The authors are grateful for the financial support provided by Instituto Polit&#233;cnico Nacional grants 20120110, 20130399 and 20140239 SIP and also by Instituto de Ciencia y Tecnolog&#237;a del Distrito Federal Mexico (PICS 08-79, ICYT-DF, 2009-2012). Thanks also to CONACYT &#8211; Mexico for the graduate scholarship (225806) awarded to Selene Montserrat Garc&#237;a-Solares and for the financial support provided by grant 82627.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig1highres.jpg" width="450" /> Figura 1. Schema per le fasi del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 1. Raccogliere marine sedimenti per la Formazione dei fanghi <ol><li> Identificare un&#39;area sottomarina accessibile sia vicino a sorgenti idrotermali (a causa della presenza di solfuri, che può indicare una maggiore solfato riducendo l&#39;attività) o ad una zona in cui i residui della sostanza organica sono rilevabili. </li><li> Ai fini di questo lavoro, richiede circa 3 o 4 kg di sedimenti e drenare l&#39;acqua fuori i campioni. Mettere i campioni in sacchetti di plastica scuri. Non è necessaria alcuna refrigerazione. </li><li> Una volta in laboratorio, tenere le borse con i campioni in frigorifero, se non sono in corso per essere utilizzata immediatamente. Ai fini di questo lavoro, SAMPles può essere in frigorifero per settimane o mesi prima di utilizzarli. </li><li> Prendere una grande porzione del campione di sedimento (cioè, 1 o 2 kg) e usare una rete appropriata (0,2 cm) per eliminare dai sedimenti grande detriti di materiale carbonioso che possono essere trovati o alcune rocce che possono essere presenti. Nota: In questo caso una maglia di 0.20 cm di diametro (0,0767 in) è stato utilizzato, ma può essere di dimensioni diverse a seconda delle dimensioni delle particelle nel campione. <ol><li> Dopo aver superato il sedimento attraverso la maglia, mescolare la porzione selezionata di promuovere che la porzione è omogenea. </li><li> Prendere campioni più piccoli separati (cioè, da 2 a 3 g) determinare i solidi sospesi volatili (VSS) Opere seguendo i metodi standard 11. Nota: Vedere la Figura 2 per i passaggi 1.2 a 1.4. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig2.jpg" /> Figura 2. Le fotografie dei campioni di sedimento.Campioni (A) del sedimento appena dopo essere prese. Campione (B) del sedimento dopo il passaggio attraverso la rete. (C) Campione prelevato per la pesatura prima solidi sospesi volatili (VSS) determinazione. La piastra di Petri non ha bisogno di essere sterilizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Bioreattore Set Up <ol><li> Ai fini di questo lavoro, utilizzare un reattore in vetro UASB con un volume totale di lavoro 3 L. In alternativa, utilizzare un reattore di vetro del volume 1 o 2 L. </li><li> Sulla base del contenuto VSS dei sedimenti calcolare la quantità di sedimenti da utilizzare come inoculo per ottenere 5 g di VSS in 1 L. </li><li> Tener conto che se la quantità di sedimenti dopo il calcolo è troppo grande, quindi circa il 25% al ​​30% del volume del bioreattore dovrebbe essere occupato da sedimenti invece. <ol><li> Registrare il contenuto VSS in quantocambierà quando la comunità microbica si arricchisce nel bioreattore. Il contenuto VSS è necessario per i calcoli di solfato di ridurre l&#39;attività nel bioreattore. </li></ol></li><li> Assicurare che la concentrazione finale della soluzione tampone medio basale nel bioreattore è simile al riportato da Guerrero-Barajas et al. (2014) 12. <ol><li> Assicurarsi che i volumi finali dei sedimenti, medio basale, soluzione tampone e acidi grassi volatili sono pari al volume finale di lavoro del reattore. Il basale medio ricetta 12 contiene le concentrazioni adeguate per la metalli in tracce e vitamine soluzione. </li><li> Preparare una soluzione stock di soluzione tampone terreno di base e in una concentrazione appropriata per il volume di lavoro del reattore utilizzato (ad esempio, 2, 3 o 4 volte più concentrato di quello riportato al punto 2.4) per garantire che quando viene diluito è alla concentrazione riportata da Guerrero-Barajas et al. (2014)12). Nota: La soluzione madre per mezzo base è sempre necessario, tuttavia, la soluzione tampone è necessaria solo all&#39;avviamento. Non è necessario aggiungere soluzione tampone dopo questo tempo. </li><li> Preparare una soluzione stock di acidi grassi volatili: acetato, propionato e butirrato in 2.5: 1: 1 COD proporzione. Prendere in considerazione per il calcolo del sodio acetato incluso nel terreno di base. La concentrazione finale COD nel reattore deve essere 2,7 g / L. Attenzione: Preparare questa soluzione in una cappa aspirante. Indossare guanti di nitrile e occhiali per la preparazione di questa soluzione. Considerare la stechiometria delle reazioni di solfato con acidi grassi volatili che viene mostrato in figura 3. </li><li> Preparare una soluzione stock di solfato di sodio (Na 2 SO 4) in una concentrazione appropriata per fornire al reattore una concentrazione finale di 4,000 mg / l di ione solfato (SO 4 2-). In alternativa, includere °e quantità di solfato richiesto nel terreno di base invece di aggiungere da una soluzione madre finché il solfato finale (SO 4 2-) concentrazione è giusto. </li></ol></li><li> Posizionare i sedimenti nel reattore mescolato con una parte del terreno di base per assicurarsi che raggiungano il fondo del reattore. <ol><li> Aggiungere il resto della soluzione tampone basale medio e mescolato con la soluzione di acidi grassi volatili e la soluzione di solfato. Assicurarsi che la soluzione di acidi grassi volatili viene versato nel liquido. Nota: Effettuare questa operazione in una cappa aspirante. </li><li> Impostare le connessioni e tubazioni del reattore per la pompa di riciclo. Impostare la portata di riciclaggio a 60 ml / min. Impostare il bioreattore nella camera di temperatura a 34 ° C. Regolarmente controllare che le variazioni di temperatura sono piccole (ad esempio, 34 ± 1,7 ° C) </li><li> Impostare i collegamenti alla colonna di spostamento del gas. Nota: La Figura 4 passi da 2.1 a 2.5. </li> &lt;/ ol&gt; </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Stechiometria di riduzione solfato con VFA (acetato, propionato e butirrato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig4highres.jpg" width="400" /> Figura 4. UASB reattore. (A) tempo iniziale. (B) il regime continua dopo 300 giorni di funzionamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3. Il funzionamento del reattore per promuovere Sulfidogenesis e crescita dei microrganismi Nota: Consenti per l&#39;inoculo di consumare la volatile acidi grassi e solfato. A questo scopo, attendere una settimana per effettuare la prima analisi solfato, solfuro e consumi COD. <ol><li> Dopo una settimana di incubazione prelevare un campione di 5 a 7 ml di liquido per condurre un&#39;analisi per COD, solfato e solfuro contenuti e pH seguenti metodi standard 11, 13. <ol><li> Analizzare solfuro nella spettrofotometricamente liquido (ad una lunghezza d&#39;onda (λ) di 670 nm) seguendo il metodo di metilene blu 13. <ol><li> Porre 5 ml di una soluzione di acetato di zinco (2% w / w) in un matraccio da 25 ml, aggiungere 200 ml di rapidamente il campione alla soluzione di acetato di zinco. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di N, N -dimethyl- p-fenilendiamina ossalato soluzione (DMP) (0,2% w / w in 20% H 2 SO 4) e 125 ml di ferro (III) soluzione di solfato di ammonio (10% w / w 2% in H 2 SO 4) e terminare con acqua distillata 25 ml in matraccio tarato. Attendere 30 minuti per la reazionea verificarsi, momento in cui il colore blu è stabilizzato. 13. Nota: Attendere almeno 15 minuti, ma non più di 60 minuti per testare i campioni nello spettrofotometro. Effettuare la lettura della soluzione finale blu nello spettrofotometro. </li></ol></li><li> Analizzare solfato secondo metodi standard 11. Qui, come quantificare solfato di bario solfato utilizzando un metodo turbidimetrico. <ol><li> Mettere 5 ml di una soluzione di condizionamento (acido cloridrico HCl 1: 1) in un pallone tarato da 25 ml, aggiungere 1 ml di campione precedentemente centrifugato (a 11.320 xg), completare l&#39;25 ml del pallone tarato con acqua distillata e aggiungere 1 g di cloruro di bario. </li><li> Miscelare la soluzione per 1 minuto in un vortice. Attendere 4 min per il solfato di bario per formare e leggere il campione nel spettrofotometro a (λ) di 420 nm 11. </li></ol></li><li> Analizzare COD secondo metodi standard 11. In alternativa, utilizzare un COD DeterminaKit zione. <ol><li> Prima della determinazione COD, centrifugare il campione a fondo (a 11.320 xg) per rimuovere il solfuro restando che potrebbero interferire nella determinazione. Se necessario, centrifughi due volte: la prima volta immediatamente dopo il prelievo del campione e la seconda volta attendere 6 o 8 ore e quindi effettuare l&#39;analisi COD. </li><li> Aggiungere 2 ml di campione in una fiala reazione del kit di determinazione del COD, sigillare il flacone e omogeneizzare la miscela agitando con prudenza. Preparare un vuoto aggiungendo 2 ml di acqua distillata in un altro flacone di reazione e omogeneizzare la miscela. </li><li> Posizionare le fiale nel reattore digestione a 150 ° C per 2 ore. Rimuovere le fiale e lasciateli raffreddare nel buio. Prendere le letture dei flaconi nella spettrofotometro ad una lunghezza d&#39;onda di 620 nm. </li></ol></li><li> Ottenere il volume di gas dalla colonna spostamento gas. </li></ol></li><li> Attendere fino a un altro 5 a 7 giorni fino a quando il solfato è consumato. Solfato e COD devono essere consumati in unpproximately 85% al ​​90% prima che sia avviato un nuovo lotto alimentato. </li><li> Una volta solfato (e COD) sono consumati, completamente ripetere il punto 2.4. Fornire un mezzo fresco e nuove sostanze nutritive per ciascun lotto. </li><li> Ripetere i punti 3.1 e 3.2. A questo punto ogni partita dovrebbe durare tra i 7 ei 10 giorni. </li><li> Quando sono state completate da 3 a 4 lotti, ripetere il passaggio 2.4 ma aumentare la concentrazione di COD 4 g / L. </li><li> Ripetere il passaggio 3.1 e punto 3.2. <ol><li> Ripetere il punto 3.3, ma aumentare la concentrazione di COD 6 g / L. </li><li> Ripetere 3.6 e 3.6.1 aumentando gradualmente concentrazione COD finché è 10 g / L. Nota: rendere il grafico che presenta la concentrazione di solfato (mg / L) rispetto al tempo (d). </li></ol></li><li> Quando il consumo solfato è superiore all&#39;80% in meno di 24 ore e questo avviene per più di una settimana, commutare il funzionamento del reattore a modalità continua. Per il funzionamento continuo impostare il tempo di ritenzione idraulica (HRT) a 24 ore e mantenere la concentrazione di solfato a 4 g / L e il CODa 10 g / L. Nota: Nel corso del tempo il consumo di solfato dovrebbe essere veloce. </li></ol> 4. Solfato Ridurre test Attività <ol><li> Prima di questo test assicurarsi che il bioreattore in regime continuo presenta variazione inferiore al 10% della concentrazione di solfato rimanente. </li><li> In un dato giorno, fermare il reattore dopo un ciclo di terapia ormonale sostitutiva e condotta passo 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L. </li><li> Una volta che il bioreattore è alimentato, prendere 5 a 7 ml di campioni di liquido e per eseguire analisi COD, solfato, solfuro (passo 3.1) e pH ogni ora. Registrare il volume di gas prodotto. </li><li> Calcolare il solfato ridurre l&#39;attività secondo la letteratura 14. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq1.jpg" /></li></ol> SRA = solfato riducendo l&#39;attività (mg COD-H 2 S) / gVSS * d m H 2 </em&gt; S = concentrazione di solfuro espressa come mg COD-H 2 S VSS = volatili concentrazione di solidi sospesi t = tempo (d o ore) <ol start="5"><li> Fare le corrispondenti grafici che mostrano la percentuale di consumo di solfato in funzione della concentrazione di solfuro nel tempo in mg / L. Rendere i grafici che mostrano percentuale del consumo COD nel tempo. Rendere i grafici che mostrano la variazione di pH nel tempo. </li></ol> 5. tricloroetilene (TCE) Riduzione di prova <ol start="1"><li> Prima di questo test assicurarsi che il bioreattore lavora in regime continuo e presenta variazione inferiore al 10% della concentrazione di solfato rimanente. Non iniziare il test se riduzione solfato nel bioreattore è inferiore al 90%. </li><li> Preparare una soluzione stock di tricloroetilene (TCE) tenendo conto che la concentrazione finale di questo composto nella fase liquida del bioreattore deve essere di 300 micron. Si consideri il partitioning del composto allo spazio di testa utilizzando la costante adimensionale legge Henry&#39;s (H&#39;) per TCE a 34 ° C. H&#39;at 34 ° C per il TCE è 0,4722. <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq2.jpg" /> Attenzione: Preparare questa soluzione in un fumehood e indossare guanti e occhiali protettivi. <ol><li> Ad esempio, per una soluzione madre 5.000 micron, calcolare come seguito: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq3.jpg" /> Concentrazione TCE fase gassosa = (0,4722) * (5000) = 2.139 micron. Includere questa concentrazione nella preparazione della soluzione di riserva poiché questa quantità di TCE sarà nello spazio di testa. Poi nel liquido (acqua) della soluzione madre, la concentrazione effettiva TCE sarà: 5,000 + 2,139 = 7.139 pM. Densità TCE = 1,43 g / ml. Convertire il 7139 pM a mg e poi in base alla densità del TCE calcolare il volume del TCE per soluzione madre. Nota: La concentrazione della soluzione madre TCE may essere inferiore a 5.000 micron, cioè, 3000 o 1000 pM, questo dipende dalla quantità di volume di tale soluzione può essere consegnato al bioreattore secondo il volume fase liquida. </li></ol></li><li> Preparare curve standard nel gascromatografo per TCE, cis--1,2 dicloroetilene, trans -1,2-dicloroetilene, cloruro di vinile e etene. Preparare i cis -1,2-dicloroetilene e trans -1,2-DICLOROETILENE curve standard da una soluzione madre di questi composti seguendo la stessa procedura descritta per la soluzione 5.2 TCE magazzino. Preparare le curve standard per il cloruro di vinile e etilene diluendo la concentrazione di ciascun gas dagli standard (cilindri gas). <ol><li> Preparare le curve standard di questi composti in una gamma da 20 a 300 micron. Utilizzare il metodo riportato da Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 per l&#39;analisi di questi composti nel gascromatografo. Attenzione: Preparare questi standLe soluzioni ard in un fumehood e indossare guanti e occhiali protettivi. </li></ol></li><li> In un dato giorno, fermare il reattore dopo un ciclo di terapia ormonale sostitutiva e condotta passo 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L. </li><li> Una volta che il bioreattore viene alimentato, aggiungere il TCE direttamente al liquido nel bioreattore dalla soluzione madre preparata in 5.2, la concentrazione finale TCE nella fase liquida del bioreattore deve essere di 300 pM. Impostare la HRT di 12 ore. <ol><li> Alla fine di un ciclo HRT prelevare campioni di liquido (500 a 1,000 microlitri) e l&#39;analisi condotta per COD, solfato e solfuro (passi 3.1.1, 3.1.2 e 3.1.3). Prelevare campioni di spazio di testa (100 a 250 microlitri) e condurre analisi per TCE, cis -1,2-dicloroetilene, trans -1,2-dicloroetilene, cloruro di vinile e etilene nel gascromatografo. </li></ol></li><li> Ripetere il punto 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L. </li><li> Non ripetere qualsiasi test riduzione TCE fino al bioreattore presenta oltre 9Riduzione 0% solfato e meno del 10% di variazione in entrambi, riduzione solfato e solfato rimanente nel bioreattore. </li><li> Ripetere 5.4, 5.5 e 5.6 due o tre volte di più. </li><li> Dai campioni di sedimento (0,5 g) per condurre l&#39;identificazione dei microrganismi subito dopo un test di riduzione TCE è terminata. Fare questo dopo 2 o 3 test di riduzione del TCE. </li></ol> 6. Solfato Ridurre test attività dopo TCE Riduzione Experiment <ol start="1"><li> Ripetere il punto 4 completamente. </li></ol> 7. Individuazione dei Microrganismi <ol><li> Prelevare campioni di fanghi di circa 0,5 g ciascuno e condurre l&#39;estrazione di RNA totale secondo il metodo standard 12. </li><li> Amplificare il gene 16S rRNA con la trascrizione inversa e condurre la reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) Rinforzo un passo 12. </li><li> Progettare i primer per amplificare o usare come un primo approccio quelli proposti nella letteratura 11. Seguire la amplifProcedura icazione suggerito in letteratura 12. </li><li> Costruire le librerie 16S rRNA. Ampliconi della PCR possono essere clonati utilizzando un kit di clonazione-11. Tipicamente, 10 colonie da ciascuna piastra (ogni colonia rappresenta un prodotto PCR) possono essere clonati. Preparare il DNA plasmidico per sequenziamento secondo quanto suggerito in letteratura 12. </li><li> Condurre il sequenziamento dei frammenti. Re-amplificare circa 1.400 bp dei prodotti esterni PCR con il protocollo per l&#39;amplificazione PCR precedentemente descritto (passo 7.4) e clone secondo quanto suggerito in letteratura 12. Isolare il plasmide ricombinante da E. colonie coli come suggerito in letteratura 12. Non condurre la gara parziale per il sequenziamento con M13 primer universali 12. </li><li> Effettuare l&#39;analisi di sequenze. Allineare le sequenze nucleotidiche tramite Clustal X e regolare manualmente nell&#39;editor di testo. Effettuare ricerche BLAST delle databas NCBIe. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12. </li><li> Ottenere i numeri di accesso sequenza nucleotidica. Depositare le sequenze nucleotidiche dei cloni individuati nel database sequenza nucleotidica EMBL (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) sotto i corrispondenti numeri di accesso (ad esempio, per le sequenze da JQ713915eJQ713925 ampliconi) 12. </li></ol>

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The authors Selene Montserrat Garc&#237;a-Solares, Claudio Garibay-Orijel and Claudia Guerrero Barajas submitted (as inventors) in 2012 the application to obtain a patent entitled: &#8220;Process for the anaerobic treatment of industrial wastewater with high content of sulfate and chlorinated compounds&#8221;. This submission has been approved to the stage of the formatting. The submission has Instituto Polit&#233;cnico Nacional as the rights owner.

Ci sono diverse applicazioni di sulfidogenesis della biotecnologia ambientale, una delle applicazioni più utilizzate del metabolismo dei batteri solfato riducenti in consorzi con fermentazione batteri è in trattamento delle acque reflue. Reattori UASB sono tra i principali approcci di ingegneria al trattamento delle acque reflue industriali con alte concentrazioni di solfato. In questo lavoro, vi presentiamo un protocollo per ottenere fanghi sulfidogenic da sedimenti marini in un reattore UASB. Le fasi critiche nel pr...

Uno dei contributi più importanti alla biotecnologia ambientale è stata la progettazione di bioreattori in cui il fanghi utilizzati (inoculo) era in grado di eseguire in condizioni solfato riducendo. Riduzione solfato (SR) consente il trattamento dei flussi di acque reflue che contengono elevate concentrazioni di solfato oltre alla rimozione simultanea di COD, metalli pesanti e inquinanti organici, un fatto che rende una caratteristica desiderabile SR dei fanghi 1. Alcuni esempi di effluenti contaminati con solfato provengono da conceria, carta, farmaceutico e manifatturiero industrie chimiche 1. Tuttavia, la maggior parte della letteratura si riferisce a sulfidogenic fanghi quando metanogenica fango granulare è stata adattata per sulfidogenesis 2. Questo adattamento è comunemente ottenuto manipolando il COD / SO 4 2- rapporto nel bioreattore e aggiunta di prodotti chimici per inibire methanogens del 2,3 fanghi. In aggiunta al tempo che may richiedere la formazione di granuli sulfidogenic, la competizione tra methanogens e riduttori di solfato e la tolleranza del fango ad alte concentrazioni di solfuro sono alcuni dei problemi principali che possono insorgere se l&#39;fanghi sulfidogenic utilizzato nel bioreattore è ottenuto dall&#39;adattamento di prevalentemente fanghi metanogenica di solfato condizioni riducenti. In questo lavoro, si descrive la procedura per ottenere un fango prevalentemente sulfidogenic da sorgenti idrotermali sedimenti (Punta Mita, Nayarit, Messico) in un anaerobico reattore fanghi coperta flusso verso l&#39;alto (UASB), poi si valuta il suo solfato riducendo l&#39;attività nel tempo e condurre un esperimento per valutare la sua applicazione su declorazione riduttiva. La posizione dei sedimenti è stato scelto perché è stato riferito che in quel sito vi è formazione di solfuri dovuta all&#39;attività solfato riducendo esibito dalla comunità microbica che abitano quel determinato posto 4. Ci sono severAl vantaggi nell&#39;ottenere questo fanghi sulfidogenic da sedimenti più di adattarsi metanogenica fango granulare a sulfidogenesis. Alcuni di questi vantaggi sono: (1) non è necessario formare granuli per il bioreattore di operare, (2) i fanghi tollera concentrazioni relativamente elevate di solfuro rispetto ad altri UASB che operano con adattato fanghi methanogenic, e (3) non viene competizione per substrato con methanogens anche se acetato è utilizzato nella miscela di acidi grassi volatili che è incluso nel mezzo di coltura per promuovere la formazione di fanghi. Questa procedura è stata seguita per promuovere sulfidogenesis perché sedimenti marini sono una piscina naturale di una grande varietà di microrganismi come batteri solfato riduzione, fermentazione batteri e dealogenante batteri solo per citarne alcuni 5,6. Il tipo di consorzio sviluppato da sedimenti marini utilizzando questo protocollo può presentare efficienza nella riduzione solfato e quindi, alti s<html> ulfate riducendo l&#39;attività nel tempo e maggiore tolleranza al solfuro a concentrazioni superiori al segnalato come tossici per methanogens e solfato riducendo batteri. D&#39;altro canto, è probabile che la capacità dealogenante è anche mostrato nei sedimenti seguendo il protocollo qui proposto ma può dipendere dalla comunità microbica originale. Questa ipotesi viene fatto sulla base del fatto che la declorazione riduttiva può avvenire sia con la respirazione o co-metabolismo, entrambe le condizioni che possono essere promossi nella comunità microbica marina 7. La coltivazione dei sedimenti per ottenere i fanghi è stata condotta utilizzando una miscela di acetato, propionato e butirrato come substrato perché questi acidi grassi volatili sono utilizzati da diversi ceppi di batteri solfato-riduzione. Questi acidi sono anche il tipo di composti di carbonio spesso si trovano nei sedimenti marini, secondo diversi rapporti in letteratura sul materiale carbonioso in sedimenti marini 5,6. content &quot;&gt; Infine, alcuni dei composti più tossici che si trovano in corpi idrici e altri acqua in tutto il mondo sono i solventi clorurati come il tricloroetilene (TCE) o percloroetilene (PCE). Questi composti sono tossici, non solo per l&#39;essere umano, ma anche a microrganismi, in particolare TCE, che è ancora considerato un inquinante prioritario dall&#39;Agenzia di Protezione Ambientale degli Stati Uniti 8. In questo lavoro abbiamo proposto un esperimento in cui i fanghi sulfidogenic è testato su sua capacità di ridurre TCE a concentrazioni che sono nella gamma riportato per composti clorurati biodegradazione in condizioni methanogenic 9,10. Vale la pena ricordare che la maggior parte della ricerca sulla biodegradazione di composti clorurati è stata condotta in condizioni methanogenic 9,10. Riteniamo che l&#39;esperimento con TCE proposto in questo protocollo è un buon esempio delle potenziali applicazioni del fango. L&#39;obiettivo di questo esperimento era di evalutare la tolleranza del fango al TCE e l&#39;effetto TCE sul solfato riduzione dell&#39;attività. Tenendo conto che la maggior parte della ricerca sulla biodegradazione di composti clorurati è effettuata in condizioni methanogenic, questo protocollo suggerisce la formazione di un fango può essere usato per simultaneamente: (1) rimuovere solfato, (2) rimuovere COD e (3) rimuovere composti clorurati. Un ulteriore passo potrebbe essere quello di valutare l&#39;fanghi sulla rimozione simultanea del TCE e metalli pesanti (in aggiunta a solfato e COD), due condizioni che non possono essere valutati in condizioni methanogenic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>trichloroethylene&#160;</td>
			<td>sigma Aldrich</td>
			<td align="right">251402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cis- 1,2 dichlorotehylene</td>
			<td>sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-1,2 dichloroethylene</td>
			<td>sigma Aldrich</td>
			<td>D-62209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vinyl chloride scotty standard</td>
			<td>supelco</td>
			<td></td>
			<td>1000 ppm v/v in nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethene scotty standard</td>
			<td>supelco</td>
			<td></td>
			<td>99% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td></td>
			<td>Model 7553-75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas tight syringes&#160;</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>100 and 200 microliters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASB glass reactor</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>under design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas chromatograph&#160;</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>FID detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capillary column SPB-624</td>
			<td>supelco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>viton tubing</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basal medium reagents</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trace metals reagents</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vitamins solution reagents</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfate</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volatile fatty acids</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COD determination kit</td>
			<td>HACH</td>
			<td></td>
			<td>range 0-15000 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO-TA cloning kit pCR&#174;4.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.N.A.P. TM Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of sulfidogenic sludge from marine sediments and trichloroethylene reduction in an upflow anaerobic sludge blanket reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Un comportamento tipico della riduzione solfato nel bioreattore è mostrato in Figura 5. E &#39;importante notare che durante le prime settimane di riduzione solfato funzionamento sarà lenta. Tuttavia lento, il consumo di oltre il 90% di solfato nel tempo indica che l&#39;inoculo sta sviluppando una comunità microbica in grado di ridurre solfato e quindi arricchito in solforiduttori batteri. I diversi periodi della cifra indicano che la riduzione del solfato aumentava la sua velocità...

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Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

Sviluppo di Sulfidogenic fanghi da Marine Sedimenti e Tricloroetilene Riduzione in una coperta reattore Upflow anaerobica dei fanghi

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

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JoVE Journal

Environment

9.6K Views.  Instituto Politécnico Nacional. Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

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A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l&#39;attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

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Ambiente

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, un metodo migliorato per Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Misura di particolato e sciolto composti elaborati da Alimentatori sospensioni attive

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

The protocol provides a methodology to solubilize aerobic granular sludge in order to extract alginate-like extracellular polymers (ALE).

Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended sediment on various aquatic species and life stages in the laboratory by using pumps and automating delivery of sediment and water to simulate suspension of sediment. FLEES data are used to develop exposure-response curves between the effects on aquatic organisms and suspended sediment concentrations at the desired exposure duration. The effects data are used to evaluate management practices used to reduce the interactions between aquatic organisms and anthropogenic causes of suspended sediments. The FLEES is capable of generating total suspended solids (TSS) concentrations as low as 30 to as high as 800 mg/L, making this system an ideal choice for evaluating the effects of TSS resulting from many activities including simulating low ambient levels of TSS to evaluating sources of suspended sediments from dredging operations, vessel traffic, freshets, and storms.

A robust and flexible flow-through exposure system designed to maintain sediment in suspension is presented. The system is used to investigate the effects of suspended sediment on various aquatic species and life stages in the laboratory.

Un sistema di esposizione di flusso-through per valutare sospeso Sedimenti Effetti sulla vita acquatica

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.

Preparazione di pirite Autigenesi da sedimenti di metano-cuscinetto per In Situ l'analisi di isotopi di zolfo utilizzando SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Sviluppo di nuovi metodi per quantificare la densità di pesce utilizzando strumenti di Stereo-video subacquei

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

An Ultra-clean Multilayer Apparatus for Collecting Size Fractionated Marine Plankton and Suspended Particles

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those of suspended/sinking particles. Here, we present an all plastic (Polypropylene and Polycarbonate), multi-layer filtration system for collection of suspended particulate matter (SPM) at sea. This ultra-clean sampling device has been designed and developed specifically for trace element studies. Meticulous selection of all non-metallic materials and utilization of an in-line flow-through procedure minimizes any possible metal contamination during sampling. This system has been successfully tested and tweaked for determining trace metals (e.g., Fe, Al, Mn, Cd, Cu, Ni) on particles of varying size in coastal and open ocean waters. Results from the South China Sea at the South East Asia Time-Series (SEATS) station indicate that diurnal variations and spatial distribution of plankton in the euphotic zone can be easily resolved and recognized. Chemical analysis of size-fractionated particles in surface waters of the Taiwan Strait suggests that the larger particles (&#62;153 &#181;m) were mostly biologically derived, while the smaller particles (10 - 63 &#181;m) were mostly composed of inorganic matter. Apart from Cd, the concentrations of metals (Fe, Al, Mn, Cu, Ni) decreased with increasing size.

Plankton and suspended particles play a major role in the biogeochemical cycles in the ocean. Here, we provide an ultra-clean, low stress method for the collection of various sizes of particles and plankton at sea with the capability of handling large volumes of seawater.

Un apparato multistrato ultra-pulito per la raccolta di plancton marino dimensioni frazionato e particelle in sospensione

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ocean temperatures and ocean acidification, corals are increasingly under threat. To tackle these challenges, advances in cell and molecular biology have proven to be crucial for diagnosing the health of corals. Modifying some of the techniques commonly used in human medicine could greatly improve researchers&#39; ability to treat and save corals. To address this, a protocol for in situ hybridization used primarily in human medicine and evolutionary developmental biology has been adapted for use in adult corals under stress.
The purpose of this method is to visualize the spatial expression of an RNA probe in adult coral tissue that has been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This method focuses on removal of the paraffin and rehydration of the sample, pretreatment of the sample to ensure permeability of the sample, pre-hybridization incubation, hybridization of the RNA probe, and visualization of the RNA probe. This is a powerful method when using non-model organisms to discover where specific genes are expressed, and the protocol can be easily adapted for other non-model organisms. However, the method is limited in that it is primarily qualitative, because expression intensity can vary depending on the amount of time used during the visualization step and the concentration of the probe. Furthermore, patience is required, as this protocol can take up to 5 days (and in many cases, longer) depending on the probe being used. Finally, non-specific background staining is common, but this limitation can be overcome.

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

The goal of this protocol is to perform in situ hybridization on adult coral samples that have been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This is a qualitative method used to visualize the spatial expression of an RNA anti-sense probe in paraffin-embedded tissues.

In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

Un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...