Gli autori desiderano ringraziare Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) per il suo supporto tecnico per sviluppare bioreattori e l&#39;incubatrice bioreattore.

1. Decellularization del BioVaSc <ol><li> Sciacquare il sistema vascolare del segmento digiunale suina tramite accesso arterioso cannulato e lume intestinale con PBS -. Ripetere l&#39;operazione fino a quando non è completamente pulito. </li><li> Preparare un serbatoio di vetro 200 mm di diametro con 4 adattatori e collegarli tramite tubi in silicone alla pompa peristaltica (Ismatec). La pressione di controllo unità può essere monitorato tramite un sensore di pressione collegato ad una cupola monouso sterile (vedi Figura 1). </li><li> Riempire bottiglie serbatoio con la soluzione decellularization (DZ) e controllare il sistema di tubi per eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Collegare lume intestinale con fascette ai connettori di vetro per il flusso luminale. Pompa 500 ml soluzione DZ in accesso arterioso rosso (Figura 1B) del sistema vascolare. Interrompere il processo di pompaggio ogni 15 minuti a poco a premere manualmente l&#39;intero lume intestinale. </li><li> Durante la decellularizatisul processo, la pressione della soluzione tampone deve essere compresa tra 80 - 100 millimetri Hg, sul modello della naturale pressione sanguigna. </li><li> Lavare il BioVaSc con PBS - finché non è privo di residui cellulari (&quot;completamente bianchi&quot;). </li><li> Riempire il BioVaSc completamente con la soluzione DZ ed incubare immergere in una soluzione DZ tutta la notte a 4 ° C sul dondolo shaker. </li><li> Ripetere passo 1.6. </li><li> Posizionare il BioVaSc in soluzione DNasi e incubare per tutta la notte a 4 ° C su agitatore a dondolo. </li><li> Rimuovere la soluzione di DNasi e risciacquare con tampone di lavaggio. </li><li> γ-sterilizzazione con 25 kGy </li></ol> 2. I diversi tipi di cellule 2.1 L&#39;isolamento di cellule primarie umane dermica microvascolare endoteliali (mvECs) e fibroblasti <ol><li> Tagliare biopsia della pelle (preferibilmente preputium), in strisce di 2-3 mm di larghezza con bisturi e risciacquare li 3x con PBS - soluzione. </li><li> Coprire il tessuto con la soluzione dispasi e incubare per 16-18 ore a 4 ° C. </li><li> Epidermide separate dal derma con 2 pinze e trasferire sia separatamente che in capsule di Petri riempite con PBS +. </li><li> Derma Sciacquare strisce 1x con Versene. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione Tripsina / EDTA al derma strisce e incubare in incubatrice per 40 min. </li><li> Fermare la reazione enzimatica immediatamente con 1% FCS. </li><li> Trasferimento strisce di pelle per una piastra di Petri riempita con VascuLife e graffiare fuori ogni striscia con il bisturi 8x ogni lato, aggiungendo un po &#39;di pressione. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare prodotto attraverso un colino cellule in una provetta da centrifuga e risciacquare 3x colino cella con VascuLife. </li><li> Centrifugare la provetta a 1.200 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare con VascuLife. </li><li> Per isolare i fibroblasti, derma chop nastri in piccoli pezzi con il bisturi. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi al derma pezzi. </li><li> Incubare per 45 min in incubatrice, quindi centrifugare e rimuovere con attenzione supernatant. </li><li> Lavare 1x pellet con DMEM + 10% FCS +% PenStrep, centrifugare e rimuovere con attenzione il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in terreno di coltura e trasferirlo in un pallone di coltura T75 per permettere alle cellule di crescere fuori del tessuto. </li></ol> Linea 2.2 Tumore cellulare S462 La linea di cellule tumorali S462 (gentilmente fornito dal Dr. Nikola Holtkamp, ​​Charité Università di Medicina di Berlino) è stata generata da un nervo periferico guaina tumore maligno di una paziente con la sindrome di predisposizione ereditaria di tipo tumorale neurofibromatosi 1 9. S462 sono coltivate in DMEM supplementato con 10% FCS. Piano deve essere cambiato ogni 2-3 giorni. Una volta alla settimana le cellule devono essere divisi. 3. Tumore Sistema di prova: statici Culture Condizioni Rispetto Cultura dinamico In bioreattori Sistemi <ol><li> Tagliare il tubolare SIS-MUC aperto su un lato e fissarlo tra due anelli in metallo (corone cellulari, diametro 10 mm, angolo constructed). Coprire il SIS-Muc nella cella terreno di coltura durante la notte. </li><li> Cellule sementi isolato in numero di cellule definite (vedi sotto) su uno o entrambi i lati del SIS (mono o co-coltura di set-up). <ol><li> Seme 8.000 cellule / cm 2 di mvECs primarie in un volume totale di 100 microlitri sulla superficie basolaterale della SIS (ex sierosa). 3 ore dopo riempire la vasca con il mezzo per assicurare una cultura sommersa. </li><li> Consentono alle cellule endoteliali di aderire per 3 giorni. Capovolgere il sistema di coltura statica di 180 ° e trasferirlo in un 12-pozzetti. </li><li> Inizializzare una miscela di fibroblasti dermici primari (8.000 cellule / cm 2) e cellule tumorali (15.000 cellule / cm 2) in un volume totale di 500 microlitri sulla superficie apicale della SIS (il lato delle ex lumen). </li><li> Consentono alle cellule di aderire per 3 ore e riempire il pozzo di fluido (coltura sommersa, medio: 50% Vasculife + 50% DMEM supplementato con 10% FCS). </li><li> Il sistema di prova tumore è coltivato in condizioni statiche aT 37 ° C, 5% CO 2 in incubatrice per ulteriori 14 giorni. Cambiare mezzo di coltura ogni 2 - 3 giorni. </li></ol></li><li> Per la cultura dinamica, fissare il SIS-Muc tra due anelli di metallo e sementi mvECs primari come descritto in 3.2.1. Dopo 3 giorni rimuovere il SIS-MUC dagli anelli metallici e inserire la membrana nel reattore a flusso (vedere Figure 2C e 2D). Applicare la fibroblasti dermici e cellule tumorali primaria con una siringa e cannula sulla matrice nel bioreattore, e permettono alle cellule di aderire per 3 ore prima di riempire il bioreattore con mezzo di coltura. </li><li> Nelle seguenti condizioni di coltura dinamici giorno con costante flusso medio (3,8 ml / min, 37 ° C e 5% CO 2) può essere avviato. La cultura dinamica viene mantenuta per 14 giorni, mezzo di coltura viene cambiato dopo 7 giorni. </li><li> La configurazione di prova dinamica è colta in un incubatore di auto-costruito che fornisce un flusso multimediale tramite una pompa e la temperatura necessaria e CO 2 </sub&gt; Contenuto. </li></ol> 4. Metodi di caratterizzazione per l&#39;analisi 4.1 Fissaggio e inclusione in paraffina della matrice di collagene seminato <ol><li> Per (immuno-) caratterizzazioni istologici rimuovere il terreno di coltura e fissare il tessuto con paraformaldeide 4% per 2 ore. </li><li> Rimuovere paraformaldeide al 4% e trasferire il SIS dalla inserto metallico di una cassetta tessuto incorporamento. Innaffiare il tessuto per rimuovere restante fissativo e disidratare per l&#39;infiltrazione di paraffina. </li><li> Prima di incorporare in un blocco di paraffina, tagliare il SIS in 2 - 3 fette e metterle in uno stampo di base metallica di paraffina pieno in modo che le superfici di taglio rivolti verso il basso. Aggiungere la cassetta tessuto sulla parte superiore dello stampo come supporto. </li><li> Tagliare 5 micron fette e galleggiare su un bagno di acqua a 40 ° C per la raddrizzatura, quindi montare i vetrini sulla adatti vetrini. Vetrini non patinati sono utilizzati per H &amp; E macchie, diapositive polilisina rivestita per la colorazione immunoistologico per migliorare allegato.Lasciate asciugare bene le fette. </li><li> Melt paraffina, rimuoverla con xilene e reidratare le fette con il seguente colorazione. </li></ol> 4.2 Colorazione <ol><li> Le fette reidratati possono essere colorati con ematossilina / eosina come una panoramica colorazione standard. </li><li> Per la colorazione immunhistological, fissa e fette di tessuto paraffina-infiltrati devono essere sottoposti ad un recupero di un antigene per consentire anticorpi riconoscono e si legano a loro epitopi specifici. Pertanto, deparaffinati e reidratati vetrini sono posti in un forno a vapore con tampone citrato riscaldata (pH 6,0) per 20 min. </li><li> Trasferire i vetrini a tampone di lavaggio (0,5 M tampone TBS + 0,5% Tween) e fette cerchio con una penna PAP ridurre al minimo il volume richiesto per soluzioni coloranti. </li><li> Mettere il vetrino in una camera di umidità. Per garantire una determinata visualizzazione perossidasi di rafano-mediata di antigene-anticorpo vincolante, la perossidasi endogena deve essere saturato con 3% di perossido di idrogeno. </li><li> ANTIB primariadiluizioni ody vengono applicati alle fette, incubate per 1 ora a RT e accuratamente lavati con tampone di lavaggio. </li><li> Per il rilevamento di specifiche associazioni antigene-anticorpo Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) viene usato secondo il protocollo raccomandato. </li><li> I nuclei sono di contrasto con ematossilina per 1 min. </li><li> I vetrini sono montati con un mezzo acquoso, essiccato e ripreso con un microscopio inverso. </li></ol>

<ol>
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M., Petersen, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+tissue+engineering+technology+platforms+into+cancer+research.">Translating tissue engineering technology platforms into cancer research.</a> J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Yang, S. -. T., Zhang, X., Wen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbioreactors+for+high-throughput+cytotoxicity+assays.">Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).</li><li>Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering:+matrix+preparation,+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model.">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Quando si confrontano i sistemi di coltura 2D e 3D nella ricerca del tumore, sistemi 3D, pur essendo il metodo più costoso, hanno dimostrato di simulare le condizioni di microambienti biologiche meglio. È stato dimostrato che alcune cellule tumorali crescono molto più lento in una cultura 3D che in una cultura 2D comune 12, che è in accordo con la situazione in un vero tumore. Bissell e collaboratori hanno dimostrato nel loro lavoro che il comportamento delle cellule mammarie cancerogene riflette la situazione in vivo, compresi morfologia e segnalazione cellulare, più precisamente quando una cultura 3D all&#39;interno di una matrice offre interazioni cellula-ECM. Inoltre, hanno sottolineato l&#39;importanza dell&#39;ambiente extracellulare in 3D dimostrando che cambiamenti nelle interazioni ambientali hanno portato alla reversione delle cellule maligne ad un fenotipo normale. Inoltre, e cosa più importante, questi risultati potrebbero anche essere confermate in modelli animali in vivo 10,11. ONTENUTO &quot;&gt; Il confronto diretto di esperimenti in vivo e in modelli animali in vitro di tessuto rivela vantaggi e svantaggi in entrambi i sistemi. Un vantaggio di modelli in vitro è l&#39;autorizzazione di una migliore tempo reale o immagini fisse mediante microscopia. Una limitazione è che imitano condizioni statiche o di breve durata, mentre i sistemi in vivo spesso progrediscono. L&#39;attuale mancanza di vascolarizzazione e normale trasporto di piccole molecole, ospiterà le risposte immunitarie, e altre interazioni cellula-cellula sono ulteriori svantaggi dei modelli in vitro 12. Pertanto, 3D sistemi in vitro, come presentato in questo studio offrono una promettente Oltre alla sperimentazione animale. Essi forniscono una migliore comparabilità per l&#39;organismo umano e quindi ridurre al minimo fraintendimenti sperimentali. Biomimetic in sistemi modello in vivo sarà quindi diventerà più rilevante per studiare come il cancro e la diffusione metastatica dipende sulle condizioni microambientali che regolano tumorigenesis 11. Il nostro studio mostra che l&#39;ambiente 3D fornito dal SIS-MUC porta ad una maggiore formazione di tessuto tumorale della cellule, che non si osserva nella cultura comune cella 2D (Figura 3A). Inoltre, l&#39;uso di cellule primarie derivate da biopsie tumorali è un passo molto importante verso medicina personale, una disciplina che mira ad individuare il miglior trattamento a seconda delle esigenze individuali del paziente. Incorporando cellule tumorali paziente-specifiche primari isolati da materiale bioptico consentirà di sperimentazione in vitro di strategie terapeutiche. Tali sistemi di test consentiranno di indagare diversi farmaci e loro combinazioni in un tempo e high-throughput screening di risparmio di costi. Inoltre, l&#39;integrazione di cellule stromali del tumore-associato, come mostrato in questo studio è importante per l&#39;approccio personalizzato, poiché progressione influenze microambiente del tumore tumore 13 e potrebbe rivelarsi come AdattaLe obiettivo terapeutico. In alternativa ad un approccio personalizzato, il nostro modello di tumore può essere modificato per servire come sistema di test tumore generalizzato dall&#39;incorporazione di linee cellulari tumorali stabiliti. Questo è un adattamento promettente per scopi di ricerca di base. Per entrambi droga test avvicina alla presenza di una struttura vascolare è richiesto di verificare la distribuzione e l&#39;assorbimento delle sostanze terapeutiche. La matrice SIS-Muc permette la semina basolaterale con primario MVEC per gli studi barriera di assorbimento, la risemina delle strutture vascolari conservati della BioVaSc migliorerà ulteriormente lo studio della consegna della droga. Al fine di creare modelli di tessuto, una matrice biodegradabile 3D può essere utilizzato come struttura per una co-coltura di diversi tipi di cellule 14. L&#39;uso di tali matrici 3D è spesso limitato dalla mancanza di vascolarizzazione funzionale. Questo problema può essere risolto con l&#39;uso del BioVaSc, che offre conservato str vaso sanguignoutture, che può essere reseeded con le cellule endoteliali. Inoltre, il BioVaSc fornisce componenti extracellulari, che garantiscono l&#39;adesione delle cellule e facilitano la differenziazione dei tessuti. Esso consente anche la funzione specifica del tessuto di lunga data di tessuti 3D bioartificiali 7,8,15. Il presupposto per l&#39;ingegneria dei sostituti vascolari funzionali è il mimetismo della fisiologica umana e delle condizioni biomeccaniche. Pertanto, bioreattori, che possono implementare questi requisiti in vitro, sono di estremo interesse per la creazione di modelli tumorali biologici. La combinazione del BioVaSc, la tecnologia bioreattore e co-coltura di diversi tipi di cellule è un metodo molto promettente per generare tessuti tumorali vascolarizzati, che permetteranno lo studio dei meccanismi rilevanti per la progressione del cancro come angiogenesi e metastasi. Vediamo tali modelli tumorali come un approccio promettente per integrare gli studi sugli animali, fornendo un equivalentealla fisiologia tumore umano.

Nuovi farmaci devono essere validati in relazione alla loro qualità, sicurezza ed efficacia prima autorizzazione alla commercializzazione. Ad oggi, la sperimentazione animale sono il metodo standard per droga test e validazione. Tuttavia, a causa delle differenze specie-specifici, esperimenti sugli animali spesso non globalmente valutare l&#39;effetto dei composti nell&#39;uomo 1. Per questa ragione, è importante generare modelli di tessuto umano che possono essere utilizzati per le prove in vitro di nuovi farmaci e sostanze. Uno dei punti focali del nostro gruppo è la creazione di modelli in vitro test con il nostro scaffold vascolarizzato biologica (BioVaSc) 2,3. Il BioVaSc può essere utilizzato come un sistema a matrice 3D statico o dinamico. Per la cultura statica, il porcino segmento digiunale decellularized (Small intestinale Sottomucosa SIS-Muc) è collocato in un inserto in metallo per la risemina delle cellule. Varie cellule, come il cancro e cellule endoteliali possono essere coltivate sulla forca. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Per cultura dinamica, il BioVaSc è collegato a un sistema di bioreattore che si applica in tutto il flusso vascolare o sulla superficie del ponteggio. Bioreattori attuali implementano stimoli biologici, meccanici o elettrici che agiscono sulla differenziazione o proliferazione di cellule 4. Per bioreattori nel campo della Tissue Engineering, il concetto di base è di simulare le condizioni nel corpo umano. In cui, le cellule sono ottenute un ambiente naturale in cui possono interagire tra loro e la loro matrice extracellulare circostante. Per la produzione di sistemi o trapianti di test in vitro, la capacità di mimare l&#39;ambiente naturale delle cellule con una struttura portante appropriata e sistema di bioreattore è critica 5. Pertanto, i dispositivi più complessi e tecnicamente impegnative devono essere sviluppati al fine di adempiere a tali compiti 6. E &#39;inoltre possibile utilizzare scaffold per la establishment di un modello vascolarizzato causa delle strutture tubolari conservati, che includono l&#39;arteria alimentazione, vena, e il letto capillare collegamento. Tutte le cellule suina devono essere rimossi da decellularization chimica, meccanica ed enzimatica, e l&#39;impalcatura gamma-sterilizzato. Le strutture vascolari tubolari restaurati possono essere successivamente reseeded con le cellule endoteliali microvascolari umane usando un ricircolo perfusione bioreattore 7, che imita i parametri biomeccanici e / o biochimici come pH, temperatura, pressione, apporto di sostanze nutritive e la rimozione dei rifiuti 6. La ri-endotelizzazione delle strutture tubolari crea un equivalente umano all&#39;interno del vaso sanguigno scaffold 3,7 collagene. Nella fase successiva, la superficie degli ex lumen (mucosa) può essere seminato con cellule umane primarie per stabilire co-culture 3,7,8. In questo studio un sistema di test tumore 3D è impostato mediante co-coltura di una linea cellulare di tumore primario stcellule Romal in condizioni statiche e dinamiche sul SIS-Muc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

Il cancro è una delle principali cause di morte nel mondo. Strategie terapeutiche attuali sono prevalentemente sviluppate in sistemi di coltura 2D, che riflettono adeguatamente le condizioni fisiologiche in vivo. Matrici biologiche 3D forniscono cellule un ambiente in cui le cellule possono auto-organizzarsi, permettendo lo studio dell&#39;organizzazione dei tessuti e la differenziazione cellulare. Tali ponteggi possono essere seminati con una miscela di diversi tipi di cellule per studiare cellula-cellula-interazioni dirette 3D. Per simulare la complessità 3D dei tumori del cancro, il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di test 3D in vitro del tumore. I nostri modelli 3D sistema di test tessuto la situazione in vivo di tumori maligni dei nervi periferici guaina (MPNSTs), che abbiamo instaurato con la nostra decellularized suina segmento digiunale derivata scaffold vascolarizzato biologico (BioVaSc). Nel nostro modello, abbiamo reseeded una matrice BioVaSc modificato con fibroblasti, cellule endoteliali microvascolari (mvECs) e la linea cellulare tumorale S462. Per la cultura statica, la struttura vascolare del BioVaSc viene rimosso e l&#39;impalcatura rimanente viene tagliato aperto su un lato (Small Intestinal Sottomucosa SIS-MUC). La matrice risultante viene poi fissato tra due anelli in metallo (corone cellulari). Un&#39;altra opzione è quella di coltura la cellula-seminato SIS-Muc in un sistema di bioreattore flusso che espone le cellule a sollecitazioni di taglio. Qui, il bioreattore è collegato ad una pompa peristaltica in un incubatore autocostruito. Un computer regola l&#39;ossigeno arterioso e di nutrienti attraverso parametri come la pressione sanguigna, temperatura e portata. Questa configurazione consente una cultura dinamica sia con pulsatile-regolato pressione o flusso costante. In questo studio, abbiamo potuto stabilire con successo sia un sistema di coltura 3D statico e dinamico per MPNSTs. La capacità di modellare i tumori del cancro in un ambiente più naturale 3D consentirà la scoperta, la sperimentazione e la validazione difuturi farmaci in un modello umano-simili.

Come mostrato nella Figura 1B, si decellularized segmento digiunale suini (circa 2 m di lunghezza e 20 mm di diametro) con strutture tubolari conservati della rete capillare. Dopo chimica, enzimatica e meccanica decellularization, abbiamo ottenuto un ponteggio collagene I / III, che può essere utilizzato per colture cellulari 3D. Un test Feulgen è stata eseguita per dimostrare la purezza (non presentano residui di DNA) della matrice (dati non mostrati). Figure 2A e 2B mostrano la coltura statica di SIS-MUC assicurata dalle corone cellulari. Abbiamo fissato il SIS-MUC in un bioreattore in-casa progettata (Figura 2C) per cultura dinamica. Figura 2D illustra il flusso dinamico simulato attraverso la camera del bioreattore. Il bioreattore è posto in un incubatore sistema autocostruito e collegato con una pompa peristaltica. Questa configurazione consente una cultura dinamica sia con-regolato pressione di flusso pulsatile o c<html> flusso onstant. Figura 3 fornisce una panoramica della linea cellulare in coltura staticamente S462 tumore in monocoltura 2D (Figura 3A) e in 3D coculture (figure 3B-3D). Figura 3B mostra la cultura tripla di cellule tumorali S462 e fibroblasti primari sul lato apicale SIS -Muc (ex squadra lume interno) e MVEC sul lato basolaterale (ex squadra sierosa). L&#39;identificazione di tipi cellulari diversi è possibile mediante colorazione marcatori specifici di tipo a cella, come fattore di von Willebrand etichettare MVEC (Figura 3C). Le cellule S462 p53-positive possono essere distinte dai fibroblasti primari p53-negativa (Figura 3D) e la distribuzione 3D di cellule può essere analizzato. Figura 4 mostra colorazioni equivalente alla figura 3 della cultura tripla colta dinamicamente. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Decellularization set-up. (A) bioreattore e pompa di set-up per decellularizing il BioVaSc, controllato da un PC. (B) decellularized BioVaSc in vasca di vetro. Il lume e l&#39;ingresso arterioso sono collegati agli adattatori. . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figura 2. Più di vista delle diverse culture set-up. (A) vista in sezione CAD del sistema di coltura statica in pozzetti delle micropiastre, (B) inserti metallici per coltura statica, (C) simulazione del flusso medio (velocità [m / sec]) per coltura dinamica del coperchio superiore del bioreattore flusso , (D) bioreattore flusso per cultura dinamica collegato alla pompa peristaltica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figura 3. Panoramica della caratterizzazione immunoistologico del modello di tumore 3D statico. (A) colorazione con ematossilina del staticamente colta cultura mono 2D di cellule S462 su un vetrino Permanox, (B) H &amp; E macchia della cultura tripla 3D staticamente colta, frecce indicano le cellule endoteliali, (C) colorazione immunoistochimica per il fattore di von Willebrand, (D ) colorazione immunoistochimica per p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> <img alt="Figura 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figura 4. Panoramica della caratterizzazione immunoistologico del modello di tumore 3D dinamico. (A) H &amp; E macchia della cultura tripla 3D colta in modo dinamico, le frecce indicano le cellule endoteliali, (B) colorazione immunoistologico per il fattore di von Willebrand, (C) colorazione immunoistochimica per p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a>

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Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Sono descritti metodi per creare tessuti tumorali 3D umani come sistemi di test. Queste tecnologie si basano su un decellularized biologica vascolarizzato impalcatura (BioVaSc), cellule umane primarie e una linea di cellule tumorali, che possono essere coltivate in condizioni statiche e in condizioni dinamiche in un bioreattore flusso.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

21.2K Views.  University Hospital Würzburg.  Sono descritti metodi per creare tessuti tumorali 3D umani come sistemi di test. Queste tecnologie si basano su un decellularized biologica vascolarizzato impalcatura (BioVaSc), cellule umane primarie e una linea di cellule tumorali, che possono essere coltivate in condizioni statiche e in condizioni dinamiche in un bioreattore flusso. 

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Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Ricerca

Bioingegneria

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l&#39;applicazione di Invasion Cancer Cell

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un Tessuto 3D combinata Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Polmone tumore per predire l&#39;efficacia della droga in specifici Sfondi mutazionali

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

Sistema con verticale V-curve forza: una valutazione 3D In Vitro di archi rettangolari elastici e rigidi

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...