Ringraziamo i membri del laboratorio Alto per le discussioni utili. Ringraziamo anche lo strumento per imaging molecolare e cellulare del Southwestern Medical Center, in particolare il dottor Chris Gilpin, Tom Januszewski, e Laurie Mueller per la competenza tecnica e consulenza. Ringraziamo anche il Dott. Xionan Dong per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è sostenuto da NIH sovvenzione AI083359 a NMA

1. Colture Cellulari mammiferi <ol><li> Rene di ratto normale (NRK), immortalata tumore della cervice uterina (HeLa), o di altre linee cellulari di mammiferi appropriate sono coltivate a 37 ° C, 5% di CO 2, su vetrini fotoincisioni gridded apposti a vivere piatti cellulari (vedi Tabella 1 per ogni reagente o apparecchiatura utilizzata in questo protocollo) in DMEM + 10% FBS e 1% Pen / Strep. Devono essere prese precauzioni per mantenere un ambiente sterile quando si lavora con una coltura di cellule di mammifero. </li><li> A seconda del tempo sperimentale-line (0-5 ore vs 1-2 giorni dopo iniezione) la confluenza di cellule dovrebbero essere adattati per ~ 50% ~ 25%, rispettivamente. </li></ol> 2. Microiniezione <ol><li> Preparare proteina desiderata, DNA, o piccole molecole nella scelta del buffer, a seconda della sua riconducibilità alla cultura cellulare, ad un volume finale di 50 pl ~. Inerti coloranti fluorescenti come il Texas Rosso o Blu Cascadesono inclusi per marcare le cellule microiniettati; scelta del colorante iniezione e sonda fluorescente dovrebbe avere eccitazione non sovrapposti e lunghezze d&#39;onda di emissione. La concentrazione della molecola di interesse necessaria per microiniezione dovrebbe essere determinato empiricamente, ed i coloranti fluorescenti inseguimento vengono comunemente usati a 0.5-1.0 mg / ml. Tipicamente, rodamina o altro fluoroforo è covalentemente attaccata alla molecola di interesse utilizzando un kit commerciale, tuttavia altri metodi di rilevamento possono essere utilizzati a seconda della sensibilità. Per ulteriori informazioni, vedere Considerazioni critiche di seguito. </li><li> Filtrare la injectant (~ 50 ml) attraverso un filtro di 0,22 micron centrifugo. Filtri centrifughi sono preferite a vuoto e / o filtrazione siringa che sono associati volumi morti. </li><li> Per generare l&#39;ago microiniezione, pipette in vetro borosilicato sono tirati utilizzando un Flaming-Brown micropipetta Estrattore seguenti linee guida produttori. In alternativa, microiniezionegli aghi possono essere acquistati presso i fornitori tra cui Eppendorf che rende aghi microiniezione femtotip. </li><li> Pipettare attentamente 4 l di injectant nell&#39;estremità indisturbati dell&#39;ago microiniezione con Eppendorf 20 Femtotips. Assicurarsi che non siano presenti bolle all&#39;interno dell&#39;ago microiniezione tirato. Caricare ago microiniezione nel braccio micromanipolatore del FemptoJet Eppendorf InjectMan collegato ad un microscopio invertito. Per una buona revisione della procedura microiniezione, il lettore è indirizzato ad un Journal precedente articolo visualizzato Esperimenti 8. </li><li> Posizionare piatto dal vivo delle cellule con coprioggetto con griglia e cellule in coltura nel supporto piatto del microscopio invertito Zeiss. Trova cellule in crescita all&#39;interno di una griglia fotoincisione e notare la alfanumerico identificativo griglie, questo sarà utilizzato in tutte le fasi successive. Idealmente, individuare le celle al centro del vetrino come step successivi limitare il trasferimento di esempio ai bordi del coprioggetto. </li><li> Iniezione braccio Abbassare manualmente in posizione sopra il vetrino, e utilizzando il joystick micromanipolatore e controlli, ago per l&#39;iniezione più in basso fino a quando la punta non tocca leggermente la superficie delle cellule in coltura e limite premere &#39;per impedire il movimento dell&#39;ago di là di questo punto, e quindi rompere il fragile tirato in vetro borosilicato. Tutti gli altri aspetti microiniezione cellule vengono effettuate per utente Eppendorf FemtoJet manuale InjectMan. La tecnica di microiniezione è stato recentemente utilizzato per comprendere le singole proteine ​​di virulenza secrete dai batteri 9. </li><li> Microinject ogni altra cellula all&#39;interno della griglia scelta. Con cellule cresciute a ~ 50% di confluenza, ci si può aspettare ~ 80 cellule per 600 um 2 griglia (esempio mostrato in Fig. 3A). Pertanto, previo controllo microscopia a fluorescenza ed elettronica, ci sarà un n sperimentale di ~ 30-40 e cellule di controllo. </li><li> Posizionare live-cell piatto nuovo in incubatrice mammiferi di coltura cellulare per la desideratatempo come dettato dal setup sperimentale. In alternativa, si può procedere direttamente dalla microiniezione di time-lapse analisi al microscopio di attendere la comparsa di particolari strutture subcellulari di interesse prima della fissazione. </li></ol> 3. Microscopia a fluorescenza <ol><li> Se desiderato, effettuare live-cellule time lapse misure di fluorescenza di cellule microiniezione, dopo di che, sostituire il supporto con il 2,5% di glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato (pH 7,4) e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Tuttavia, se vivo di cellule misurazioni non sono necessarie, scartare supporti crescita cellulare e fissare le cellule con 5 ml di formaldeide 3,7% in 1xPBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Gettare fissativo e sostituire con 5 ml 1xPBS, passare al punto 3.2. Nota: è importante non aggiungere glutaraldeide fino a dopo la microscopia a fluorescenza è completa. </li><li> Posizionare il live-cella piatto con fotoincisione coprioggetto con griglia in un microscopio a fluorescenza (confocale non è necessario per this step) e raccogliere 5-10 campo chiaro e immagini fluorescenti della griglia appropriata per documentare la disposizione delle cellule (Fig. 4A). Identificare quelle cellule che sono state microiniettati con le lunghezze d&#39;onda di eccitazione ed emissione del colorante inerte iniezione (Fig. 4B). È importante per ottenere immagini a diversi ingrandimenti (ad esempio 10x e 65x) al fine di facilitare l&#39;identificazione delle cellule microiniezione in fasi successive che comportano microscopia elettronica. </li><li> Utilizzando un microscopio confocale a fluorescenza, raccogliere un Z-stack di celle microiniettati all&#39;interno della griglia identificato nel passo 2.5. Alto ingrandimento (100x) è necessaria al fine di correlare immagini fluorescenti con strutture subcellulari che saranno identificati in microscopia elettronica. </li><li> I vetrini vengono rimossi dal fondo dei piatti cellule vive con liquido coprioggetto commercio rimozione e collocato cellula-lato in un piatto di coltura cellulare vergine contenente 5 ml1xPBS. Il vetrino viene elaborato per la microscopia elettronica come di seguito dettagliato. </li></ol> 4. Microscopia elettronica a trasmissione <ol><li> Sostituire tampone 1xPBS con 2 ml di glutaraldeide 2,5% in 0,1 M tampone cacodilato (pH 7,4) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Più incubazione, mentre non necessario, sarà di aiuto nella manutenzione delle strutture subcellulari. Nota: formaldeide da solo non è sufficiente per un fissativo EM analisi. </li><li> Rimuovere le cellule fissativo e macchia con l&#39;aggiunta di 2 ml tetrossido di osmio 1% in tampone cacodilato 0,1 M per 30 min seguito da tre lavaggi con tampone cacodilato e infine sostituire tutti tampone con DDH 2 O. </li><li> Seguendo protocolli standard EM, disidratare il campione in un graduata (70% al 100%) serie di etanolo. Preparare resina Epon e applicare il coprioggetto luogo cellulare rivolto verso il basso sulla parte superiore di un tubo pieno di resina Epon. Consentono polimerizzazione per 24 ore a 60 ° C. Inserendo il coprioggetto fotoincisione griglia cella sul lato down sulla resina Epon, sia le cellule di interesse e la griglia viene trasferito alla resina Epon durante la polimerizzazione (ad esempio mostrato in Fig. 3B). </li><li> Rimuovere coprioggetti di resina Epon in fretta immersione in azoto liquido e / o acqua bollente. Controllare la superficie della resina in un ambito di dissezione binocolo per individuare la rete di interesse (nota: lo scalpiccio griglia trasferirà come immagine speculare). Usando una lama di rasoio o bisturi sterile, rifilare il blocco Epon basso tale che solo la griglia di interesse è all&#39;apice del blocco di resina Epon. </li><li> Utilizzando un ultramicrotomo, acquisire sezioni seriali di blocco rifilato al desiderato spessore (~ 70 nm di spessore TEM convenzionale e ~ 250 nm di spessore tomografica TEM). Contrasto le sezioni con acetato di uranile e citrato di piombo seguendo protocolli standard. </li></ol> 5. Luce Correlativo e microscopia elettronica <ol><li> Spostare le celle di interesse ail microscopio elettronico utilizzando immagini ottenute nei passaggi precedenti. Una volta che le cellule microiniezione di interesse sono stati localizzati, utilizzare le immagini confocali alta risoluzione fluorescenti per identificare regioni all&#39;interno della cella che erano di interesse. Immagine questi ad alta risoluzione utilizzando TEM. Utilizzare punti di riferimento come la periferia cellulare e la membrana nucleare per determinare quale fluorescente z-serie di immagini corrisponde al EM tagliare. </li><li> Utilizzando il programma di imaging di vostra scelta (ad esempio Image J, Adobe Photoshop, etc), ridurre l&#39;opacità dell&#39;immagine fluorescente al 50% e sovrapporlo l&#39;immagine TEM con la quale si correla. Allineare le immagini regolando la scala (ricordate le proporzioni) e la rotazione della immagine confocale a corrispondere l&#39;immagine TEM. Regolazioni di precisione per contrasto, nitidezza, ecc dell&#39;immagine fluorescente può essere di aiuto l&#39;allineamento. Nota: abbiamo trovato che l&#39;eterocromatina, l&#39;involucro nucleare, e la periferia delle cellule rappresentano un punti di riferimento eccellente per aiutarenell&#39;orientamento delle due immagini. </li></ol> 6. Considerazioni critiche <ol><li> Per facilitare notevolmente nel localizzare la piccola molecola iniettata, un tag fluorescente come fluoresceina o rodamina possono essere covalentemente utilizzando kit disponibili in commercio. Ulteriori informazioni si guadagna ectopicamente esprimendo una proteina marker fluorescente subcellulare localizzazione prima di microiniezione. Da qui, la scelta di fluorofori e inerte colorante monitoraggio microiniezione è importante. </li><li> Scegliere celle per microiniezione che sono aderenti vicino al centro del vetrino ed evitare di scegliere una griglia vicino al bordo. Questo presenta la maggiore probabilità che le cellule di interesse vengono trasferiti alla resina Epon utilizzato per la microscopia elettronica. </li><li> Confluenza di cellule is importante, come piastra completamente confluenti farà identificazione di cellule microiniettati al microscopio elettronico molto difficile. Piuttosto, alveoli tale che essi raggiungono ~ 50% di confluenza del giorno di un breve esperimento, o ~ 25% di confluenza del giorno di una più lunga (1-2 giorni) esperimento. Utilizzare la posizione e la forma delle cellule e la &#39;spazio vuoto come punti di riferimento per orientare l&#39;immagine microscopia elettronica. </li><li> Confocale spessore di strato ottico deve essere sintonizzato alle esigenze dell&#39;esperimento e deve pertanto essere determinata empiricamente 10. </li><li> La formaldeide e glutaraldeide fissativi dovrebbe essere di alta qualità disponibile. Formaldeide sarà fissare le cellule, pur mantenendo le proprietà di fluorescenza di entrambe le proteine ​​e piccole molecole fluorescenti (come rodamina o FITC). Tuttavia, non si conservano le strutture per consentire alta risoluzione EM. Glutaraldeide conserva membrane e strutture subcellulari ad un grado elevato di analisi EMsis, ma ostacolare in modo significativo la fluorescenza. Pertanto, in due fasi fissazione è critica sia per fluorescenza e microscopia EM. Il passo fissazione con formaldeide può essere omesso se performing live-misurazioni cellulari, come la fissazione finale può essere eseguita mediante trattamento con glutaraldeide. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Questa procedura offre la capacità di fornire una molecola di interesse direttamente nel citoplasma cellulare eucariotica e monitorare la sua localizzazione e / o gli effetti di architettura cellulare e organeller da millimetro a multi-risoluzione nanometrica. Una illustrazione schematica della configurazione sperimentale e procedura è mostrato in Figura 2. Questa tecnica si basa sulla microiniezione di cellule cresciute su un vetrino laser vetro acidato reticolata (Fig. 3A), che dopo la microscopia confocale, è in grado di trasferire sia le cellule di interesse e la griglia alla resina Epon (Fig.3B). Una tipica procedura di microiniezione CLEM produce immagini di fluorescenza e microscopio elettronico, che, quando correlati, consentono sia la localizzazione subcellulare e l&#39;analisi ultrastrutturale. Cellule coltivate su vetrino coprioggetti fotoincisione gridded sono microiniettati con una molecola di interesse, dopo che le immagini in campo chiaro sono ottenute (Fig. 4A). Un colorante inerte monitoraggio è incorporato per distinguere cellule microiniettati da non microiniettati cellule (Fig. 4B). Confocali z-stacks sono ottenuti utilizzando un fluoroforo o altro identificatore attaccata alla molecola piccola microiniezione di interesse (Fig. 4C). Il campione viene fissato con glutaraldeide e processati per la microscopia elettronica. Microscopio elettronico si ottengono e sovrapposti sulle celle a cui corrispondono (Fig. 4D). Le aree che ospitano i segnali fluorescenti vengono esaminate più dettagliatamente a maggiore ingrandimento (Fig. 4E </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Cronologia del procedimento microiniezione CLEM. A seconda della configurazione sperimentale, microiniezione e misure di fluorescenza possono essere eseguite nello stesso giorno. Preparazione del campione per la microscopia elettronica è più tempo debito dispendioso lunghi passi incubazioni e durerà 2-3 giorni. Analisi TEM e correlando i segnali di fluorescenza con immagini di microscopia elettronica può essere effettuato in un giorno. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 illustrazione generale della procedura di microiniezione CLEM Fase 1:.. Individuare le celle che crescono sul vetrino laser vetro acidato con griglia e microinject molecola di interesse. Fase 2:. Catturare sia immagini in campo chiaro e fluorescenza confocale z-pile di cellule microiniettati Fase 3: prepararecoprioggetto per EM analisi e incorporare in resina Epon. Utilizzo di griglia trasferito, tagliare bloccare tali che le cellule di interesse sono al vertice Fase 4:. Tagliare sezioni seriali con ultramicrotomo Passo 5:. Correlate immagini fluorescenti con EM immagini. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 griglia facilita l&#39;identificazione di cellule di interesse Pannello A mostra la microiniezione di cellule cresciute di circa il 50% di confluenza,. Notare la griglia identificatore aK. Barra di scala è 100 micron. Pannello B mostra la griglia trasferito dal vetrino sul blocco polimerizzato resina Epon che sarà sezionato serialmente dopo la griglia di interesse viene individuato in un microscopio di dissezione. Pannello C mostra la griglia trasferito in preparazione per il sezionamento . Notare che il patter griglia trasferito è in retromarcia sul blocco di resina; scalbar e è di 1200 micron. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Figura 4"/> .. Figura 4 I risultati rappresentativi dalla luce microiniezione correlativo e microscopia elettronica Pannello A mostra la micrografia brillante campo delle cellule NRK che crescono su un vetrino laser vetro acidato griglia; frecce indicano due celle che sono visualizzate da CLEM in CD pannelli Pannello B mostra la fluorescenza. monitoraggio del colorante inerte, in questo caso Cascade blu, usato per identificare cellule che sono stati microiniettati. Pannello C mostra la sovrapposizione del campo luminoso e la firma fluorescenza di un Rhodamine marcato piccola molecola. Le due celle qui illustrati sono indicati da frecce in pannelli A e B. Pannello D rappresenta CLEM di campo luminoso, microscopia a fluorescenza ed elettronica,. Punta della freccia indica fluorescente puncta ripreso a maggiore ingrandimento E Pannello di barre di scala sono nel seguentebassi: Pannelli A e B, 100 micron; C &amp; D, 50 pm, E, 100 nm.

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	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interesse sono dichiarati.

Il metodo qui presentato permette la fornitura diretta di proteine ​​purificate, acidi nucleici, o piccole molecole nel citoplasma eucariotico e offre ultra analisi ad alta risoluzione attraverso la correlazione di microscopia a fluorescenza ed elettronica. L&#39;uso di questo metodo è semplice ma robusto e possono essere eseguite in-house con molti servizi di base esistenti e / o opportunamente attrezzati laboratori di microscopia elettronica. La tecnica è anche soggetto a live-cella, permettendo all&#39;utente d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Coverslip Fotoincisioni e Live-cell piastra </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blu </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 unità di micron di filtrazione centrifuga </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette in vetro borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modello P-97 </td><td> Utilizzare il programma # 4 dopo aver eseguito test di rampa </td></tr><tr><td> FemtoJet Microiniezione sistema </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslip rimozione dei liquidi </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmission Electron Microscope </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

La cellula eucariotica si basa su complessi, altamente regolamentato, e compartimenti di membrana funzionalmente distinti associati, che conservano una polarità biochimica necessaria per una corretta funzione cellulare. Capire come gli enzimi, proteine, e componenti del citoscheletro governare e mantenere questa separazione biochimica è quindi di fondamentale importanza. L&#39;utilizzo di molecole fluorescenti tag di localizzare e / o turbano compartimenti subcellulari ha prodotto un patrimonio di conoscenze e avanzato la nostra comprensione della regolazione cellulare. Tecniche di imaging come la microscopia confocale a fluorescenza e rendere esaminano la posizione di una molecola fluorescente etichettato piccola relativamente semplice, tuttavia la risoluzione di strutture molto piccole è limitato 1. D&#39;altra parte, microscopia elettronica ha rivelato i dettagli di morfologia subcellulare ad altissima risoluzione, ma la sua natura statica rende difficile misurare pro altamente dinamicoprocessi con precisione 2,3. Pertanto, la combinazione di microscopio ottico con il microscopio elettronico dello stesso campione, chiamato Luce correlativa e Microscopia Elettronica (CLEM) 4,5, offre il duplice vantaggio di imaging fluorescente con ultraveloce ad alta risoluzione della microscopia elettronica 6. Questa potente tecnica è stata implementata per studiare molti aspetti della biologia cellulare 5,7. Fin dalla sua nascita, questa procedura ha aumentato la nostra capacità di distinguere architetture subcellulari e morfologie ad alta risoluzione. Qui, presentiamo un metodo semplificato per eseguire microiniezione rapida seguita da CLEM (Fig. 1). La procedura CLEM microiniezione può essere utilizzato per introdurre quantità specifiche di piccole molecole e / o proteine ​​direttamente nel citoplasma delle cellule eucariotiche e studiare gli effetti di millimetro a multi-nanometri risoluzione (Fig. 2). La tecnica si basa sul microinjectingcellule coltivate su vetrini con laser a griglia applicata sul fondo dei piatti cellule vive e immagini sia con la microscopia confocale a fluorescenza ed elettronica. Localizzazione della cella (s) di interesse è facilitata dalla griglia, che viene facilmente trasferita, insieme con le cellule di interesse, alla resina Epon utilizzato per l&#39;immobilizzazione di campioni e sezionamento prima analisi microscopia elettronica (Fig. 3). Sovrapposizione di immagini fluorescenti e EM permette all&#39;utente di determinare la localizzazione subcellulare nonché eventuali cambiamenti morfologici e / o ultrastrutturali indotte dalla molecola microiniezione di interesse (Fig. 4). Questa tecnica è suscettibile di punti di tempo variabili da ≤ 5 s fino a diverse ore, a seconda della natura del campione microiniezione.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

La tecnica CLEM è stato adattato per analizzare morfologia ultrastrutturale delle membrane, organelli e strutture subcellulari affetti da molecole microiniezione. Questo metodo combina le potenti tecniche di micromanipolazione / microiniezione, microscopia confocale a fluorescenza, e la microscopia elettronica per consentire millimetro a multi-risoluzione nanometrica. Questa tecnica è suscettibile di una vasta gamma di applicazioni.

Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. La tecnica CLEM è stato adattato per analizzare morfologia ultrastrutturale delle membrane, organelli e strutture subcellulari affetti da molecole microiniezione. Questo metodo combina le potenti tecniche di micromanipolazione / microiniezione, microscopia confocale a fluorescenza, e la microscopia elettronica per consentire millimetro a multi-risoluzione nanometrica. Questa tecnica è suscettibile di una vasta gamma di applicazioni.

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Ricerca

Biologia

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Correlativo confocale e 3D microscopia elettronica di una cellula sensoriale specifico

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Localizzazione ultrastrutturale di LC3 endogena mediante microscopia elettronico-ottica correlativa in sezione

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Nuovo protocollo per la conservazione simultanea della fluorescenza e dell'ultrastruttura

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

Autore in primo piano: Progressi nella microscopia correlativa alla luce e all'elettronica con la conservazione delle proteine fluorescenti

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.