L&#39;autore ringrazia il Dott. Jin Gao per la sintesi PGS, il Dott. Peter Crapo di discussione penetranti bioreattore per l&#39;installazione, Drs. Mohamed Ezzelarab e Wei Wu per espianto babbuino arterie carotidi. Questo studio è stato supportato da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (R01 HL089658).

1. Ponteggio tubolare di fabbricazione <ol><li> Preparare tubo di vetro (lunghezza = 70 mm, diametro esterno = 9,0 mm, spessore parete = 1,0 mm; parti piccole, Miramar, FL) come stampo per ponteggio. </li><li> Preparare 1,0 peso / volume% acido ialuronico (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), sciogliendo 100 mg di HA in 10 ml di acqua deionizzata. Mescolare con un rotore durante la notte fino a quando non vi siano bolle d&#39;aria in soluzione. </li><li> Versare la soluzione HA 1,0% nella parte superiore del tubo di vetro. Lasciarla fluire lentamente lungo la parete interna dello stampo. Capovolgere il tubo quando la soluzione raggiunto il fondo dello stampo con il rotore e ripetere l&#39;operazione fino a quando la parete interna dello stampo è uniformemente rivestito dalla soluzione. </li><li> Dopo il rivestimento, asciugare tutte le tubazioni di vetro nel forno a vuoto a 37 ° C per 24 h. </li><li> Grind e particelle di sale setaccio (size = 25-32 micron), utilizzato come porogens. </li><li> Assemblare un tubo di vetro (interno rivestito con una soluzione di HA 1,0%), anima (in acciaio inox rivestito da tubi in PTFE), termoretraibili (HS) manica, e l&#39;anello in PTFE come descritto in precedenza 8. </li><li> Aggiungi particelle sale della dimensione desiderata per lo stampo di vetro con una spatola attraverso l&#39;imbuto in gomma siliconica. Toccare delicatamente lo stampo per garantire un&#39;equa distribuzione delle particelle di sale. Raschiare le particelle di sale in eccesso nella parte superiore dello stampo usando il lato della spatola. </li><li> Accendere l&#39;ibridazione incubatore per 30 minuti prima di trasferire il sale ricco di muffa. Spegnere l&#39;ibridazione incubatore e mettere il sale ricco di muffa nel ibridazione incubatore per la fusione di sale. </li><li> Togliere gli stampini dal ibridazione incubatore e asciugarli nel forno a vuoto a 37 ° C per 24 h. </li><li> Togliere il sale ricco di stampi da forno vuoto e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Rimuovere il mandrino in acciaio inox, spingendolo verso il basso con tenendo l&#39;anello in PTFE. Se il mandrino è troppo stretto per lo stampo, utilizzare le pinze ad ago per tirarlo fuori. Rimuovere l&#39;anello di PTFE dal fondo dello stampo. </li><li> Mettere gli stampi in forno a 120 ° C per 5 minuti a ridursi manica HS. Controllare se il manicotto HS si restringe. Rimuovere la copertura di SA dal sale ricco di stampi e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Tenere gli stampi in essiccatore fino a quando non vengono utilizzati. </li><li> Preparare la soluzione PGS sciogliendo 3 g di PGS in 15 ml di tetraidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) per formare un 20 wt / soluzione% vol. </li><li> Aggiungere la soluzione PGS al lume di sale ricco di stampi facendola cadere con un spoid nel cappuccio Hume. Magra lo stampo di vetro di circa 45 ° e rilasciare la soluzione PGS in lume interno con rotazione dello stampo lentamente. Controllare se la soluzione PGS scende lungo la parete di muffa. Se la macchia secca è osservato, aggiungere altre soluzioni. </li><li> Dopo aver aggiunto la soluzione PGS, luogo gli stampi nel cofano Hume per almeno 30 minuti per l&#39;evaporazione THF. </li><li> Mettere gli stampi in forno a vuoto per la pre-determinato tempo di maturazione (es. 24 / 36 / 48 h) a 100 mTorr e 150 ° C per PGS stagionatura. </li><li> Dopo la polimerizzazione, togliere gli stampini e metterli a temperatura ambiente per raffreddare. Immergere ogni stampo in acqua deionizzata con posizione verticale lentamente. Non immergerli in acqua perché il digiuno bolle d&#39;aria possono causare strappi al patibolo. </li><li> Trasferire gli stampi a bagnomaria con cura e metterli in un angolo per 1 h con tubo in silicone per sciogliere HA facilmente. Controllare se HA è sciolta dallo stampo. Se non HA è rilasciato dallo stampo, spingere la fine del patibolo lentamente con una spatola per liberarla dallo stampo. Ripetere questo passaggio all&#39;altra estremità del ponteggio e scuotere lo stampo avanti e indietro lentamente in bagnomaria. Controllare se il ponteggio viene spostato all&#39;interno dello stampo. </li><li> Trasferire il patibolo per un altro bagno di acqua con agitatore attenzione. Non afferrare il patibolo con fermezza, che potrebbe rompere il patibolo. Posizionare il patibolo nel bagnomaria per almeno 3 giorni cambiando l&#39;acqua per filtrare le particelle di sale. </li><li> Dopo lisciviazione particelle di sale, trasferire ogni impalcatura alla provetta da centrifuga 15 ml riempito con l&#39;acqua deionizzata e metterli in condizioni di asciutto-ghiaccio box per 1 ora di congelare. Mettere provette nel liofilizzatore (tutte le cabine tubo deve essere aperto) e liofilizzare li per 2 giorni. </li><li> Mettere tutti ponteggi in essiccatore prima fino a quando non vengono utilizzati. </li></ol> 2. Preparazione patibolo per la semina cella <ol><li> Estrarre ponteggi dal essiccatore e tagliarli come 25-30mm di lunghezza. </li><li> Preparare due tappi di gomma di silicone (diametro = 20 mm, spessore parete = 6.35 mm, diametro del foro centrale = 3 mm) e collegare due tubi in PTFE (diametro esterno = 3.97 mm, diametro interno = 2.38 mm, spessore parete = 0,79 mm, lunghezza = 60 mm e 40 mm) attraverso i fori centro di ogni tappo. </li><li> Tagliare un anello di HS come 1,5 mm di lunghezza e lo mise in cima ad una delle estremità del ponteggio. Inserire una tubi in PTFE (collegato tappo di gomma di silicone) in fine una delle impalcature più piccolo parte sovrapposte possibile. </li><li> Mettere il tubo di ponteggio e PTFE in forno a 120 ° C per 10 minuti a ridursi anello SA. Controllare se l&#39;anello SA si restringe e ponteggi sono collegati a tubi in PTFE con fermezza. </li><li> Estrarre il tubo ponteggio e PTFE e metterli a temperatura ambiente per raffreddare. Mettere il patibolo-PTFE assemblaggio tubo nel tubo di policarbonato (diametro esterno = 15,5 mm, diametro interno = 9 mm, lunghezza = 50 mm) come una camera di bioreattore. </li><li> Collegare un altro l&#39;estremità del tubo in PTFE al patibolo come passi 2.3) e 2.4). </li><li> Regolare due tappi di gomma di silicone per attaccare le loro superfici interne ad entrambe le estremità del tubo in policarbonato. Fissare entrambe le superfici esterne dei tappi di gomma di silicone a due piastre in lega di alluminio (alto e basso, larghezza = 20 mm, lunghezza = 70 mm, spessore = 6,35 mm). Mettere due barre filettate nel foro laterale della piastra e fissare il tubo di policarbonato (incluso l&#39;interno scaffold) per le piastre di serraggio dado pollice sulla piastra. </li><li> Misurare la lunghezza di ogni seedable patibolo (una lunghezza compresa tra due anelli SA) e calcolare l&#39;area della superficie interna (π x lunghezza x diametro interno seedable) di ogni impalcatura per la semina delle cellule. </li><li> Avvolgere una camera unità bioreattore con foglio di alluminio e sterilizzarlo in autoclave a 120 ° C per 30 min. Sterilizzare ogni parte (serbatoio media, i tubi delle pompe, scambiatori di gas, collettori e valvola a spillo) del bioreattore in autoclave a 120 ° C per 30 min e li assembla all&#39;interno della cappa colture cellulari. </li><li> Pre-trattamento e risciacquare impalcature con una serie di perfusione (70, 50, e 25% di etanolo per 1 h, PBS (PBS, Mediatech, Herndon, VA) per 2 ore e mezzo di coltura SMC per 24 ore utilizzando una pompa peristaltica a 1,0 ml / min nel circuito di flusso. </li></ol> 3. Semina delle cellule e Cultura <ol><li> Isolare cellule primarie arterie muscolari lisce (SMC) dalle arterie carotidee di giovani babbuini maschi (Papio Anubis) e caratterizzare in due-dimensionali (2D) cultura prima passaging e semina come descritto in precedenza 9. </li><li> Espandere SMC utilizzando il MCDB 131 di media (Mediatech, Herndon, VA) con il 10% di siero fetale bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% di L-glutamina (Mediatech), 50 mg / ml di acido ascorbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), e un antibiotico-antimicotico soluzione (10.000 UI / ml di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina, e 25 mg / ml di amfotericina B; Mediatech). </li><li> Staccare ogni camera bioreattore dal circuito di flusso nel bioreattore. SMC Seed (passaggio 4-6) al patibolo con una densità di 2x10 6 cellule / cm 2, iniettando sospensione con siringa da 5 ml nel lume di ponteggi, dopo il taglio sia abluminal (ingresso) e luminale (uscita) dei flussi. </li><li> Mettete tutte le camere bioreattore nel ibridazione incubatore a 37 ° C e ruotarle a 2 giri per le 4 ore per consentire alle cellule di diffondersi in modo uniforme al patibolo. </li><li> Estrarre camere bioreattore dalla ibridazione riattaccare incubatore a flusso circuito del bioreattore nel cappuccio. Trasferire tutto il sistema bioreattore nella cultura incubatore cellulare. </li><li> Collegare il tubo della pompa (diametro interno = 1,6 mm) per la cartilagine di pompa peristaltica e caricare mezzo fresco cultura nel serbatoio. Avviare il tramite parete perfusione (luminale a abluminal) a 1,0 ml / min per 15 minuti seguito da flusso luminale solo. </li><li> Aumentare la portata e la pressione gradualmente da 1,0 ml / min (stress lume di taglio: 1,1 dyne / cm 2) e 20 mmHg il giorno 1-14,2 ml / min (15,3 dyne / cm 2) e 120 mm Hg il giorno 21, rispettivamente. Cambiare il tubo della pompa (diametro interno = 3,2 mm) al giorno 4 e il mezzo una volta alla settimana. </li></ol> 4. Tessuto raccolta e preparazione del campione per l&#39;analisi <ol><li> Dopo 21 giorni di cultura, fermare la pompa e pinza tubi (ingresso e uscita) del serbatoio mezzo. Staccare il tubo della pompa dalla cartilagine di pompa peristaltica e bioreattori sistema di trasferimento all&#39;interno della cappa. </li><li> Morsetto di ingresso e uscita tubi di ogni camera di bioreattori e staccarlo dal ciclo di flusso. Aprire il tubo di aspirazione e di preparare un piatto a Petri-il tubo di uscita per raccogliere terreno di coltura all&#39;interno del tubo in policarbonato. Aprire il tubo di uscita lentamente e rimuovere il supporto dalla camera. </li><li> Staccare l&#39;ago abluminal manometro e tubi in silicone luminale dalla camera e staccare le piastre di alluminio attraverso il rilascio di viti ad alette. Rimuovere il tubo di policarbonato e staccare una delle estremità del tessuto costruire dal tubo in PTFE. </li><li> Preparare un piatto di Petri-riempite con 10 ml di PBS e staccare altra estremità del costruire dal tubo in PTFE. Mettere costruire in PBS e risciacquare tre volte. </li><li> Tagliare il costrutto con una lama di rasoio a 5 mm di lunghezza. Congelare congelatore a -80 ° C per analisi biochimiche o trasferirlo a 15 ml per centrifuga tubo riempito con 5 ml di terreno fresco per prove meccaniche o congelare scattano nelle Tissue-Tek mescola ottimale temperatura di taglio (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) per istologia / immunoflucolorazione orescence. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: I ponteggi tubolari PGS sono stati fabbricati utilizzando elastomeri biodegradabile con il metodo di fusione del sale (Fig. 1A). Ogni camera bioreattore fornito ponteggi con flussi sia luminale e abluminal e potrebbe essere distaccato come unità separata da un ciclo di flusso principale (Fig. 1B). Bioreattore sistema è stato progettato per la coltura quattro ponteggi in un momento di controllo e monitoraggio del flusso e di pressione (Fig. 1 C &amp; D). Schematica della cultura bioreattore è stato mostrato in fig. 2. Dopo la semina SMC, ciascuna camera bioreattore è stata ruotata a 37 ° C per 4 ore a distribuire uniformemente le cellule nel lume del patibolo. E poi, il flusso pulsatile è stato applicato a ponteggi fino al giorno 14 con portata via via crescente (Fig. 2A) e della pressione (Fig. 2B). Dopo il giorno 14, il flusso e la pressione mantenuta costante fino alla fine della cultura (giorno 21). Morfologia superficiale del patibolo PGS è stata esaminata da microscopia elettronica a scansione (SEM). Scansione microscopio elettronico ha mostrato che patibolo aveva parete coerente spessori (539 ± 18 micron) (Fig. 3A) e distribuiti in modo casuale macro e micro-pori sulla superficie luminale (Fig. 3B). Parametri morfometrici del patibolo è stato misurato da microcomputed tomografia (micro-CT) e analisi di imaging. Dimensione dei pori media è di 23,3 ± 3,9 micron e l&#39;interconnessione dei pori è 99,4 ± 0,62%, il che significa che tutti i pori sono completamente interconnessi in patibolo. Porosità misurata con spostamento etanolo è 75,6 ± 2,7%. Morfologia cellulare del costrutto PGS è stato esaminato da SEM (Fig. 4). SMC multistrato completamente coperto la superficie luminale ed erano orientato perpendicolarmente alla direzione del flusso. Questi risultati mostrano che il condizionamento meccanico da bioreattore flusso pulsatile supporta l&#39;orientamento SMC nel patibolo. La presenza della matrice extracellulare (ECM) e fibre elastiche sono stati esaminati dalla colorazione H &amp; E e elastina autofluorescenza (Fig. 5). Colorazione H &amp; E ha dimostrato che le cellule e proteine ​​ECM completamente ricoperto il lume della PGS costrutto. Elastina autofluorescenza ha anche mostrato circonferenza organizzato fibre elastiche sulla superficie luminale del costrutto. Produzione di proteine ​​ECM nei costrutti PGS sono stati misurati da test biochimici. L&#39;elastina insolubile e il contenuto di collagene era 20,2 ± 9,1 mcg / mg di tessuto e del 6,3 ± 1,9 mcg / mg di tessuto, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Impalcatura fabbricazione e il sistema di bioreattori. (A) Schema di ponteggio tubolare di fabbricazione. (B) camera di bioreattori. Ponteggi erano collegati a tubi in PTFE, posta nel tubo di policarbonato, e fissato da tappi di gomma di silicone e piastre in lega di alluminio. Ogni camera dispone di due percorsi di flusso: flussi luminale (da tubi in silicone) e abluminal (da gauge). (C) sistema di bioreattori posto all&#39;interno dell&#39;incubatore. Esso comprende serbatoio di media, modulo della pompa peristaltica, scambiatore di gas, trasduttori di pressione, due collettori (alto e basso) e valvola a spillo. (D) sistema di bioreattori collocato all&#39;esterno dell&#39;incubatrice. Esso comprende monitorare la pressione, unità di controllo di flusso, sistema di acquisizione dati, e il computer. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Schematica della cultura bioreattore. (A) protocollo Cultura. (B) applicata profili di pressione in ogni momento (giorno 1, 4, 7 e 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Morfologia superficiale del patibolo PGS. (A) Sezione. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Morfologia cellulare del PGS costrutto. (A) Lumen. (B) Sezione taglio di 45 °. Frecce in entrambe le figure rappresentano la direzione del flusso. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Istologia ed elastina autofluorescenza del PGS costrutto. (A) H &amp; E colorazione. (B) autofluorescenza elastina corrispondente. L: lumen. Ingrandimento: 40X. Scala grafica: 50 micron.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La tecnica di fabbricazione utilizzando un elastomero biodegradabile qui descritto ha caratteristiche diverse. (1) Abbiamo usato acido ialuronico (HA) in un comunicato stampo. Dal momento che HA è solubile in acqua, patibolo era facilmente liberato dallo stampo di vetro dopo aver immerso in acqua. In questo rapporto, abbiamo usato 1,0 peso / volume% di soluzione HA perché a bassa concentrazione (&lt;0,5 peso / volume%) di soluzione non è viscoso e scorre così velocemente quando ci si versa sulla parte superiore del tubo di vetro. Alla soluzione di cappotto HA uniformemente, abbiamo capovolto i tubi di vetro quando la soluzione volò giù nella parte inferiore del tubo e ripetuto questo passaggio. Questo rivestimento HA è una critica alla nostra procedura di fabbricazione per il rilascio ponteggi finale. (2) Abbiamo usato termoretraibile (HS) manica per trattenere i sali nel tubo di vetro. Dal momento che i sali erano densamente nello spazio tra la parete interna del tubo di vetro e la manica HS, HS manica mantenuto sali dopo aver rimosso mandrino e anello in PTFE nella parte inferiore del tubo. Potremmo togliere manica HS facilmente mettendo lo stampo in forno a 120 ° C per 5 minuti, e quindi ottenere il sale modelli tubolari. (3) Abbiamo usato il metodo di fusione del sale. E &#39;noto che la fusione metodo di sale in grado di migliorare l&#39;interconnessione dei pori e le proprietà meccaniche, variando il tempo di fusione 10. Inoltre, dal momento che abbiamo usato PGS, macro-pori sono stati prodotti dalle particelle di sale durante il processo di lisciviazione, mentre la micro-pori erano probabilmente generato dal vapore glicerolo formano durante PGS curare come abbiamo descritto in precedenza 11. Così, questo metodo ha un potenziale per fabbricare poroso ponteggi tubolari con diverse macro-e micro-strutture variando particelle di sale e PGS curare condizione. Il condizionamento meccanico dal bioreattore ha fornito perfusione flusso pulsatile (massima media di flusso = 14 ml / min, la massima sollecitazione di taglio = 15.3 dyne / cm 2, frequenza = 0,5-1,7 Hz) e fisiologicamente pressione pertinente con l&#39;impalcatura PGS, che ha portato alla SMC crescita e di orientamento (Fig. 4). Questi risultati sono coerenti con gli studi precedenti rapporti che si estendono ciclico a questa frequenza e lo stress di taglio aumenta la proliferazione SMC 12, e la produzione di proteine ​​ECM 13,14. Oltre alla crescita SMC e di orientamento, PGS costruire sostenuto la produzione di proteine ​​ECM, specialmente circonferenza organizzato fibre elastiche (Fig. 5) entro 3 settimane cultura del bioreattore. Alcuni studi con un elastomero patibolo come un piccolo diametro costruire arteriosa hanno dimostrato resistenza meccanica e la pressione di scoppio paragonabile ad arterie native 15, e una rapida integrazione SMC ponteggi compatibile con ogiva fiasco 16,17, mentre le fibre elastiche non sono stati trovati in questi costrutti. I nostri risultati suggeriscono che la distensione ciclico radiale dal bioreattore migliorato trasduzione del segnale meccanico in modo più efficace di SMC in PGS patibolo, che probabilmente ha contribuito alla sintesi di elastina e di organizzazione. Dal SMC vascolari sono state le uniche cellule che producevano proteine ​​ECM nel nostro approccio, endotelio quiescente e migliorare la resistenza meccanica sono necessarie per sviluppare una clinica di successo costruisce arteriosi di piccolo diametro. Ci hanno riferito che le cellule endoteliali co-coltura con SMC generato un monostrato confluente e sostenuto l&#39;espressione della proteina fenotipo sotto i nostri condizioni di coltura e di condizionamento meccanico 9. Pertanto, sulla base delle nostre approccio qui descritto, modifiche di co-coltura condizioni di esperimento sarebbe un passo successivo per migliorare le funzioni di costrutti che ne risulta e generare nonthrombogenic, robusto, e compatibile con arteriosa costruire simili alle arterie native.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Acido ialuronico sale sodico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetraidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CV </td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotico soluzione </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek mescola ottimale temperatura di taglio, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

elastomeric pgs scaffolds in arterial tissue engineering

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti e soprattutto, malattia coronarica aumenta con l&#39;invecchiamento della popolazione e l&#39;aumento dell&#39;obesità 1. Attualmente, la chirurgia di bypass utilizzando vasi autologhi, trapianti e innesti sintetici sono conosciuto come un comunemente usato per i sostituti arteriosa 2. Tuttavia, questi innesti hanno applicazioni limitate quando un diametro interno delle arterie è inferiore a 6 mm a causa della scarsa disponibilità, complicanze trombotiche, mancata corrispondenza rispetto, e alla fine iperplasia intimale 3,4. Per superare queste limitazioni, l&#39;ingegneria dei tessuti è stata applicata con successo come alternativa promettente per sviluppare costruisce arterie di piccolo diametro che sono nonthrombogenic, robusti e conformi. Diversi studi precedenti hanno sviluppato costruisce arteriosi di piccolo diametro con tri-struttura lamellare, eccellenti proprietà meccaniche e la pressione di scoppio paragonabile ad arterie native 5,6. Mentre elevata resistenza alla trazione e pressione di scoppio, aumentando la produzione di collagene da un materiale rigido o cella foglio patibolo, questi costrutti ancora bassa produzione di elastina e di conformità, che è un grosso problema per causare il fallimento dell&#39;innesto dopo l&#39;impianto. Considerando questi aspetti, abbiamo ipotizzato che un elastomero biomateriale combinato con condizionamento meccanico fornirà elasticità e condurre segnali meccanici in modo più efficiente alle cellule vascolari, che aumentano la produzione della matrice extracellulare e supporto all&#39;orientamento cellulare. L&#39;obiettivo della presente relazione è quello di introdurre una tecnica di fabbricazione di poroso ponteggi tubolari e un condizionamento meccanico dinamica di applicazione a ingegneria dei tessuti delle arterie. Abbiamo usato un elastomero biodegradabile, poli (sebacato glicerolo) (PGS) 7 per la realizzazione di ponteggi tubolari poroso dal metodo di fusione del sale. Adulto primaria cellule muscolari lisce babbuino (SMC) sono stati seminati sul lume di ponteggi, che colta nel nostro bioreattore progettato flusso pulsatile per 3 settimane. Ponteggi PGS aveva spessore costante e distribuiti in modo casuale macro e micro-pori. Condizionamento meccanico da bioreattore flusso pulsatile supportato SMC orientamento e una maggiore produzione di ECM in ponteggi. Questi risultati suggeriscono che i ponteggi elastomerici e condizionamento meccanico della cultura bioreattore può essere un metodo promettente per l&#39;ingegneria tissutale arteriosa.

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

PGS elastomerico ponteggi con cellule muscolari lisce vascolari in coltura in un bioreattore flusso pulsatile può portare a promettenti costruisce arterie di piccolo diametro con la produzione ECM nativo in un relativamente breve periodo di coltura.

PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Views.  University of Pittsburgh. PGS elastomerico ponteggi con cellule muscolari lisce vascolari in coltura in un bioreattore flusso pulsatile può portare a promettenti costruisce arterie di piccolo diametro con la produzione ECM nativo in un relativamente breve periodo di coltura.

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

L&#39;ingegneria dei tessuti del colon in un modello murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Ricerca

Bioingegneria

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per l&#39;ingegneria tissutale

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l&#39;ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Methods Article

PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso