This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal Consiglio locale per esperimenti su animali dalla Radboud University Nijmegen in conformità alle leggi e ai regolamenti (RU-dicembre 2013-205) Olandese. 1. Spot matrice extracellulare Gel <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni un giorno prima l&#39;isolamento: <ol><li> Scongelare una aliquota extracellulare matrice gel (100 microlitri) a 4 ° C per almeno 1,5 ore. Diluire 1:10 in modificata mezzo di Eagle Dulbecco; con 4.500 mg / L di glucosio, 4 mM L-glutammina, e 110 mg / ml di sodio piruvato (DMEM). Mantenere il gel matrice extracellulare a 4 ° C in ogni momento. Nota: sbalzi termici si tradurrà in rivestimento irregolare e formazione di cristalli. </li><li> Conservare la soluzione di gel matrice extracellulare diluito in ghiaccio per 15 min. </li><li> Pre-raffreddare una micropipetta 20 microlitri per 10 min. </li><li> Mettere vetrini camera 8 pozzetti in una piastra di Petri 100 mm e trasferire il piatto su una superficie fredda (ad esempio un pacchetto congelatore) per 10 min.</li><li> Utilizzare la micropipetta pre-raffreddata a mettere una goccia di 10 ml di gel matrice extracellulare in ogni pozzetto. Mantenere il piatto Petri sulla superficie fredda per almeno un altro 7 min (Figura 1A). </li><li> Completamente rimuovere il residuo di gel matrice extracellulare (Figura 1B), e asciugare i pozzetti a 37 ° C durante la notte. </li></ol></li></ol> 2. La dissezione di testa Muscoli (Massetere, digastrico, e muscolo elevatore del velo palatino) <ol><li> Prima di dissezione, preparare 50 ml di tampone fosfato salino (PBS) integrato con il 2% penicillina-streptomicina (P / S). Tenere su ghiaccio. </li><li> Dopo l&#39;eutanasia di un giovane ratto adulto (9 settimane) con CO 2 / O 2, decapitare il capo e togliere la pelle dalla testa. Trasferire la testa di PBS ghiacciato completato con 2% P / S in un tubo da 50 ml. </li><li> Muscolo masticatore (derivato dal 1 ° arco branchiale) <ol><li> Mettere la testa con un lato su un tappetino di silicone e fissare con ipodermico needles (Figura 2A). </li><li> Identificare la ghiandola parotide e il nervo facciale (Figura 2A). Esporre la fascia profonda che copre la ghiandola. Tagliare la fascia e rimuovere la ghiandola con le forbici dissezione. Identificare il canale uditivo esterno. Tracciare il nervo facciale dal forame stylomastoid e rimuovere con attenzione i rami temporali, zigomatico, e vestibolari con un bisturi lama n ° 15. </li><li> Liberare il capo superficiale del muscolo massetere rimuovendo la fascia. Identificare teste sia superficiali e profonde del muscolo massetere. Tracciare la testa superficiale fino al suo spessore aponeurosi tendinea inserito nel processo zigomatico del mascellare superiore. </li><li> Separare il tendine dalla sua origine al processo zigomatico con una pinza diritte. Tagliare con una lama di bisturi No. 15 o forbici dissezione e accuratamente la vita (Figura 2B). </li><li> Sezionare il capo superficiale del massetere fino al suo inserimento con l&#39;angolo e la metà inferiore di tha superficie laterale del ramo della mandibola con una lama di bisturi No. 15 (Figura 2C). Ora, rimuovere completamente il muscolo. </li></ol></li><li> Ventre posteriore del muscolo digastrico (derivato dal arco branchiale 2 °) <ol><li> Posizionare la testa in una posizione supina sul pad silicone e fissare con aghi ipodermici (Figura 3A). </li><li> Rimuovere il grasso sottocutaneo sovrastante sia sublinguale e ghiandole sottomandibolari. Quindi, rimuovere la fascia superficiale e ghiandole con le forbici dissezione. Esporre il muscolo digastrico (anteriore e ventre posteriore). </li><li> Tenere il tendine anteriore del ventre posteriore con una pinza diritte, tagliare e sezionare con cura fino alla sua origine nella bolla timpanica (Figura 3B). Fare la stessa cosa sul lato controlaterale. </li></ol></li><li> Muscolo elevatore del velo palatino muscolare (derivato dal 4 ° arco branchiale) <ol><li> Dopo la dissezione del ventre posteriore del muscolo digastrico, Localizzare il muscolo stiloioideo, tirare lateralmente, e rimuovere con cautela (Figura 4A). </li><li> Localizzare il tendine del velo palatino elevatore che inserisce alla bolla timpanica (figura 4A). Sezionare attentamente e tagliare su entrambi i lati. </li><li> Cercare la trachea e l&#39;esofago che corre dietro. Sollevare l&#39;esofago, ed esporre la faringe, laringe e il palato molle. </li><li> Localizzare la zona del palato molle in cui è inserito il palatino elevatore veli e tagliarlo sciolti (Figura 4B). Nota: Subito dopo la dissezione, rimuovere con attenzione tendine e il tessuto connettivo di ogni muscolo sotto il microscopio stereo. Immergere tutti i campioni rapidamente in etanolo al 70%, e trasferirli PBS ghiacciato integrato 2% P / S in una provetta da 15 ml. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento di cellule satellite <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni di preparazione per SC isolamento da 3 gruppi di muscoli: <ol><li>Preparare 7,5 ml di 0,1% Pronasi in DMEM. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron. Pre-riscaldare la soluzione a 37 ° C a bagnomaria per 10 minuti prima di isolamento. </li><li> Preparare 35 ml di DMEM supplementato con 10% siero di cavallo (HS) e 1% P / S. Pre-calda anche a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Preparare 15 ml terreno di coltura costituito da DMEM integrato con 20% siero bovino fetale (FBS), 10% HS, 1% P / S e 1% di estratto di embrione di pollo (CEE). Pre-calda a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Pre-coat sei pipette di plastica (10 ml) con HS e asciutti per almeno 10 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Nella cappa coltura, trasferire ogni muscolo in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Utilizzando le forbici dissezione, tagliare il muscolo in piccoli pezzi di circa 2 mm. Fare attenzione a non sminuzzare il tessuto troppo. </li><li> Aggiungere con cautela 2,5 ml di soluzione pronase 0,1% in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 60 min. Agitare delicatamente la piastra dopo 20, 40, e 60 min. Nota: Il duratio esatton dell&#39;incubazione dipende da fattori quali l&#39;età e la tensione degli animali. </li><li> Monitorare al microscopio. Controllare i frammenti muscolari e fermare la digestione enzimatica quando le fibre fasci ottenere un aspetto allentata (Figura 5). </li><li> Aggiungere 2,5 ml di DMEM supplementato con 10% HS e 1% P / S. Trasferire in un tubo da 15 ml e centrifugare le provette a 400 xg per 5 min. Eliminare il surnatante tramite decantazione. </li><li> Aggiungere 5 ml DMEM supplementato con 10% HS e 1% P / S. Pipettare la soluzione su e giù con una pipetta 10 ml di plastica (triturazione) per almeno 20 volte per omogeneizzare il tessuto. </li><li> Centrifugare le provette a 200 xg per 4 minuti. Raccogliere il surnatante e trasferire in una provetta da 15 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml DMEM supplementato con 10% HS e 1% P / S. Pipetta nuovo con una pipetta da 10 ml fino i frammenti di tessuto passa facilmente attraverso la pipetta. </li><li> Centrifugare le provette a 200 xg per 4 minuti e raccogliere il surnatante in una provetta da 15 ml. </li><li> Put un filtro cella (40 micron) su un tubo da 50 ml e trasferire il surnatante contenente le cellule dissociate sul filtro. Lavare con 1 ml DMEM per il recupero delle cellule massima. </li><li> Centrifugare le provette a 1000 xg per 10 minuti e scartare il surnatante con una pipetta. </li><li> Risospendere il pellet in 300 microlitri terreno di coltura e contare le cellule in un emocitometro. </li></ol> 4. La differenziazione delle cellule satelliti su Spot matrice extracellulare Gel <ol><li> Diluire la sospensione cellulare per ottenere 1,5 x 10 3 cellule in 10 ml di terreno di coltura. </li><li> Fissare le coperture delle camere diapositive con nastro adesivo e segnare i punti con un pennarello nero sul lato inferiore del vetro dell&#39;oggetto. </li><li> Usando una micropipetta, mettere una goccia di sospensione cellulare 10 microlitri sul punto di gel matrice extracellulare. Controllare al microscopio se la goccia di sospensione cellulare è stato posizionato correttamente sul posto. Incubare per sei ore a 37 ° C. </li><li> Attentoly aggiungere 400 ml di terreno di coltura (DMEM supplementato con 20% FBS, 10% HS, 1% P / S e 1% CEE) e incubare per tre giorni a 37 ° C. Nota: A questo punto, appena isolato SC sono sottoposti a massicci traumi (digerito enzimatico e aspra triturazione), e hanno bisogno di recuperare. Non disturbare le cellule durante i primi tre giorni 37. Successivamente, il terreno di coltura può essere cambiato a seconda del tipo di esperimento. Le macchie gel matrice extracellulare possono essere seminati con una densità cellulare di alta (1,5-2,5 x 10 3/20 ml) per il dosaggio differenziazione. Il terreno di coltura (DMEM integrato con 20% FBS, 10% HS, 1% P / S e 1% di estratto embrionale pollo) può essere sostituito ogni tre giorni. </li><li> In alternativa, se si desidera la crescita e il passaggio seguire i seguenti passi: <ol><li> Scongelare una aliquota extracellulare matrice gel (500 microlitri) a 4 ° C per almeno 1,5 ore. Diluire 1:10 in DMEM e seguire le raccomandazioni di cui al punto 1.1.1. </li><li> Pre-raffreddare una pipetta 10 ml per 10 minuti a 4 &amp;# 176; C. </li><li> Trasferire tre fiasche T75 su una superficie fredda (ad esempio un pacchetto congelatore) per 10 min. </li><li> Usare la pipetta pre-raffreddata a mettere 1 ml di gel matrice extracellulare in ogni pallone. Verificare che la superficie è coperta completamente. Mantenere i flaconi su superficie fredda per almeno altri 7 minuti (Figura 1A). </li><li> Completamente rimuovere il gel matrice extracellulare rimanente con una pipetta 10 ml, e asciugare i pozzetti a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Dopo il conteggio, risospendere le SCs appena isolate in 10 ml di terreno di coltura (DMEM supplementato con 20% FBS, 10% HS, 1% P / S e 1% di estratto embrionale pollo) e seme nelle fiasche T75 pre-rivestite. </li><li> Dopo tre giorni, cambiare il supporto (ed ogni terzo giorno) fino all&#39;80% di confluenza è raggiunto. Per passaging, lavare i fiaschi T75 tre volte con PBS. Successivamente aggiungere 1 ml di 0,25% soluzione tripsina e incubare per tre minuti a 37 ° C. Risospendere in 9 ml di terreno di coltura (DMEM integrato con 20% FBS, 10% HS, 1% P / Se 1% di estratto embrionale pollo) e centrifugare a 200 xg per 5 min. Scartare il surnatante. Dopo aver contato, risospendere 1 x 10 6 cellule in 1000 ml di terreno di coltura e di congelare le cellule. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

SC da diversi muscoli della testa branchiomeric sono stati isolati da una 9 settimane di età ratto Wistar e coltivate direttamente sulla matrice extracellulare spot gel senza previa espansione e passaging. Dopo l&#39;isolamento, le cellule sono state contate e seminate alla stessa densità cellulare. Per l&#39;isolamento parallelo di tre diversi muscoli, questo metodo richiede circa 4 ore. Per evitare la contaminazione cultura, un passaggio critico è il rapido lavaggio in alcool 70% dopo la dissezione dei muscoli. Durante isolamento SC è importante tagliare il tessuto muscolare in piccoli pezzi (circa 2 mm), ma evitare troppa macinazione come questo si tradurrà in una piccola quantità di cellule a causa di danno cellulare. Inoltre, la durata della digestione enzimatica deve essere controllata attentamente al microscopio per evitare ulteriori danni. Lo scopo della digestione è dissociare le miofibre. Poiché più del 90% delle cellule isolate esprimono Pax7, senza ulteriore purificazione è necessaria (figure 6-8).Questo evita fasi di purificazione supplementare altri metodi come la pre-placcatura sui piatti non patinati 14,37,38, frazionamento su Percoll 39,40, cellulare o fluorescente-o magnetico di ordinamento 41,43. Per triturazione è essenziale per indurre taglio tra i frammenti di tessuto e l&#39;apertura della punta della pipetta come questo permette lo sblocco meccanico del SC. Se la triturazione con una pipetta 10 ml (all&#39;interno Punta di diametro 1 mm) è difficile, a 5 ml (all&#39;interno punta Diametro: 2 mm) pipetta possono essere utilizzati prima. In alternativa, pipette Pasteur di vetro possono essere tagliate a diametro desiderato e possono essere usate. Questo metodo è semplice, efficace e consente l&#39;isolamento simultaneo di SC da campioni di muscolo differenti. Le piastre di coltura per SCs possono essere rivestiti con gelatina o collagene, ma i nostri studi precedenti mostrano che gel matrice extracellulare è molto meglio per il mantenimento del potenziale miogenico di collagene 38. Le macchie di gel matrice extracellularedimensioni millimetriche (10 microlitri / Ø 2 mm o 20 microlitri / Ø 4 mm) consente lo studio della proliferazione e differenziazione delle CS con un numero limitato di cellule. Per il saggio differenziazione circa 8 a 20 volte meno cellule sono obbligatori confrontati ad una piastra da 24 pozzetti (Ø 15,6 millimetri), e circa 80 a 200 volte meno rispetto a 35 mm di piastre Petri (Ø 35 mm) 14,38. Dal momento che il gel matrice extracellulare è costoso, questo metodo è anche più conveniente. Inoltre, i vetrini camera possono essere sostituiti da copertura di plastica scivola per ridurre ulteriormente i costi. Per la preparazione del gel matrice extracellulare visto essiccazione overnight delle slitte camera è essenziale. Poiché i punti di gel matrice extracellulare sono trasparenti, è necessario segnare i punti sul lato inferiore con illuminazione posteriore. Le Camere vetrini vengono fissati in una capsula di Petri per una facile manipolazione. Ulteriore espansione coltura cellulare non è necessario, che offre la possibilità di studiare il SC di goccioliler muscoli o campioni di muscolo di piccole dimensioni. In alternativa, ad esempio per la PCR o muscolo costruisce se sono necessari più celle, le SCs appena isolate possono prima essere ampliato in fiasche T75 come indicato sopra. SC isolato utilizzando questo protocollo non sono suscettibili di depurazione mediante citometria a flusso subito dopo l&#39;isolamento. La digestione con pronasi provoca una digestione notevole della superficie antigeni 14. Siero di cavallo e siero fetale bovino che vengono utilizzati per la coltura delle cellule devono prima essere adeguatamente caratterizzati prima di isolamento, come diversi numeri di lotto interessati differenziale mioblasti proliferazione e differenziazione. Negli ultimi anni, vi è un crescente interesse nei muscoli derivanti dagli archi branchiali e mesoderma testa (ad esempio, i muscoli estrinseci) 24. È stato chiaramente dimostrato che i muscoli della testa e degli arti possiedono proprietà altamente differenti. Muscolo masticatore da vecchi animali sembra ritain loro capacità rigenerativa in confronto con i muscoli degli arti 25,26. SC dai muscoli estrinseci in possesso di una solida capacità di proliferazione e differenziazione paragonabili a SC da muscoli della testa, e mostrano un potenziale attecchimento più grande di arto muscolare SC 24. La composizione di distribuzione e miosina tipo di fibra varia tra i gruppi muscolari e anche tra le specie. Muscoli provenienti dal primo arco branchiale nell&#39;uomo contengono fibre sia lente e veloci (sottotipi IIA e IIX), miosine neonatali e myosins tipici per lo sviluppo del muscolo cardiaco. Nei roditori questi muscoli contengono circa il 95% fibre veloci miosina IIA e IIB) 44-46. Gli studi sui muscoli aviaria mostrano che SC di tipi di fibre muscolari differenti variano nella capacità di differenziazione. SC da fibre veloci differenziano solo in fibre muscolari veloci, mentre SC da fibre lente possono differenziarsi in entrambi i tipi di fibra 47. Inoltre, la percentuale di SC nel muscolo velocefibre è inferiore a quello delle fibre muscolari lente 48,49. Ciò indica che la distribuzione tipo fibra deve essere preso in considerazione per studi sui muscoli nella zona craniofacciale. Simile ai muscoli palatoschisi, la LVP nei roditori contiene quasi esclusivamente fibre veloci 50. Per questo motivo, SC del LVP sono adatti per gli studi pre-clinici nel campo della palatoschisi. Questo protocollo offre nuove possibilità per studiare SCs derivate dai muscoli della testa branchiomeric o altri piccoli muscoli o muscoli campioni più piccoli. Ciò faciliterà lo sviluppo di nuove terapie per migliorare la rigenerazione dei muscoli nella zona maxillofacciale in condizioni come palatoschisi ma anche in altre condizioni che interessano muscoli più piccoli.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Circa 1: 500-1: 1000 neonati presentano una fenditura che coinvolge il labbro e / o palato (CLP); Così questo è la malformazione congenita più comune negli esseri umani 1. I muscoli del palato molle sono fondamentali per il funzionamento del palato molle durante il discorso, deglutizione e succhiare. Se una fessura del palato molle è presente, questi muscoli sono anormalmente inseriti nell&#39;estremità posteriore dell&#39;osso palatale. Il palato molle si muove su e giù durante il discorso, impedendo che l&#39;aria di fuggire attraverso il naso. I bambini con una fenditura nel palato non hanno questa funzione di controllo con conseguente fenomeno noto come velopharyngeal disfunzione 2,3. Anche se i protocolli di trattamento sono variabili, la riparazione chirurgica del palato molle si svolge nella prima infanzia (6-36 mesi di età) 4. I muscoli anormalmente inseriti del palato molle possono essere corretti chirurgicamente 5-7, tuttavia, disfunzione velopharyngeal persiste nel 7% al 30%dei pazienti 2,3,8-10. La capacità del muscolo scheletrico di rigenerare attraverso l&#39;azione di cellule satelliti (SCS) è ben consolidata 11,12. Su infortunio muscolare, SC sono attivati ​​e migrano al sito di lesione. Poi proliferano, si differenziano e si fondono per formare nuove fibre muscolari o riparare danneggiati quelle 13. Quiescenti CS esprimono il fattore di trascrizione Pax7 14,15, mentre la loro progenie, i mioblasti proliferanti, inoltre esprimere il fattore miogenico determinazione 1 (MyoD) 16. Mioblasti differenziazione iniziano a esprimere miogenina (MyoG) 17. La differenziazione terminale dei mioblasti è caratterizzato dalla formazione di miofibre, e l&#39;espressione di proteine ​​muscolo-specifici come catena pesante della miosina (MyHC) 16,18. Recentemente, diverse strategie sono state utilizzate nella medicina rigenerativa per migliorare la rigenerazione muscolare dei muscoli degli arti 19-23. Studi specifici sumuscoli della testa branchiomeric sono importanti anche perché è stato recentemente dimostrato che si differenziano da altri muscoli in diversi aspetti 24. In contrasto con i muscoli degli arti, è stato suggerito che i muscoli della testa branchiomeric contengono meno SC 25, rigenerano più lento, e il tessuto connettivo fibroso più si forma dopo l&#39;infortunio 26 Inoltre, proliferando SC da muscoli della testa branchiomeric esprimere anche altri fattori di trascrizione. Ad esempio, Tcf21, un fattore di trascrizione per la formazione del muscolo craniofacciale è fortemente espresso in rigenerare muscoli della testa, ma difficilmente a rigenerare i muscoli degli arti 25. I muscoli del palato molle dei pazienti CLP sono solitamente più piccoli e meno ben organizzata rispetto ai normali muscoli palatini 27,28. Fibre lente e veloci sono entrambi presenti nei muscoli del palato molle ma le fibre lente sono più abbondanti. Al contrario, i muscoli leporino contengono una percentuale di fibra veloci e anche una fornitura capillare ridottarispetto ai normali muscoli del palato molle 29-31. Le fibre veloci sono maggiormente soggetti a danni contrazione indotta 31-33. Il povero fornitura capillare di accompagnamento può anche favorire la fibrosi 34,35. Tutti questi aspetti possono contribuire alla scarsa rigenerazione dei muscoli del palato molle dopo la chiusura chirurgica schisi 36. In considerazione di ciò, un protocollo per l&#39;isolamento e la caratterizzazione di muscolo testa branchiomeric SC è cruciale. Questo offre la possibilità di studiare la biologia SC dei muscoli della testa branchiomeric. Inoltre, le nuove terapie a base di ingegneria dei tessuti possono essere sviluppate per promuovere la rigenerazione muscolare dopo l&#39;intervento chirurgico in CLP e le altre condizioni che compromettono la zona cranio-facciale. In generale, SC possono essere ottenuti dopo la dissociazione del tessuto muscolare 14. Tritare, digestione enzimatica, e triturazione sono generalmente tenuti a rilasciare SC dalla loro nicchia. SC può essere purificato mediante pre-placcatura su piatti non rivestite 14,37,38, fractionation su Percoll 39,40, cellulare o fluorescente-o magnetico di ordinamento 41-43. Qui vi presentiamo un nuovo protocollo economica e rapida per l&#39;isolamento delle cellule satelliti da muscoli della testa branchiomeric di giovani ratti adulti. Questo protocollo è basato su una precedente manoscritto 14 e specificamente idonei per piccoli campioni di tessuto. L&#39;isolamento di SC da muscoli rappresentativi provenienti dal 1 °, 2 °, e 4 ° archi branchiali sono descritti. Dopo l&#39;isolamento, un basso numero di cellule satelliti sono coltivate su extracellulari macchie gel matrice di dimensioni millimetriche per studiare la loro differenziazione. Questo approccio consente di evitare l&#39;obbligo per l&#39;espansione e passaging di SC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

Usando questo protocollo, il muscolo massetere (un lato) produce 0,8-1 x 10 6 cellule, il muscolo digastrico (posteriore pancia) produce 1,5-2 x 10 5 cellule, e le rese palatini muscolo elevatore veli 1-1,5 x 10 5 cellule. I rendimenti cellulari dipendono dal tipo di muscolo, affaticamento, e l&#39;età dell&#39;animale. Per confronto tra i tre gruppi muscolari, SC appena isolate sono state seminate alla stessa densità di cellule (1,5 x 10 3/10 ml). Direttamente dopo l&#39;isolamento, più del 90% delle cellule appena isolate esprimere Pax7 (Figura 6). Giorno 4, 7 e 10 colture sono state colorate con anticorpi contro Pax7, MyoD, MyoG e MyHC immunocolorazione. Cinque campi arbitrari sono stati contati per la cultura con un obiettivo 20X. Al giorno 4 Pax 7 e Myo D si esprime in tutti i gruppi muscolari (figure 6 e 7 e 8), ma la progenie di SatCs dal massetere e muscoli digastrici iniziano exprescantare miogenina prima del muscolo elevatore del velo palatino muscolare (Figura 9). Al giorno 10, l&#39;espressione di MyoG è fortemente ridotta in tutti i gruppi (Figura 9). Pochi giorni dopo la semina sui punti gel matrice extracellulare, le cellule proliferanti cominciano a fondersi e formare miotubi multi-nucleate, che esprimono la catena miosina pesante. Piccoli miotubi sono chiaramente visibili al giorno 7 (Figura 10). Al giorno 10, spasmi dei miotubi può osservare (Video 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Figura 1:. Extracellulari macchie gel matrice in una diapositiva camera (A) per una facile manipolazione, posizionare la slitta camera 8-bene in un piatto da 100 millimetri di Petri. Dispensare 10 ml di gel matrice extracellulare in ciascuna camera e metterlo su una superficie fredda (7 min). (B) Camera slitta dopo il superamento della matrice extracellulare gel viene rimosso. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissezione del muscolo massetere (A) testa dell&#39;animale in una vista laterale. Ear (E), ghiandola parotide (P) e del nervo facciale (VII). (B) tendinee aponeurosi (Te) della testa superficiale del muscolo massetere (Ms) e muscolo temporale (T). Separare il tendine dalla sua inserzione con una pinza. (C) sezionare con cautela il muscolo fino al suo inserimento al ramo della mandibola. E: orecchio, P: ghiandola parotide, VII: nervo facciale, T: muscolo temporale, Ms: capo superficiale del muscolo massetere, Te: tendine, Mp: profondo capo del muscolo massetere. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Figura 3: La dissezione del ventre posteriore del muscolo digastrico (.A) Testa dell&#39;animale in posizione supina. Localizzare ghiandola sottomandibolare (Sg), massetere (M), nervo facciale (VII) e muscolo sternocleidomastoideo (SCM). Rimuovere la ghiandola sottomandibolare. (B) Localizzare anteriore digastrico muscolo (AD) e ventre posteriore (PD). Con una pinza dritto, prendere il tendine anteriore del ventre posteriore, tagliare e sezionare con cura fino alla sua origine nella bolla timpanica (ty). E: orecchio, Sg: ghiandola sottomandibolare, VII: nervo facciale, M: massetere muscolare, SMC: muscolo sternocleidomastoideo, AD: anteriore ventre muscolare digastrico, PD: posteriore ventre muscolare digastrico, Ty: bolla timpanica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Figura 4:. Dissezione del muscolo elevatore del velo palatino (A) Veduta generale dopo la dissezione del muscolo digastrico (ventre posteriore). Muscolo stiloioideo (St) e tendine del muscolo elevatorevelo palatino può essere localizzato. Nota la trachea (T) e dell&#39;esofago (Es) esecuzione dietro. (B) Dopo aver sollevato la trachea e l&#39;esofago faringe (P) è esposto. L&#39;inserimento del palatini elevatore veli nel palato molle è ora visibile. La freccia indica il palato molle sezionato con i muscoli Palatini elevatore veli su entrambi i lati. E: orecchio, St: muscolo stiloioideo, VII: nervo facciale, M: massetere muscolare, AD: anteriore ventre muscolare digastrico, PD: posteriore ventre muscolare digastrico, T: trachea, Es: esofago, P: Faringe, * muscolo elevatore del velo palatino muscolare . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Figura 5: Aspetto del tessuto muscolare (A) prima e (B) dopo la digestione enzimatica con Pronasi. Si noti che fasci muscolari sembrano essere allentato dopo la digestione enzimatica. Figura 6: Pax 7 immunostaining SCs appena isolate, applicati al gel matrice extracellulare alla fine di isolamento (circa 6 ore dopo la digestione del tessuto iniziale).. Cinque campi arbitrari sono stati contati utilizzando un obiettivo 10X con una media di 210 cellule per campo. Circa il 90% delle cellule sono Pax 7 positive. DAPI: blu, Pax7: rosso. Barra Scala, 100 micron. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7:. Pax 7, MyoD immunostaining Giorno 4, 7 e 10 colture sono state colorate con anticorpi contro Pax7 e MyoD immunocolorazione. (A - C) e (D - F) microfotografie rappresentative della giornata 4 e 7 le culture del muscolo massetere. (G e H </strong&gt;) Il numero di Pax7 + e MyoD + nuclei per campo microscopico è stato contato e espresso come percentuale del numero totale di nuclei (DAPI). DAPI: blu, Pax7: rosso, e MyoD: verde. Bilancia bar, 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Figura 8:. Distribuzione di Pax7 ± / MyoD ± in colture di cellule mononucleate in colture da massetere, digastrico e elevatore veli muscolare palatina (A - C) Giorno 4, 7 e 10 colture sono state colorate con anticorpi contro Pax7 e MyoD immunocolorazione. Il numero totale di cellule si basa sul numero totale di nuclei (DAPI). (D) la quantificazione dei dati Pax7 ± / MyoD ± cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Figura 9:. Immunostaining Myogenin Giorno 4, 7 e 10 colture sono state colorate con anticorpi contro Myogenin. (A - D) microfotografie rappresentativi di giorno 4 e 7 culture dal Palatino muscolo elevatore veli. (E) Il numero di MyoG + nuclei per campo microscopico stato contato ed espresso come percentuale del numero totale di nuclei (DAPI). Quantificazione (F) I dati delle cellule MyoG +. DAPI: blu, Myogenin: verde. Bilancia bar, 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figur</a>e. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Figura 10:. Miosina pesante catena immunostaining Day 4, 7 e 10 colture sono state colorate con anticorpi contro catena pesante della miosina (MyHC). Microfotografie rappresentativi di giorno 4, 7 e 10 culture dal digastrico (DIG) muscolare. Al giorno 7, piccoli miotubi sono presenti, mentre a giorni 10 miotubi lunghe e ben organizzati sono evidenti. Bilancia bar, 200 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Video 1:.. Myotube spasmi Esempi di due campi rappresentativi con miotubi contrazioni sono indicati per il giorno 10 culture di muscolo digastrico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a>

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Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Questo protocollo descrive l&#39;isolamento delle cellule satelliti da muscoli della testa branchiomeric di un ratto 9 settimane di età. I muscoli provengono da diversi archi branchiali. Successivamente, le cellule satelliti sono coltivate su un rivestimento macchia di dimensioni millimetriche per studiare la loro differenziazione. Questo approccio evita l&#39;espansione e passaging di cellule satelliti.

Isolamento e caratterizzazione di cellule satelliti da muscoli Rat Capo Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K Views.  Radboud University Medical Center.  Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule satelliti da muscoli della testa branchiomeric di un ratto 9 settimane di età. I muscoli provengono da diversi archi branchiali. Successivamente, le cellule satelliti sono coltivate su un rivestimento macchia di dimensioni millimetriche per studiare la loro differenziazione. Questo approccio evita l'espansione e passaging di cellule satelliti. 

Video: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolamento delle pericelle di tipo I e II di muscoli scheletrici del mouse

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

Valvola di isolamento e caratterizzazione del ratto primario cellule interstiziali: un nuovo modello per studiare la calcificazione della valvola aortica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Isolamento e caratterizzazione di cellule Stromal Mesenchymal cardiache da Endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...