. Si dimostrerà la preparazione del muscolo estensore lungo delle dita e muscoli del diaframma per i test funzionali. Protocolli per contrazioni isometriche ed eccentriche verrà mostrato, così come le differenze nei risultati tra muscoli distrofici, che rappresentano uno stato p...

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Ricerca

Biologia

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage e Freezer per i modelli di malattia muscolare scheletrico

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d&#39;oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

Misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Generazione di monostrati epiteliali del colon primario murino da cripte intestinali

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...