La fresatura FIB correlativa 3D rende accessibili eventi cellulari specifici e persino rari a Cryo-TEM. Permettendo la rivelazione dell'ultra struttura di questo evento direttamente all'interno dell'ambiente nativo. Il flusso di lavoro correlato migliora il tasso di successo del targeting di strutture cellulari rare e aiuta a identificarle in modo inequivocabile nell'ambiente cellulare affollato.
A dimostrare la procedura saranno Anna Bieber e Christina Capitanio, esperte di tomografia crioelettronica correlativa. Iniziare la microscopia a criofluorescenza delle griglie seminate di cellule acquisendo una panoramica ad ampio campo in fluorescenza e in modalità riflessa. Quindi, selezionare i quadrati della griglia adatti con il segnale di fluorescenza.
Dopo esserti assicurato che le celle e le perline siano distribuite uniformemente verso il centro di ogni quadrato, scegli i quadrati su 200 griglie mesh che sono accessibili sia allo strumento FIB-SEM che TEM e sono ad almeno tre quadrati di distanza dal bordo della griglia. Su ciascuno dei quadrati della griglia selezionati, acquisisci una pila fluorescente con un passo focalizzato appropriato. Gli obiettivi ad alta apertura numerica dovrebbero essere utilizzati per aumentare il numero di fotoni e l'accuratezza della localizzazione.
Su un microscopio confocale con obiettivo ad apertura numerica 0,9, acquisire pile con passo di 300 nanometri e sovracampionare il valore di Nyquist. Registra più pile di colori e conserva le griglie sotto azoto liquido fino a un ulteriore utilizzo. Utilizzare i segni di ritaglio o di orientamento per garantire il corretto orientamento della griglia per il successivo posizionamento nel TEM.
Caricare le griglie nello strumento criogenico FIB-SEM. Assicurarsi che la direzione di fresatura sia perpendicolare all'asse di inclinazione del TEM. Per rivestire le griglie con uno strato organometallico protettivo, utilizzare un codificatore al plasma e un sistema di iniezione di gas nelle posizioni dello stadio predefinite dalla configurazione FIB-SEM.
Quindi, registrare la panoramica della griglia SEM ed eseguire una correlazione 2D con le panoramiche FLM. Trova i quadrati della griglia ispezionando manualmente le panoramiche della griglia registrate o utilizzando un pacchetto software. Selezionare e contrassegnare quattro posizioni corrispondenti per i quadrati nella panoramica della griglia FLM e SEM e calcolare la trasformazione tra i punti contrassegnati per la correlazione FLM-SEM.
Quindi, posizionate i marcatori al centro dei quadrati della griglia corrispondenti per i quali sono state acquisite le pile FLM prima di prevederne la posizione nella vista SEM. Per ogni quadrato della griglia correlato, acquisire un'immagine del fascio ionico a bassa corrente all'angolo di fresatura FIB scelto e selezionare un campo visivo con la posizione e l'ingrandimento desiderati che corrispondano ai dati di fluorescenza. Per le griglie a 200 mesh, acquisire i dati FIB-SEM in modo che contengano singoli quadrati della griglia, incluse le barre della griglia.
Quindi, prendi un'immagine SEM dello stesso quadrato per aiutare con l'identificazione delle perle corrispondenti nella vista della fluorescenza e del fascio ionico. Eseguire la registrazione della pila FLM 3D grezza o deconvoluta e della vista del fascio ionico 2D per ciascuna posizione con la cassetta degli attrezzi di correlazione 3D, CT 3D, caricando la corrispondente pila FLM 3D riaffettata e la vista del fascio ionico in 3D CT.In i dati di fluorescenza, selezionare quattro perline fiduciali e fare clic con il pulsante destro del mouse sull'elenco delle posizioni per determinare la posizione 3D delle perline tramite l'adattamento gaussiano del segnale in X, Y e Z.Quindi, selezionare le perline corrispondenti nell'immagine del fascio ionico per eseguire una correlazione 3D iniziale. Allo stesso modo, aggiungi più perline alla registrazione per verificare l'accuratezza della correlazione.
Omettere alcune perle fiduciali chiaramente identificabili sia nella fluorescenza che nel fascio ionico controllando la loro posizione prevista rispetto a quella effettiva nell'immagine del fascio ionico. Nella TC 3D, l'errore quadratico medio della radice o i valori RMSE possono essere visualizzati per valutare la coerenza della correlazione. Assicurarsi che i valori RMSE siano piccoli e nell'ordine di precisione della localizzazione.
Successivamente, selezionare i segnali cellulari di destinazione e adattare la posizione 3D nello stack FLM prima di applicare la trasformazione per prevedere le posizioni di destinazione nella vista del fascio ionico. Per ogni quadrato correlato, trasferire le posizioni previste degli elementi di interesse allo strumento FIB-SEM per posizionare i modelli di fresatura a lamelle. Se sono presenti più segnali per cella, posizionare i modelli in modo da includere il massimo possibile di punti di interesse nella stessa lamella.
Fresatura grossolana delle lamelle seguita da fresatura fine per ottenere uno spessore finale da 150 a 250 nanometri. Assicurarsi che l'orientamento della lamella sia perpendicolare all'asse di inclinazione quando si caricano le griglie nel microscopio elettronico a trasmissione. Acquisisci il montaggio della griglia e le panoramiche per ogni quadrato della griglia contenente lamelle con ingrandimento e tempo di esposizione adeguati per visualizzare le perle fiduciali nelle immagini TEM senza aumentare significativamente la dose totale di elettroni.
Acquisisci mappe TEM ad alta risoluzione di ogni lamella. Registro e 3D-2D correlano lo stack FLM con il quadrato della griglia TEM e le panoramiche delle lamelle in CT 3D. Eseguire la correlazione tra FLM e TEM da un ingrandimento basso ad un ingrandimento alto in TEM. Dopo aver trasferito le posizioni, impostare ed eseguire la serie di inclinazioni in posizioni correlate, quindi utilizzare un ingrandimento, una sfocatura e una dose totale appropriati per avviare l'acquisizione dell'immagine al pre-tilt determinato dalla lamella utilizzando uno schema di inclinazione simmetrica alla dose.
Seguire l'acquisizione manuale o in batch delle immagini. Nell'analisi rappresentativa, la panoramica TEM a basso ingrandimento del sito di macinazione è mostrata per localizzare le caratteristiche biologiche di interesse. Successivamente, è stata correlata una vista a ingrandimento maggiore con la proiezione di massima intensità FLM e sono state impostate posizioni per l'acquisizione del tomogramma.
Nelle immagini acquisite, il deposito proteico endocitico poteva essere visualizzato nel suo ambiente nativo. L'ottimizzazione del campione è molto importante. La preparazione della griglia dovrebbe essere ottimizzata per avere una buona distribuzione delle celle da macinare e un buon numero di perline fiduciali visibili nella maggior parte dei quadrati della griglia.
La fresatura correlativa 3D ha contribuito a rivelare l'ultra struttura di diversi processi cellulari, come la progressione graduale dell'autofagia in ogni cellula, ed è utilizzata per catturare un nuovo compartimento separato dalla fase.
