Gli autori desiderano estendere molte grazie al Drs. Josep Planas e Juan Castillo per le loro competenze professionali per lo sviluppo e l&#39;applicazione di questo protocollo cultura di piccoli pesci e anfibi. Un ringraziamento anche a causa delle innumerevoli persone che hanno instancabilmente assistito con la dissezione e la dissociazione del tessuto muscolare da molti pesci (sia nelle specie e numero), tra cui Matthew ricarica, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, e Sinibaldo Romero. Questo lavoro è stato sostenuto da University of Alabama a Birmingham Dipartimento di fondi di start-up Biologia, Centro per la Ricerca proteasi NIH di Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS di Grant # R03AR055350, e NDSU Advance AVANTI NSF di Grant # HRD-0.811.239 di PRB. Il sostegno è stato fornito anche dalla UAB Nutrition Obesity Research Center di aggiudicazione # P30DK056336, NIH NIDDK. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamenterappresentano la posizione ufficiale del NIH.

Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione sugli animali vertebrati qui descritti è stato approvato in via preliminare dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Alabama a Birmingham ed è coerente con le linee guida stabilite dal Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health degli Stati Uniti Dipartimento di Salute e Servizi Umani. 1. Preparazione per la Cultura <ol><li> Preparare il terreno base come segue: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9,53 g per 2 L) in DMEM (13,48 g / L; 26,96 g per 2 L). <ol><li> Determinare il pH e regolare a 7,40 con HCl o NaOH. </li><li> Determinare osmolalità e regolare a ~ 300 mOsm con NaCl (se necessario). </li><li> Filtro sterilizzare con (2) sistemi di sterilizzazione 1 L di vuoto e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per un massimo di 2-3 mesi. NOTA: vedere tabelle 1 e 2 per la completa reagenti, strumenti, consumAbles, e di informazione. </li></ol></li><li> Preparare-L-lisina trattati poli piastre sciogliendo 5 mg di γ-irradiati poli-L-lisina (&gt; 300.000 mw) in 50 ml di acqua ultrapura sterile. Mescolare delicatamente per inversione per 10 minuti a temperatura ambiente, assicurando la piena dissoluzione dei polimeri lisina. </li><li> Pipettare la quantità necessaria di poli-L-lisina soluzione in ogni pozzetto, secondo il tipo di placca (Tabella 3). Lasciare le piastre a stare in cappa a flusso laminare per 5 minuti. </li><li> Quindi, rimuovere poli-L-lisina soluzione e lavare due volte con acqua sterile. Lasciare le piastre di aria secca in cappa a flusso laminare per 20 minuti. </li><li> Ottenere 1 mg di laminina (origine Engelbreth-Holm-Swarm) e sciogliere in 50 ml di terreno base ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Applicare la soluzione laminina alle piastre di coltura cellulare poli-L-lisina trattati a 2 mg / cm 2. (Cfr. tabella 3 per le diverse dimensioni della piastra) </li><li> Agitare delicatamente la soluzione per assicurare full bene la copertura. Sigillare le piastre con nastro adesivo di laboratorio e posto in incubatrice per 24 ore. L&#39;incubatore deve essere impostato a temperatura appropriata per specie utilizzata (vedi Tabella 7), e nessun gas aggiuntivi devono essere aggiunti alla incubatrice. NOTA: laminina deve poter aderire alle piastre per 24 ore prima della semina di cellule. In caso contrario, si provocherebbe un calo di alcuna adesione cellulare. </li><li> Preparare il supporto come descritto nella Tabella 4. Supporto completo sia meglio preparato il giorno di utilizzo. </li><li> In preparazione per l&#39;isolamento dei tessuti, assemblare i seguenti elementi e autoclave: 300-500 bicchiere ml (s); Piatti di vetro Petri; gestisce bisturi; pinze (fine e grossolano); forbici dissezione; e diversi fogli di carta autoclave acqua-repellente. NOTA: Per ogni persona che assiste con il processo di dissezione, (2) maniglie bisturi, (1) pinza (tipo a seconda delle preferenze personali), (1) forbici dissezione, e (5-10), fogli di carta autoclave idrorepellente sonosufficiente. </li><li> Oltre agli elementi sopra autoclave, assemblare etanolo al 70%, un bilanciamento del peso, provette coniche da 50 ml sterili (numero dipende dalla dimensione della cultura), e ghiaccio. </li></ol> 2. Dissezione dei tessuti <ol><li> Prima di iniziare, assicurarsi che uno stock sufficiente di pesce è disponibile. NOTA: L&#39;età del pesce da utilizzare è di importanza critica. Mentre i pesci di due specie diverse possono essere di pesi simili, un pesce più giovane di una specie si possiedono più PPM di un pesce più vecchio di un&#39;altra specie. Come regola generale, i pesci più giovani, soprattutto quando si lavora con salmonidi, sono i migliori. Per danionins, il pesce vecchio di un anno può essere utilizzata in modo ottimale, mentre i salmonidi di età 4-6 mesi o più giovani (fino a 15 g) sono ottimali. </li><li> Per ogni 5 g di tessuto che deve essere sezionato, aliquota di 25 ml di terreno di isolamento in un tubo da 50 ml sterile. </li><li> Pesare, massa record e il numero del tubo (s). Mettere le provette su ghiaccio. </li><li> Euthanize 2-3 pescialla volta per immersione in&gt; 300 mg / L di sodio bicarbonato tamponata tricaine metansolfonato. Consentire movimento dell&#39;opercolo cessare per&gt; 5 minuti e poi immergere pesce in etanolo al 70% (contenuto nei contenitori sterili) per 30 secondi. </li><li> Rimuovere il pesce dal 70% di etanolo e mettere su carta autoclave idrorepellente. Direttamente dietro la opercoli, usare un bisturi per fare un superficiale, poco profonda incisione. Rimuovere le squame e la pelle afferrando la pelle alla incisione di cui sopra e tirare verso la coda del pesce. </li><li> Dopo la rimozione della pelle, asportare il epaxial, fast-glicolisi muscolare &#39;bianco&#39; del pesce da entrambi i lati (evitando il muscolo lento-ossidativo &#39;rosso&#39; si trova vicino alla linea laterale) e il luogo in terreno di isolamento. Scartare il resto del pesce come richiesto dalla istituzione. Cellule Mentre è del tutto possibile PPM cultura provenienti da muscolo rosso, quasi ogni pubblicazione utilizzando teleosteo MPC ha utilizzato isolati dal epaxial m: NOTAyotome. </li><li> Ripetere i passaggi 2,4-2,6 fino ad ottenere una sufficiente quantità di muscolo. Durante la dissezione, assicurarsi che il tessuto muscolare pool rimane sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare. </li></ol> 3. Dissociazione meccanica <ol><li> Versare un tubo di 25 ml / 5 g di muscoli in una piastra di Petri di vetro. Utilizzando due bisturi manici con allegato # 10 lame bisturi, trita tessuto una consistenza fangosa o purea. Un movimento &quot;avanti e indietro&quot; di tirare le lame di bisturi passato vicenda funziona meglio. NOTA: Mentre omogeneizzatori tessuto possono sembrare del caso, il numero di cellule vitali sarà drasticamente ridotto, se non abolita. </li><li> Usando una pipetta 25 ml sierologica e pipetta sierologica, rimuovere il tessuto impastato e sostituire nel tubo conico originale. </li><li> Ripetere i passaggi 3.1-3.2 finché tutti i tessuti in tutte le provette è stato dissociato meccanicamente. </li><li> Tessuto Centrifugare per 5 minuti a 300 xg e 10 ° C. </li><li> Follcentrifugazione causa, eliminare i ml 25 di media surnatante con una pipetta 25 ml sierologica, aspiratore, o da un attento decantazione. </li><li> Aggiungere 25 ml di mezzo di lavaggio per ogni tessuto tubo, risospendere e recentrifuge come sopra. </li><li> Lavare due volte con mezzo di lavaggio, rimuovendo il supernatante ogni volta. </li></ol> 4. Enzimatica dissociazione <ol><li> Durante la fase 3.4, preparare la soluzione collagenasi unendo 0,22 g di tipo IV collagenasi e 44 ml di terreno di base (o quantità sufficiente a 0.11 g/0.22 ml). </li><li> Mescolare in un becher per 10-15 minuti a 4 ° C. Filtro sterilizzare con una siringa da 50 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron. NOTA: Più di un filtro a siringa può essere necessario, a seconda della preparazione collagenasi. Collagenase ottenuto da fornitori diversi Worthington Biochemical pone maggiori difficoltà durante la filtrazione. Collagenase viene utilizzata per dissociare legami peptidici in collagene che costituiscono l&#39;endomisio. Questodigestione rimuoverà la barriera protettiva delle miofibre. </li><li> Per ogni g di tessuto muscolare, risospendere il tessuto in una soluzione di collagenasi allo 0,2%. Per 5 g di tessuto muscolare, aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi e 15 ml di terreno base. </li><li> Aggiungere 10 ml di FPF per ml di collagenasi soluzione a medio / base (ad esempio, 250 ml a 25 ml). Assicurarsi che il tessuto è ben sospeso, in quanto questo influenzerà l&#39;efficienza della digestione enzimatica. </li><li> Incubare il tessuto muscolare in collagenasi per 60 minuti a 18 ° C con dolce dondolio. A seconda del grado di dissociazione meccanica e specie, collagenasi digestione può essere esteso a 90 minuti, anche se questo può influenzare la vitalità cellulare. </li><li> Seguendo tubi digestione collagenasi, centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere tessuto in 25 ml di terreno di lavaggio. </li><li> Recentrifuge a 300 x g per 5 minuti a 126; C. Ripetere con mezzo di lavaggio una seconda volta. </li><li> Dopo tessuto lavaggio due volte, risospendere tessuto muscolare in 25 ml di mezzo di lavaggio e triturare con 10 ml pipetta sierologica finché il tessuto / medio omogenato passa dentro e fuori della pipetta con relativa facilità. 5-10 triturazioni di solito è sufficiente. <ol><li> Ripetere con 5 ml pipetta sierologica e poi una cannula metallica 16 attaccato ad una siringa. </li></ol></li><li> Provette per centrifuga coniche a 300 xg per 5 minuti a 12 ° C. Decantare il surnatante. </li><li> Durante la centrifugazione sopra di 5 minuti, preparare la soluzione tripsina digestione combinando 0,25 g di tripsina con 5 ml di terreno base. </li><li> Agitazione a 4 ° C per 10-15 minuti e filtro sterilizzare con una siringa da 20 ml e 0,45 micron filtro a siringa. </li><li> Recuperare provette coniche e aggiungere 100 ml di soluzione di tripsina e 4,9 ml di mezzo di dissociazione per ogni 1 g di tessuto muscolare di ogni tubo. Per example, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina e 24,5 ml di dissociazione medio per 5 g di tessuto muscolare. NOTA: La tripsina è una serina proteasi che separerà cellule precursori miogenici dalla lamina basale. </li><li> Tessuto Risospendere in tripsina / dissociazione medie dimensioni, ben. Incubare per 20 minuti a 18 ° C. </li><li> Seguendo la prima incubazione tripsina, provette coniche centrifugare a 300 xg per 1 min a 12 ° C. </li><li> Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento. Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina. </li><li> Per il pellet residuo di tessuto, ripetere i passaggi 4,12-4,15, combinando il supernatante seguente passo 4.15 con il fluido supernatante / isolamento dalla prima digestione tripsina. </li><li> ALTERNATIVA: Le digestioni collagenasi e tripsina possono essere combinati per massimizzare le rese delle cellule. &lt;ol&gt; <li> A tale scopo, triturare la collagenasi digest utilizzando una cannula metallica (6 in lunghezza e 16 gauge funziona meglio) attaccato ad una siringa da 20 ml fino omogenato passa facilmente attraverso la cannula. </li><li> Per l&#39;omogeneizzato, aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina (preparato nella fase 4.10) e incubare a 18 ° C per 20 minuti. </li><li> Seguendo le provette di incubazione, centrifugare conici a 300 xg per 1 minuto a 12 ° C. </li><li> Neutralizzare tripsina combinando i surnatanti con terreno di isolamento ad una concentrazione di 1 volume di supernatante in 4 volumi di terreno di isolamento. </li><li> Conservare a 4 ° C durante la seconda digestione tripsina. </li><li> Procedere con il punto 4.18 come con il protocollo standard. </li></ol></li><li> Distribuire la miscela di medio surnatante / isolamento finale in 50 ml provette coniche e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 12 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante facendo attenzione a non disturbare la cellapellets. Pipettare 2 ml di terreno completo in ogni provetta, dissolvendo ogni pellet di cellule. </li><li> Combinare cellule sospese in terreno completo in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Risciacquare ogni provetta con 1 ml di terreno completo, combinandosi con il pool di cellule risospese in precedenza. </li><li> Triturare con una cannula metallica e siringa 5-10 volte. </li><li> Filtrare sospensione cellulare attraverso un filtro 100 micron cella, lavando con mezzo completo. </li><li> Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella 40 pm. </li><li> Aggiungere mezzo completo sufficienti a 50 ml e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 15 ° C. </li></ol> 5. Conteggio, diluizione e semina delle cellule <ol><li> Dopo la centrifugazione finale nel passo 4,25, rimuovere il surnatante da un&#39;attenta decantazione o con una pipetta sierologica. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di terreno completo. </li><li> Con le celle completamente risospese, rimuovere 20 pl; Della sospensione cellulare e posto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di Trypan colorante blu e attendere 5 minuti. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule vitali. </li><li> Su determinazione, diluire celle alla concentrazione necessaria. Teleosteo PPM sono meglio seminati a 150.000-200.000 cellule per cm 2. Per una strategia sei pozzetti placcatura, diluendo cellule a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 per ml supporta proliferazione e differenziazione sufficiente. </li><li> Recupera-L-lisina poli-trattati, piatti laminina rivestite e cellule di semi. (Vedi Tabella 5 per diluizioni specifico targa e volumi di placcatura.) Nota: La tabella 6 illustra numero medio di cellule isolate per grammo di tessuto muscolare isolati da varie specie di teleostei. La trota iridea (O. mykiss) esporre un minor numero di PPM per grammo di tessuto muscolare che fare zebrafish (D. rerio) e verrà quindi richiederà più pesce per isolare da per una corretta semina. </li><li> Sigillare piastre con nastro laboratorio e posto in incubatrice refrigerazione alla temperatura appropriata. PPM di tutte le specie qui elencate (salvo per i topi), possono essere incubate in condizioni atmosferiche normali senza anidride carbonica (CO 2) integrazione. (Vedi Tabella 7). </li><li> ALTERNATIVA: Alcuni laboratori hanno adottato un protocollo che richiede permettendo PPM di aderire al substrato di coltura per 40 minuti. <ol><li> Poi risciacquare piastre con mezzi di lavaggio per rimuovere eventuali cellule debolmente attaccate e non aderenti. Attenzione: Questo passaggio è molto importante per evitare l&#39;adesione &quot;non-specifico&quot; di altre cellule (ad esempio fibroblasti) alla substrati cultura. </li><li> Aggiungi mezzi di comunicazione completi e cellule posto in incubatrice e la cura per come di seguito dettagliato. </li></ol></li></ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Il programma miogenico, in qualsiasi specie esaminate, può essere più facilmente studiata attraverso un sistema in vitro. Infatti, sull&#39;isolamento, cellule precursori miogenici (PPM) in pesci o cellule myosatellite (MSC) nei mammiferi facilmente entrare in questo processo altamente regolato che coinvolge la proliferazione, ritiro ciclo cellulare e differenziazione terminale dei mioblasti e la fusione di questi mioblasti in miotubi nascenti. La generale mancanza di ceppi transgenici gene reporter di specie...

Notevole comprensione della miogenesi mammiferi è stato ottenuto attraverso la ricapitolazione di questo processo in entrambe mouse principale (Mus musculus) culture mioblasti e la linea cellulare derivata da topo ben descritto, C2C12 5. A partire dal 1950 6, queste culture hanno portato a molto progresso nella comprensione del programma murinemyogenic e, per estensione, miogenesi in altri vertebrati. Inoltre, monocellulari tecniche myofiber espianto hanno aumentato fuori comprensione delle interazioni tra le cellule satelliti e fibre muscolari che circondano 7-9. Colture cellulari sono particolarmente interessanti per le indagini di myogenesis a causa del poco tempo da precursore delle cellule differenziate 10, relativa facilità di trasfezione per RNAi 11-14, transgenici 15,16 e iperespressione studi 14,17,18, l&#39;espansione in vitro seguita da trapianto in vivo 18-20, e anche compArison di cellule precursori miogeniche e ai loro agenti di regolazione tutta taxa 21,22. Mentre le differenze dovute all&#39;ambiente artificiale del sistema di coltura sono stati descritti 5,23, questi sistemi in vitro hanno dimostrato di essere indispensabile al nostro dissezione del programma intricato regolamentano la formazione di multinucleate, myofibersfrom terminalmente differenziate mononucleate cellule progenitrici proliferative conosciuti come myosatellite cellule (MSC) tra i mammiferi. Al di fuori della classe Mammalia, tuttavia, la conservazione e / o divergenza di meccanismi che controllano myogenesis sono capiti male, soprattutto a causa della difficoltà di coltura di cellule precursori mioblaste (PPM) e mioblasti da diversi taxa. Infatti, colture primarie di mioblasti sono stati descritti solo in tre uccelli 24-26, un rettile 27, un paio di anfibi 28-30, e alcuni pesci 1,3,4,31-33. Linee cellulari continue miogeniche da vertebrates diversi roditori 34-36 sono ancora più rari, con l&#39;unica linea non-mammiferi miogenico delle cellule essendo derivata da quaglia giapponese (Cortunix japonica), QM7 37. Nonostante i molti tentativi di immortalization, una linea cellulare miogenico teleosteo rimane sfuggente e un protocollo per la trasfezione efficiente di queste cellule è stato pubblicato solo quest&#39;anno 15. Quindi, sono molto necessari protocolli chiari e ben ottimizzato per la coltura PPM primari e mioblasti da una varietà di vertebrati, non solo per espandere ulteriormente la nostra conoscenza dell&#39;evoluzione del programma miogenico, ma di utilizzare il potere della fisiologia comparata a fare progressi in il trattamento di malattie muscolari scheletriche ei disturbi umani. Mentre la letteratura contiene molte segnalazioni di MPC / mioblasti isolamento 38-49, è comune per gli autori per descrivere i protocolli per tali isolamenti in breve, spesso incompleti, formati. Inoltre, i protocolli più istruttivi pronti contro termineVALIDITA sono stati sviluppati per i topi 50-53, e alcuni di questi contare su selezione di anticorpi 54,55 o transgeni fluorescenza 56,57, rendendo questi protocolli inutilizzabile o impraticabili intimi specie di non roditori utilizzati dai biologi muscolari. Con poco conosciuto su piscine, anfibi, rettili e miogenesi, un protocollo dettagliato e approfondito, descritta con una guida audiovisiva e con efficienza dimostrata in specie lontanamente imparentati, sarebbe più utile per il campo. In primo luogo descritto da Powell e colleghi nel 1989 58, il seguente protocollo è stato inizialmente sviluppato per isolare PPM e mioblasti da pesci salmonidi (vale a dire, trota iridea, Oncorhynchus mykiss, e salmone atlantico, Salmo salar) e alcuni ciprinidi più grandi (ad esempio pesci rossi, Carassiusauratusauratus) . Nel 2000, Fauconneau e Paboeuf ottimizzati una cultura mioblasti primario per la trota iridea 59, e minoroptimizations made che il protocollo utilizzabile in diversi pesciolini piccoli del clade Danioninae (zebrafish, Danio rerio, e Danio giganti, Devario Aequipinnatus) 32 a causa dei molti strumenti genetici disponibili per il lavoro zebrafish e quindi i suoi parenti stretti. Pesci teleostei sono organismi interessanti per lo studio a causa della loro strategia di crescita divergente (almeno nella maggior parte delle specie). Grandi salmonidi, come la maggior parte dei pesci, crescono indeterminato, con un potenziale di crescita illimitato da parte di un asintoto alla scadenza, anche in età 60-62. A differenza di zebrafish, grandi danionins come il danio gigante 63 e potenziali di crescita visualizzazione Danio baffuti tipici dei pesci teleostei, rendendo la loro diretta giustapposizione una piattaforma ideale per capire se la scelta del destino cellulare MPC svolge un ruolo nella iperplasia muscolo scheletrico contro l&#39;ipertrofia. Allo stesso modo, abbiamo dimostrato che questo protocollo può essere utilizzato con topi e axolotl, con rendimento relativamente elevato cellulare e viabindici ility. Salamandre urodèle, come l&#39;axolotl messicano (Ambystomamexicanum), possiedono la straordinaria capacità di rigenerare i tessuti, anche di interi arti e code di 64-66. Questa caratteristica rende questi anfibi interessanti modelli di atrofia muscolare scheletrico e l&#39;invecchiamento. Utilizzando il protocollo descritto di seguito, un approccio simile può essere effettuata come è stato fatto in molte specie di pesce, fornendo un contesto comparativo ancora più ampia per tali studi. Come molti biologi veramente apprezzare comparativi, i progressi più significativi nel campo della biologia di base e traslazionale biomedicina possono essere fatte quando i dati vengono analizzati all&#39;interno dello spettro più ampio (qui, l&#39;intera stirpe dei vertebrati).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

A causa della difficoltà intrinseca e ora coinvolto con lo studio del programma miogenico in vivo, sistemi di coltura primarie derivate da cellule staminali adulte residenti del muscolo scheletrico, le cellule precursori mioblaste (PPM), si sono rivelati indispensabili per la nostra comprensione dello sviluppo dei mammiferi muscolo scheletrico e crescita. Soprattutto tra i taxa basali di vertebrati, tuttavia, i dati sono limitati descrive i meccanismi molecolari che controllano l&#39;auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione di PPM. Di particolare interesse sono i potenziali meccanismi che sottendono la capacità dei vertebrati basali a subire notevoli postlarval scheletrico myofiber iperplasia (cioè i pesci teleostei) e piena rigenerazione in seguito alla perdita appendice (cioè urodèle anfibi). Inoltre, l&#39;utilizzo dei mioblasti in coltura potrebbe aiutare nella comprensione della rigenerazione e la ripresa del programma miogenico e le differenze tra loro. Atal fine, si descrive nel dettaglio un protocollo robusto ed efficiente (e le variazioni in esso) per isolare e mantenere PPM e la loro progenie, mioblasti e miotubi immaturi, in coltura cellulare come piattaforma per comprendere l&#39;evoluzione del programma miogenico, a cominciare dal più vertebrati basali. Sfruttando il modello di status organismo del pesce zebra (Danio rerio), si segnala l&#39;applicazione di questo protocollo per piccoli pesci del clade ciprinidi Danioninae. In tandem, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare un approccio comparativo più ampio isolando PPM dal axolotl messicano (Ambystomamexicanum) e anche roditori da laboratorio. Questo protocollo è ora ampiamente utilizzato nello studio myogenesis in diverse specie di pesci, tra cui la trota iridea, salmone e orate 1-4.

Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule precursori miogeniche (PPM) devono essere visibili attaccato al substrato laminina (vedi figure 1a e 1d). Dopo la semina, le cellule (PPM) adottano una forma mandrino-like, indicativa di questo tipo di cellule (figura 1) e sono MyoD1 + (Figura 2). Nelle specie Danio, PPM sembrano essere più compatto, con piccoli processi bipolari che fanno PPM da Oncorhynchus e Salmo specie. Tuttavi...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltura primaria consente l&#39;identificazione di meccanismi di regolazione conservati e divergenti tutta i lignaggi vertebrati.

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Views.  University of Alabama at Birmingham.  La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltur...

Video: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

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Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabbricazione di miogenici Costrutti di ingegneria tessutale

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...