Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Tutte le cure degli animali e gli esperimenti sono stati fatti in base a un protocollo approvato dalla Institutional Animal Care and Use Committee Duke University. Cocem3D derivava da una combinazione di protocolli precedentemente pubblicati 10,11 ed è stato applicato qui per studiare una cella enteroendocrine specifico utilizzando un PyyGFP giornalista del mouse 12. Questo metodo può essere facilmente applicato ad altre cellule di interesse utilizzando commercialmente disponibili topi reporter transgenici. Il metodo è descritto in tre sezioni: microscopia confocale Correlativo, serial blocco faccia microscopia a scansione elettronica (SBEM), e dati di rendering in 3D. Correlativa Microscopia confocale L&#39;obiettivo di questa sezione è quello di raccogliere un segmento di tessuto dal colon distale di dimensioni che permettono confocale correlative e di imaging SBEM. Il protocollo è il seguente: 1. La raccolta del Tissue <ol><li> Preparare10 ml di soluzione / ml di eparina 50 ug in PBS. </li><li> Preparare xilazina / ketamina anestesia magazzino mescolando 10 ml di ketamina (100 mg / ml) e 1 ml di xilazina (20 mg / ml). <ol><li> Diluire xilazina / ketamina disponibile 1: 4 in 0.1M PBS. </li></ol></li><li> Preparare 100 ml di soluzione fissativa contenente 4% paraformaldeide e 0.1% glutaraldeide in PBS. </li><li> Anestetizzare un mouse PyyGFP, da 6 a 10 settimane, con una dose letale di xilazina / ketamina anestetico. Iniettare l&#39;anestetico per via intraperitoneale a 0,15 ml per 20 g di peso del mouse. </li><li> Verificare il corretto anestesia del mouse pizzicando la coda o le dita dei piedi, e utilizzare pomata sugli occhi per prevenire la secchezza. </li><li> Utilizzare un flusso di pompa peristaltica variabile per perfusione fissativo intracardiaca 10. Utilizzando le forbici chirurgiche (13 cm di lunghezza), taglio aprire la cavità addominale per esporre l&#39;intestino, cuore e polmoni. Tenere il cuore con una pinza stretta modello curvo (lunghezza 12 cm) e inserire l&#39;ago a farfalla (19 G) dalla pompa peristaltica into sinistra ventricolo. Immediatamente, tagliate atrio destro con molla forbici dritto (lunghezza 4 mm). Profumato ad una velocità di 2 ml / min prima con soluzione di eparina per 1 min, e quindi con soluzione fissativo ghiacciata per 15 minuti fino a quando la coda del topo è completamente rigida. Nota: È molto importante perfusione a bassa velocità per evitare lo scoppio dei piccoli vasi nella mucosa intestinale. Scoppio di navi comprometterà ultrastruttura del tessuto. Se la perfusione è adeguata, il fegato dovrebbe impallidire di colore in 3-5 min. </li><li> Utilizzando piccole forbici aprire la cavità addominale e delle accise tutto il colon dalla confluenza con il cieco al retto distale. Collocare il tessuto in PBS ghiacciato. Mentre sommerso in PBS, taglio aperto con piccole forbici a molla i due punti lungo il mesentere. </li></ol> 2. dissezione e fissaggio segmenti del tessuto <ol><li> Usando un bisturi, tagliare circa 6 piccoli segmenti di tessuto (2 mm 2) dal colon distale. Effettuare questa operazione su un foglio of impronte dentarie e sommersa in poche gocce di PBS. </li><li> Post-fix i segmenti di tessuto in soluzione fissativa per 3 ore a 4 ° C. </li></ol> 3.-Micro dissezione blocchi di tessuto <ol><li> Preparare 5%-basso punto di fusione agarosio in PBS e tenerlo in un bagno di acqua a 45 ° C. </li><li> Incorpora i segmenti di tessuto in 5% basso punto di fusione agarosio con un piccolo contenitore di plastica, come la dimensione standard Tissue-Tek Cryomold. </li><li> Montare le sezioni incluse su una lama microtomo vibrante e riempire la vasca del buffer con PBS ghiacciato. </li><li> Tagliare 300 micron strisce di tessuto a 0,8 ampiezza e 0,04 mm Velocità / sec. Nota: A questo punto, le strisce di tessuto saranno sloggiati dal agarosio. </li><li> Re-incorporare 300 strisce di tessuto micron di agarosio e li montano sul microtomo perpendicolarmente alla lama del vibratome. </li><li> Utilizzando un vibratome, tagliare le strisce di tessuto per uno spessore di 50 micron. Nota: i blocchi di tessuto finali dovrebbero essere di circa 300 micron di larghezza x 50 micron di spessore. Questi dimensioni sono ottimizzati da esperimenti pilota confocale che hanno dimostrato che lo spessore del cellulare enteroendocrine è compresa tra 15-20 micron e lunghezza 30-70 nm del neuropod. Pertanto, l&#39;intera cella potrebbe essere contenuta all&#39;interno di un blocco di tessuto 300 micron di larghezza e 50 micron di spessore, se l&#39;orientamento della cella è parallela alla faccia del blocco tessuti. Variare queste dimensioni a seconda del tipo di tessuto e di cellule di interesse. </li><li> Conservare i blocchi di tessuto in PBS a 4 ° C. </li></ol> 4. confocale Imaging <ol><li> Preparare una soluzione colorante nucleare diluendo DAPI in PBS a 1: 4.000. </li><li> Incubare blocchi di tessuto in DAPI nucleare macchia per 5 min. Nota: colorazione DAPI facilita le singole cellule distinguere dai loro nuclei, che è utile per correlare le immagini confocale e SBEM. </li><li> Blocchi di tessuto montaggio su vetrino carica, aggiungere qualche goccia di PBS, e coprire con un vetrino. </li><li> Utilizzando un microscopio confocale, identificare bloccos con villi intatta e cellule PyyGFP di interesse e li ripreso ottenere z-stack sezioni ottiche. <ol><li> Utilizzare un obiettivo 20X / 0,8 Zeiss Piano Apochromat ottenere z-pile di 1 micron sezioni ottiche. </li><li> Per il z-stack, utilizzare i canali per 405 nm (DAPI) per determinare la relazione ad altre celle, 488 nm GFP endogena localizzare la cella di interesse, e il contrasto interferenziale differenziale (DIC) per determinare la posizione della relativa cella alla lumen. </li><li> Usa risoluzione di 1.024 pixel o superiore. </li></ol></li></ol> 5. Incorporare Blocchi in Agarose <ol><li> Preparare 10 ml di fissativo contenente 4% paraformaldeide e glutaraldeide al 2,5% in PBS. </li><li> Rimuovere i blocchi di tessuto dal vetrino aggiungendo accuratamente PBS nei bordi del vetrino per far scorrere il vetrino dal vetrino senza danneggiare il blocco di tessuto. Quindi, utilizzare un pennello fine arte di trasferire il blocco del tessuto dalla diapositiva a un 10,5 ml provetta contenente 4% paraformaldeide e 2.5% glutaraldeide fissativo. </li><li> Post-fix blocchi di tessuto O / N a 4 ° C. </li><li> Trasferimento blocchi di tessuto a PBS. Poi, incorporare blocchi appartamento a 5% basso punto di fusione agarosio da loro sandwich tra due vetrini. Nota: Incorporare i blocchi in un sottile strato di agarosio facilita manipolazione posteriore durante la colorazione. </li><li> Tagliare il agarosio in un quadrato e fare una tacca sul lato superiore della mano. Nota: Questo passaggio è necessario per mantenere l&#39;orientamento nei passaggi successivi. </li><li> Conservare blocchi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con PBS a 4 ° C fino ad ulteriore lavorazione. </li></ol> Serial Block-faccia microscopia elettronica a scansione (SBEM) In questa sezione, il blocco dei tessuti è preparato e ripreso con SBEM a basso ingrandimento. L&#39;immagine indagine della faccia blocco viene poi correlata con i dati confocali per identificare la regione contenente la cella di interesse. Una volta che la regioneè identificato, il tessuto viene ripreso con una risoluzione di 7 nm / pixel e fette di 70 nm. Questo è stato sufficiente a risolvere e distinguere grandi denso vescicole secretorie fondamentali dagli altri organelli. Nelle cellule enteroendocrine, questo tipo di vescicole varia tra 100 e 150 nm di diametro 13. Il protocollo è il seguente: 6. sezioni di tessuto colorazione <ol><li> Rimuovere il tessuto dal PBS e sciacquare tre volte, 5 minuti ciascuno, in 0.1 M tampone cacodilato. </li><li> Blocchi colorare per 1 h in 0,1% di acido tannico disciolti in 0,1 M tampone cacodilato per aumentare il contrasto delle membrane cellulari 14. </li><li> Effettuare la successiva colorazione e la disidratazione dei tessuti secondo il protocollo pubblicato 11. Dopo Deerinck et al. protocollo, preparare le seguenti soluzioni: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) portare soluzione aspartato; 3) acetato 1% uranile, e 4) ferrocianuro osmio tetraoxyde / potassio (OsO 4 / K ferrocianuro). Mescolare 4% OsO 4 e 2xK Ferrocianuro magazzino [0,3 g K Ferrocianuro e 0.86g Na Cacodylate in 10 ml di H 2 O] in rapporto 1: 1 per rendere OsO 4 / K ferrocianuro. Nota: Avere il tessuto incorporato in agarosio facilita la gestione durante la colorazione. Rimuovere con attenzione agarosio per la successiva infiltrazione della resina. </li><li> Campioni Sciacquare tre volte, 5 min ciascuna, in 0.1 M tampone cacodilato e poi si colorano con la soluzione OsO4 / K Ferrocianuro per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Sciacquare in ultra acqua pura per tre volte, 5 minuti ciascuno, e macchia con TCH per 30 minuti a 60 ° C. </li><li> Risciacquare con acqua ultra pura per tre volte, 5 min ciascuno e macchia con 2% OsO 4 (senza K ferrocianuro) per 60 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare di nuovo in acqua ultra pura per tre volte, 5 minuti ciascuno. </li><li> Macchia con 1% acetato di uranile O / N a 4 ° C. Risciacquare con acqua ultra pura per tre volte, 5 minuti ciascuno. </li><li> Colorazione con aspartato piombo per 30 minuti a 60 ° C. Risciacquare con acqua ultra pura per tre volte, 5 minuti ciascuno. </li><li> Disidratare i tessuti con il risciacquo in solutions con concentrazioni crescenti di etanolo. Risciacquare 2 volte, 5 min ciascuna, con il 50%, 75%, 85%, 95% e 100% di etanolo assoluto. Al termine, sciacquare sezioni con ossido di propilene due volte, 10 minuti ciascuno. </li></ol> 7. infiltrazione and Embedding sezioni di tessuto in resina <ol><li> Infiltrati i blocchi di resina utilizzando l&#39;apposito kit in commercio avaialble. Tessuti Incorpora in resina utilizzando un kit di EPON incorporamento. Preparare una miscela di resina di 48% Epoxy, 20% ml DDSA, 30% ml NMA, e 2% DMP30. Agitare miscela di resina vigorosamente per 5 min e quindi posizionare miscela sotto vuoto per 30 min per permettere bolle di venire in superficie. </li><li> Mescolare resina con ossido di propilene in rapporto 1: 1 e agitare vigorosamente. Rimuovere la disidratazione risciacquo finale da tessuti, e aggiungere resina miscelata con ossido di propilene. Luogo fiala con i campioni in un rotatore O / N e lasciare fiala esordiente. Il giorno dopo, aggiungere appena fatto in resina EPON e mescolare per 90 min a rotatori. </li><li> Incorpora blocchi in resina più piatta possibile da loro sandwich intra le diapositive di vetro che sono stati curati con distaccante liquido per evitare che si attacchino tra loro 15. </li><li> Una volta che i blocchi vengono piatta, curare i blocchi per un&#39;aggiunta 48 ore a 60 ° C. </li><li> Estrarre i vetrini a parte per rilasciare i blocchi. </li></ol> 8. Montaggio e Taglio Block Tissue for Imaging <ol><li> Sotto un ambito dissezione, corrispondere all&#39;orientamento dei blocchi tessuto incluse in resina con quella delle micrografie confocale per facilitare l&#39;identificazione delle regioni contenenti le cellule di interesse prima di tagliare il blocco. </li><li> Tagliare il blocco di resina incorporato manualmente fino a un micron blocco faccia ~ 500 x 500. </li><li> Montare il blocco piatto su un perno contenente epossidico conduttivo e asciugare per 30 min. Poi, porre il blocco su una superficie piana e asciutta O / N a 60 ° C. </li><li> Rivestire il blocco con colloidale liquido argento. Mantenere la sezioni di tessuto piano per presentare affettatura del blocco ad angolo retto per facilitare correlating micrografie blocchi viso e confocale seriali. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Immagine il blocco utilizzando un microscopio elettronico a scansione dotato di un sistema di SBEM (p .es., 3View). </li><li> Impostare sezione spessore iniziale a ~ 2 micron incrementi e tagliare fino al volto del tessuto emerge dal blocco. </li><li> Acquisire un&#39;immagine Surver di tutto il blocco faccia. </li><li> Utilizzando il software Fiji, prendere le misure sia del blocco faccia seriale e confocale microscopio per generare un denominatore e conto corrente per il campione deformazione durante la fissazione e la colorazione 16. </li><li> Individuare l&#39;area di interesse sulla faccia blocco moltiplicando il denominatore alle coordinate nelle immagini confocali. Utilizzare anche altre caratteristiche strutturali, come la posizione di microvilli, cellule caliciformi, o lamina propria, come riferimento. </li><li> Regione Immagine di interessi ad un 2,25 kV e 7 nm / pixel (o 15,147X ingrandimento) in modalità alto vuoto. Incrementi fetta devono essere impostatia 70 nm o meno. </li><li> Raccogliere i dati grezzi SBEM in formato .dm3 a 16 bit. </li></ol> 10. Ottimizzazione SBEM Immagini per segmentazione Surface <ol><li> Convertire immagini SBEM dal formato .dm3 grezzo a 8-bit .tiff. </li><li> Filtro .tiff immagini utilizzando un filtro 0,8 sfocatura nelle isole Figi. </li><li> Ridimensionare i dati impostati al 25% della dimensione originale e salvarla come una pila .tiff per minimizzare la quantità di memoria RAM necessaria per gestire il set. </li><li> Allineare la pila di immagini SBEM utilizzando il plugin Fiji &quot;allineamento lineare stack con SIFT&quot; in modalità di traduzione e ritagliato usando il plugin &quot;crop 3D&quot;. Nota: Il ritaglio aiuta a ridurre ulteriormente la quantità di memoria RAM necessaria per la segmentazione e volume rendering. </li></ol> Rendering dati in 3D 11. Microscopia confocale <ol><li> Ricostruire z-stack utilizzando la modalità di funzione &quot;superfici&quot; superano l&#39;automatico. Figura 1D, mostra una recostruzione di ciascun canale utilizzando l&#39;opzione liscio, dettaglio zona superfici a 0,126 micron, e come soglia di intensità assoluta. </li></ol> 12. Serial Block-face SEM Nota: la segmentazione manuale dei dati è una procedura che richiede molto tempo e in base alle funzioni che devono essere rese la procedura può richiedere diverse settimane. Segmentazione per i video e le cifre presentate in Bohórquez et al. 2014 8 è stato fatto manualmente e ci sono voluti circa 500 ore di lavoro. Si raccomanda di privilegiare le caratteristiche essenziali che necessitano di rendering prima di iniziare il processo di segmentazione. La procedura è come segue: <ol><li> Utilizzare lo strumento &quot;superfici&quot; in modalità di disegno e l&#39;opzione &quot;contorno&quot; alla modalità di 50 msec disegno per segmento manualmente il volume reso la cella di interesse. </li><li> Tracciare i contorni su ogni fetta di cella per più agevole il rendering o ogni 5 fette per il rendering più veloce. </li><li> Export im finaleetà utilizzando lo strumento &quot;fotografia&quot; con una risoluzione di almeno 300 dpi. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

Dr. Satish Medicetty è un dipendente di e riceve 100% stipendio da Renovo Neural Inc; tuttavia, questo non altera l&#39;adesione dell&#39;autore alle politiche JoVE alla condivisione dei dati e dei materiali. Nessun conflitto di interessi è dichiarato per rimanenti autori.

<html> Chemosensation gastrointestinale sta emergendo come un nuovo campo emozionante nella ricerca biomedica. Ciò è in gran parte a causa della scoperta dei recettori del gusto funzionali nelle cellule enteroendocrine 18. Studi successivi hanno dimostrato che le cellule enteroendocrine esprimono i recettori specifici per le sostanze nutrienti, tra cui carboidrati, lipidi e aminoacidi 5,6,19,20. Il fattore catalitico per queste scoperte è stato lo sviluppo di topi reporter, in cui le cellule sono enteroendocrine fluorescente 20. Abbiamo sviluppato uno di questi topi, il mouse PyyGFP, per studiare le cellule enteroendocrine del piccolo intestino e colon distale 17,21. Queste cellule sono interessanti perché secernono PYY e glucagone-like peptide 1, entrambi i quali sono induttori di sazietà 22,23. A quel tempo, un conto ultra-strutturale completa di queste cellule mancava, che abbiamo creduto era essenziale per comprendere i loro meccanismi di segnalazione. ontent &quot;&gt; Qui, abbiamo descritto un visivamente un metodo per colmare microscopia confocale con SBEM. Il metodo è indicato come Cocem3D, che ci ha permesso di documentare l&#39;ultrastruttura completa delle cellule enteroendocrine. Abbiamo riportato che queste cellule hanno un neuropod che contiene tre quarti di tutte le vescicole secretorie 8. All&#39;interno della neuropod, ci sono neurofilaments e molto simile assoni neuronali, neuropods si nutrono di cellule gliali enteriche 8. Più importante, è se questi neuropods che enteroendocrine cellule connettono fisicamente ai neuroni che innervano l&#39;intestino e colon 9. Uno dei punti di forza di cocem3D è la sua semplicità. Ridurre il campione di tessuto in un blocco che può essere immaginata dal confocale e SBEM facilita l&#39;identificazione di una cella specifica all&#39;interno di un tessuto. Vescicole secretorie e altri organelli possono essere identificati con facilità ad una risoluzione di 7 nm / pixel. Poiché le sezioni in SBEM vengono scartate, ulteriori procescantare di tessuti per identificare specifiche proteine ​​non è un&#39;opzione a questo punto. Tuttavia, lo sviluppo di metodi come ATUM 24, in cui le sezioni dal blocco tessuti sono conservati, sono suscettibili di consentire l&#39;identificazione di proteine ​​specifiche nella cellula. Determinare la posizione specifica di recettori chemiosensoriali sulle cellule enteroendocrine tratta di elementi essenziali per lo sviluppo di terapie farmacologiche per l&#39;obesità, perché le cellule enteroendocrine sono un&#39;interfaccia sensoriale tra il cibo nell&#39;intestino e sazietà nel cervello.

La vita all&#39;interno di una cella si svolge nel tempo e nello spazio. Le modifiche nel corso del tempo sono spesso studiate usando la microscopia time-lapse in combinazione con tecniche di imaging di fluorescenza, come Super-risoluzione microscopia. Spazio, in particolare la disposizione di organelli all&#39;interno di una cellula o cellula-cellula interazioni, può essere ottenuto mediante un quadro completo della struttura fine della cellula. Un resoconto completo di struttura fine di una cella può anche portare chiarezza alla funzione genomica nei casi in cui il genoma è disponibile, come il C. elegans nematode 1 o il placozoa tricoplax piano adherens 2. Serial microscopia sezionamento elettrone è ora riproducibile, tempo efficiente e meno costose attività grazie allo sviluppo di tecnologie automatizzate microscopia elettronica 3D, come seriale blocco faccia microscopia elettronica a scansione 3 (SBEM). La necessità di informazioni strutturali a chiarire funzione è molto evidente in alcuni celTipi l dove funzione dipende interazioni fisiche cellula-cellula, come i neuroni, glia o cellule epiteliali sensoriali. Siamo particolarmente interessati a chiarire come i segnali sensoriali provenienti da nutrienti nel lume dell&#39;intestino vengono trasdotte in un segnale elettrico che modula in ultima analisi i comportamenti appetitive. Il circuito è complessa ma inizia alla parete intestinale dove i nutrienti vengono a contatto con le cellule epiteliali sensoriali, chiamate cellule enteroendocrine. A differenza di altre cellule epiteliali sensoriali come cellule gustative, cellule enteroendocrine sono dispersi in tutto l&#39;epitelio intestinale con un rapporto di 1-1000 4-7. Di conseguenza, essi sono difficili da identificare e studiare, e per lungo tempo sono stati visti solo come una fonte di ormoni intestinali. Ma con lo sviluppo di topi fluorescenza del reporter specifici delle cellule, la funzione sensoriale complesso di queste cellule sta emergendo. Utilizzando uno di questi topi reporter, un peptide YY-GFP (PyyGFP) topo, abbiamo scoperto che enteroendocrcellule ine hanno una coda citoplasmatica di primo piano che abbiamo chiamato neuropod. La comparsa di neuropods suggerito una funzione conservata in comunicazione cellula-cellula. Così, abbiamo concluso che documentando l&#39;ultrastruttura di una cella enteroendocrine, la funzione di neuropods potrebbe essere derivato. La necessità di comprendere la struttura di un&#39;appendice in una cella disperso, che è difficile identificare stata la motivazione principale per lo sviluppo di un metodo per combinare la microscopia confocale e SBEM. La cella di interesse è stato identificato utilizzando PyyGFP enteroendocrine specifiche delle celle topi reporter. Il metodo ha permesso di documentare l&#39;intero ultrastruttura di una cellula enteroendocrine e la sua neuropod. All&#39;interno neuropods, abbiamo trovato le caratteristiche strutturali degli assoni neuronali, e al di fuori neuropods, abbiamo trovato un rapporto fisico per glia enterica 8. Infatti, neuropods contengono circa il 70% di tutte le vescicole secretorie suggerendo un ruolo essenziale nella funzione secretoria di queste cellule. Sulla base deldati strutturali, più recentemente abbiamo scoperto che attraverso questi neuropods, cellule enteroendocrine e neuroni che innervano l&#39;intestino formano un circuito neuroepiteliale, simile a quello delle cellule gustative nella lingua 8,9. Scoprire queste caratteristiche di meccanismi chemosensoriali gastrointestinali derivava da dati strutturali raccolti con questo metodo di microscopia correlativa. Crediamo che questo metodo potrebbe essere utile in altri settori della biologia cellulare, in particolare quando le cellule sono dispersi all&#39;interno dei tessuti in un rapporto molto basso. Abbiamo fatto riferimento al metodo come confocale correlative e seriale blocco faccia microscopia elettronica a scansione in 3D (Cocem3D). Il metodo comprende le seguenti fasi principali: dissezione, microscopia confocale, imaging SBEM, SBEM e immagine confocale di correlazione, e segmentazione manuale. Rispetto ad altri metodi correlativi, il concetto è piuttosto semplice perché la correlazione è fisico piuttosto che chimico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Delimitazione di ultrastruttura di una cellula è importante per capire la sua funzione. Questo può essere un progetto scoraggiante per tipi di cellule rare diffusi in tutta tessuti fatti di tipi cellulari diversi, come le cellule enteroendocrine dell&#39;epitelio intestinale. Questi sensori gastrointestinali di cibo e batteri sono stati difficili da studiare perché la dispersione delle altre cellule epiteliali in un rapporto di 1: 1.000. Recentemente, topi reporter transgenici sono stati generati per identificare le cellule enteroendocrine mediante fluorescenza. Uno di questi è il peptide YY del mouse-GFP. Usando questo mouse, abbiamo sviluppato un metodo per correlare confocale e serial blocco faccia microscopia elettronica a scansione. Abbiamo chiamato il metodo cocem3D e applicato per identificare una cella enteroendocrine specifica nei tessuti e svelare ultrastruttura della cellula in 3D. La risoluzione di cocem3D è sufficiente per identificare organelli piccolo come vescicole secretorie e distinguere membrane cellulari per il volume rendering. Cocem3D può essere facilmente adattato per studiare l&#39;ultrastruttura 3D di altri tipi cellulari specifici nella loro tessuto nativo.

Il metodo presentato qui è stato utilizzato per studiare la ultrastruttura di una cella specifica all&#39;interno di un livello di epitelio. La cella di interesse in questo caso è la cella enteroendocrine sfuggente. La loro identificazione in situ è stato possibile solo negli ultimi anni con lo sviluppo di topi fluorescenza del reporter specifiche delle celle. Nel 2011, abbiamo sviluppato un topo in cui il promotore del PYY ormone guida l&#39;espressione della proteina fluorescente verde 17. In questo mouse PyyGFP, cellule enteroendocrine della parte distale dell&#39;intestino tenue e del colon sono facilmente distinguibili sotto luce UV. Questo modello di topo è stata una base per identificare un blocco di tessuto contenente una cella enteroendocrine ed elaborarla per SBEM. Il metodo di correlazione viene definito qui come cocem3D ed è stato costruito su protocolli precedentemente pubblicati 10,11. Ottimizzando le dimensioni del blocco di tessuto è critica per la correlazione. In esperimenti preliminari,è stato determinato che in un blocco di tessuto 300 micron di lunghezza x 50 micron di spessore il numero di immagini SBEM è ridotta al minimo e di coprire l&#39;intero corpo della cella di interesse. La figura 1A mostra una trascuranza della dissezione con una lama microtrome vibrante ottenere il blocco di tessuto con le giuste dimensioni. Almeno 100 blocchi sono ottenuti prima smistamento attraverso di loro a scegliere quelli con cellule intatte di interesse. Blocchi selezionati vengono esposte mediante microscopia confocale e immagine z-stacks sono otticamente distanziati ogni 1 micron (Figura 1B e C). Figura 1D mostra una vista volume rendering di una cella enteroendocrine nell&#39;ileo del mouse. La sua neuropod prominente estende sotto cellule epiteliali per ~ 60 micron. La cella di interesse si trova correlando i confocale z-stack un&#39;immagine SBEM di tutto il blocco viso con. Un esempio è presentato qui di un isolato dal colon distale di un PyyGFPtopo. Dopo aver ottenuto confocali z-stack (Figura 2A), il blocco è incorporato in uno strato sottile di bassofondente agarosio (Figura 2B). Ciò è necessario per la successiva manipolazione del blocco. È importante mantenere l&#39;orientamento del blocco più piatta possibile abbinare le fette ottici con le fette SBEM. Nella figura 2C, un&#39;immagine rappresentativa è mostrato dell&#39;intera faccia del blocco tessuti. Alcune parti di questa figura sono stati precedentemente pubblicati in Bohorquez et al., 2014 8. Questo è stato successivamente correlata con l&#39;immagine confocale tenendo conto dei punti di riferimento del tessuto e le dimensioni. La figura 2D mostra una sovrapposizione della confocale e immagine SBEM del blocco, rivelando la ubicazione precisa della nostra cella di interesse. Una volta che la cella è stata identificata, imaging SBEM avviene ad una risoluzione sufficiente per identificare vescicole secretorie e altri organelli cellulari. Il set di dati presentati luire è stato ripreso a 7 nm per pixel come le immagini del blocco sono state scattate ogni 70 nm. I set di dati contengono 643 immagini che si estendono su 45 micron di profondità dei tessuti. A pochi micron sono rase durante l&#39;imaging iniziale di tutto il blocco di fronte a basso ingrandimento. Il set di dati SBEM greggio è stato acquisito in formato .dm3 e trasformato per .tiff per il successivo trattamento. Lo stack SBEM è stata ritagliata utilizzando il software Fiji plugin &quot;crop (3D)&quot; blocco contenere solo la regione di interesse. Questo riduce la quantità di memoria RAM necessaria per volume rendering. La cella è stata identificata dalla sua posizione e vescicole secretorie, e segmentato utilizzando il software Imaris. Figura 3 contiene una rappresentazione in 3D della cella enteroendocrine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Figura 1:. Microscopia confocale Correlativo (A) del flusso di lavoro a sezionare un pezzo ditessuto intestinale in un tessuto blocco 300 x 50 micron di spessore. (B) Un blocco rappresentante tessuto delle giuste dimensioni. Si noti che un blocco di tessuto di queste dimensioni da piccolo intestino del mouse estende circa 3 villi o, nel caso del colon circa 8 cripte. (C) Un villi nell&#39;intestino tenue contenente una cella di interesse. (D) A confocale z-stack rendering in 3D utilizzando il software Imaris mostra una cella enteroendocrine con un neuropod prominente che corre sotto l&#39;epitelio intestinale. Blu = DAPI macchia nucleare. Bar = 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Figura 2: Serial block-faccia microscopia elettronica a scansione (A) immagine confocale di una sele.blocco tessuto CTED dal colon contenente cellule PyyGFP enteroendocrine (verdi) di interesse. (B) Una volta che il blocco viene ripreso al microscopio confocale, viene poi incorporato appartamento a basso punto di fusione agarosio utilizzando vetrini. Incorporare il blocco dei tessuti in agarosio facilita la successiva manipolazione, e la tacca sull&#39;angolo sinistro aiuta a montare il blocco all&#39;interno del SBEM nel giusto orientamento. (C) SBEM immagine del volto del blocco. (D) Correlazione dei dati confocale con SBEM identificare cella di interesse (freccia bianca). Immagini in ced di questa figura sono modificate da Bohorquez et al., 2014 Blu 8. = DAPI macchia nucleare. Bar = 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Figura 3:. Rappresentazione dei dati in 3D (A) Rappresentazione volumetrica di cellula enteroendocrine utilizzando il software Imaris. La cella contiene una neuropod piena di vescicole secretorie. Per una descrizione completa della ultrastruttura di una cella enteroendocrine, consultare Bohórquez et al., 2014 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Correlativo confocale e 3D microscopia elettronica di una cellula sensoriale specifico

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Video: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ricerca

Biologia

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Localizzazione ultrastrutturale di LC3 endogena mediante microscopia elettronico-ottica correlativa in sezione

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Imaging del perossido mitocondriale in cellule di lievito viventi utilizzando mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca mitocondriale - Biosensore mtHyper7 per l'analisi subcellulare 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Imaging di mtHyPer7, un biosensore raziometrico per il perossido mitocondriale, in cellule di lievito viventi

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...