La localizzazione delle proteine nel contesto dell'ultrastruttura della cellula è stata un potente strumento di ricerca per decenni. Con questo protocollo, abbiamo esteso le proteine che sono poco abbondanti o difficili da localizzare. Utilizziamo la microscopia a fluorescenza per marcare le proteine in modo sensibile e schermabile e la combiniamo con la microscopia elettronica per riempire l'ultrastruttura della cellula.
Qui dimostreremo CLEM in sezione sulle proteine dell'autofagia, ma può essere applicato a qualsiasi questione biologica in cui l'ultrastruttura della cellula è di interesse, specialmente nello studio di eventi rari. A dimostrare la procedura con me sarà Tineke Veenendaal, un tecnico di ricerca senior del nostro laboratorio. Per iniziare, sostituisci il PBS contenente lo 0,15% di glicina con l'1% di gelatina in PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius.
Raschiare e trasferire le cellule in gelatina in una provetta per microcentrifuga. Pellettare le cellule a 6.000 G per un minuto a temperatura ambiente in una microcentrifuga e quindi rimuovere la gelatina senza disturbare il pellet. Aggiungere al pellet il 12% di gelatina riscaldata a 37 gradi Celsius e risospendere delicatamente pipettando con puntali per pipette o pipette di vetro preriscaldate alla stessa temperatura.
Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti e poi pellettare le cellule a 6.000 G per un minuto. Solidificare la gelatina con ghiaccio per 30 minuti. Per rimuovere le cellule incorporate nella gelatina dal tubo, tagliare l'estremità del tubo contenente il pellet dal resto del tubo con una lama di rasoio.
Quindi tagliare l'estremità del tubo con il pellet cellulare a metà perpendicolarmente al primo taglio. Mettere le due metà terminali del tubo contenenti il pellet cellulare in saccarosio 2,3 molari e incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ciò fa sì che le metà del pellet cellulare si restringano leggermente e si spostino dal tubo di plastica.
Rimuovere le metà del tubo con il pellet cellulare incorporato nella gelatina dal saccarosio, quindi rimuovere le metà del pellet cellulare dalle metà del tubo di plastica con una pinzetta. Tagliare manualmente il pellet in blocchi di dimensioni adeguate con una lama di rasoio e utilizzare uno stereomicroscopio da dissezione per ingrandire il soggetto durante il taglio. Incubare i blocchi cellulari per una notte in saccarosio 2,3 molari a quattro gradi Celsius.
Posizionarli su un perno portacampioni in alluminio. Lasciare abbastanza saccarosio intorno ai bordi del blocco in modo che formi un collare sottile tra il blocco e il perno. Congelare a scatto e conservarlo in azoto liquido.
Taglia la parte anteriore del blocco per appiattirne la superficie per ottenere sezioni spesse circa 250 nanometri. Quindi tagliare i lati del blocco sezionando da 50 a 100 micrometri sul lato della faccia del blocco campione con l'angolo del coltello. La rifilatura di quattro lati della faccia del blocco campione creerà un rettangolo sporgente di circa 250 x 375 micrometri.
Sezionare un nastro dal rettangolo sporgente assicurandosi che le sezioni abbiano uno spessore compreso tra 70 e 90 nanometri e abbiano una lucentezza dorata argentea. Guida le sezioni lontano dal bordo del coltello diamantato con un capello su un bastoncino per creare un lungo nastro. Prendi il nastro immergendo l'anello di prelievo di tre millimetri in una miscela uno-a-uno di saccarosio molare al 2,3 e metilcellulosa al 2%.
Inserire l'ansa nella camera criogenica del microtomo e, una volta che la gocciolina inizia a congelarsi, raccogliere prontamente le sezioni premendo delicatamente la gocciolina contro di esse. Rimuovere l'anello dalla camera criogenica. Attendere che la gocciolina si sia completamente scongelata e premere la goccia su una griglia preparata.
Posizionare le griglie con sezioni su circa un millilitro di PBS in un piattino o in una piastra a più pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Lavorare le griglie su circa 75 microlitri di goccioline su Parafilm e iniziare con lavaggi di glicina PBS a temperatura ambiente. Incubare le griglie con un tampone bloccante composto da albumina C sierica bovina allo 0,1% e gelatina di pelle di pesce allo 0,5% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente come fase di blocco.
Diluire gli anticorpi primari nel tampone bloccante in PBS e incubare le griglie su circa 10 microlitri di goccioline di questa soluzione per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le griglie in albumina sierica bovina allo 0,1% in PBS cinque volte a temperatura ambiente. Diluire gli anticorpi secondari e il DAPI nel tampone bloccante in PBS.
Quindi incubare le griglie su circa 10 microlitri di goccioline di questa soluzione per 30 minuti o più a temperatura ambiente prima di lavare le griglie in PBS cinque volte come mostrato in precedenza. Per montare i campioni per la microscopia ottica, immergere le griglie in glicerolo al 50% in acqua distillata due volte per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare una griglia per vetrino tra un vetrino e un vetrino coprioggetto in glicerolo al 50%, assicurandosi che le sezioni siano rivolte verso il vetrino coprioggetto.
Per la microscopia ottica, portare un vetrino con le griglie a sandwich su un microscopio ad ampio campo con un tavolino automatizzato. Selezionare un obiettivo a olio ad alto ingrandimento e creare un set di tessere immagine del nastro di sezioni. Successivamente, per lo smontaggio e la microscopia elettronica o il contrasto EM, aggiungere 10 microlitri di acqua distillata sul lato del sandwich di vetrino e attendere che l'azione capillare riempia l'interfaccia del sandwich di vetrino.
Rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto senza mescolare l'olio da immersione nel glicerolo. Recupera le griglie con una pinzetta e immergile in acqua distillata tre volte a temperatura ambiente per lavare via il 50% di glicerolo. Asciugare accuratamente il retro della griglia con una carta velina priva di lanugine e posizionare la sezione della griglia con il lato rivolto verso il basso su goccioline di acqua distillata.
Per colorare le sezioni per il contrasto in microscopia elettronica, incubarle con acetato di uranile per cinque minuti a temperatura ambiente. Raffreddare la soluzione di acetato di uranile metilcellulosa posizionando le goccioline su Parafilm su una piastra metallica su ghiaccio. Quindi lavare due volte le griglie con questa soluzione ghiacciata e incubarle nella soluzione per 10 minuti.
Avvolgere le griglie inserendo un anello di asciugatura della griglia nella gocciolina di metilcellulosa di acetato di uranile sotto ciascuna griglia e sollevandola delicatamente fino a quando la griglia non viene estratta dalla gocciolina. Per tamponare la soluzione in eccesso, toccare l'anello con un angolo di circa 60 gradi sulla carta da filtro priva di lanugine e trascinarlo lentamente lungo la carta fino a quando non viene assorbita più soluzione. Posizionare l'anello con la griglia in una griglia adatta e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per più di 10 minuti.
Utilizzare la panoramica ottenuta dalla microscopia ottica per individuare una regione di interesse per l'imaging nel microscopio elettronico a trasmissione o TEM e annotare il ROI sul set di dati della microscopia ottica. Una volta selezionata una regione, ottenere un riquadro immagine impostato su un ingrandimento compreso tra 20.000x e 50.000x nel TEM. Ricostruisci il set di tessere dell'immagine nel software di post-elaborazione.
Eseguire la correlazione basata sul segnale DAPI e sulla fluorescenza e sui contorni nucleari in microscopia elettronica. Sposta le immagini per sovrapporle con precisione ed eseguire la correlazione manuale in modo accurato. Le cellule HEPG2 derivate dall'epatoblastoma sono state affamate per due ore in EBSS prima della fissazione con paraldeide al 4% per due ore.
L'imaging IF di LC3 e LAMP1 sulle sezioni rivela relativamente pochi punti LC3 e poca colocalizzazione con LAMP1. Le informazioni molecolari provenienti dall'IF sono state collegate alle informazioni ultrastrutturali ottenute nella microscopia elettronica sovrapponendo le due modalità di imaging basate su DAPI e contorni nucleari. La correlazione degli organelli positivi di LC3 con l'ultrastruttura EM ha rivelato che i diversi punti rappresentavano stadi distinti dell'autofagia.
L'ultrastruttura dei singoli compartimenti etichettati LC3, come esemplificato dalla prima scatola, è mostrata qui. Le immagini correlate della microscopia elettronica ottica sono mostrate a sinistra e le immagini di microscopia elettronica pseudo colorata sono mostrate a destra. Le membrane autofagosomiali interne ed esterne sono indicate da punte di freccia bianche e nere.
È interessante notare che EM ha identificato macchie fluorescenti relativamente deboli come autolisosomi positivi per LC3, che sono caratterizzati da un contenuto denso e vescicole intraluminali. Ciò rivela una visibilità minima di LC3 nell'IF di sezioni criogeniche ultra sottili, suggerendo LC3 rilevabile negli autolisosomi allo stato stazionario nonostante l'ambiente degradativo. Tuttavia, i punti positivi di LC3 rappresentano principalmente gli autofagosomi, mentre pochi rappresentano gli autolisosomi.
Per i ricercatori che desiderano eseguire l'etichettatura dell'immunogold invece del CLEM in sezione, i protocolli e i suggerimenti qui descritti sono pienamente applicabili anche per l'etichettatura dell'immunogold. Inizialmente abbiamo applicato CLEM in sezione a proteine regolatorie endosomiali di bassa abbondanza e abbiamo mostrato per la prima volta la loro localizzazione ultrastrutturale endogena.
