A differenza degli organismi aerobici, i microrganismi strettamente anaerobici richiedono l'assenza di ossigeno. Poiché l'ossigeno è onnipresente nell'aria, mantenere condizioni senza ossigeno durante la coltivazione è un prerequisito per la coltivazione anaerobica. La tecnica applicata rappresenta un metodo semplice ed economico per fornire condizioni anossiche per coltivare una popolazione microbica mista in coltura liquida.
Questa tecnica può essere applicata anche per la coltivazione di colture pure. Tuttavia, per i microrganismi altamente sensibili all'ossigeno, questa procedura potrebbe non essere applicabile. Iniziare pesando ingredienti medi in un pallone appropriato e sciogliendoli con mezzo volume di acqua distillata.
Quindi, aggiungere millilitro dell'indicatore REDOX, seguito da vitamine nella soluzione di oligoelementi. Regolare il pH in base alle esigenze dell'organismo e portare il volume finale a 1 litro con acqua distillata. Il colore dell'indicatore REDOX dipende dal pH e potrebbe richiedere del tempo per essere regolato.
Riempire i flaconi di siero da 120 millilitri con 50 millilitri di mezzo, quindi incubarli in un bagno d'acqua di 100 gradi Celsius per 20-30 minuti, per ridurre la solubilità dell'ossigeno in fase liquida. Sciacquare lo spazio della testa con azoto. Prenditi cura di un'adeguata ventilazione della stanza quando lavori con azoto.
Chiudere i contenitori con setti di gomma butile e fissare i tappi in alluminio. Quindi, aggiungere 0,1 millilitri di agente riducente a ciascun pallone, per ridurre ulteriormente il potenziale REDOX. E autoclavare i contenitori per 20 minuti a 121 gradi Celsius.
Un'autoclave certificata per la sterilizzazione di navi chiuse deve essere utilizzata per l'applicazione di questo protocollo. In caso contrario, la sovrapressione derivante dall'aumento della temperatura potrebbe causare l'esplosione di fiasche siere. Per preparare l'inoculo dal digester anaerobico, aggiungere 400 millilitri di acqua distillata in un pallone e portarlo a ebollizione.
Raffreddarlo a circa 30 gradi Celsius mentre si lava permanentemente lo spazio della testa con azoto. Aggiungere circa 100 grammi di fanghi, derivati da un digester anaerobico, assicurandosi di registrarne la massa esatta per la determinazione della diluizione. Scambiare lo spazio della testa del pallone con azoto e chiuderlo con un setto di gomma butile.
Agitare il pallone per 30 minuti a 120 giri/min. Lasciare sedimentare particelle di fango più grandi, quindi utilizzare una siringa e una canula per rimuovere 5 millilitri di inoculo e iniettarlo in un pallone sierico precedentemente preparato. Incubare il pallone siero inoculato ad una temperatura appropriata per l'esperimento, assicurandosi di drenare la sovra pressione causata dall'aumento della temperatura, circa 15-30 minuti dopo l'inizio dell'incubazione.
Per valutare la produzione e la composizione di gas bio durante il tempo di incubazione, registrare la pressione atmosferica corrente e preparare un manometro per valutare la pressione all'interno del pallone. Agitare i contenitori e rimuovere 1 millilitro di gas spazio sulla testa usando la siringa e la canula. Misurare la concentrazione di idrogeno, ossigeno, metano e anidride carbonica usando la gascromatografia.
Utilizzare 1 millilitro di liquido dal pallone per monitorare le concentrazioni di tutti gli acidi grassi alti, secondo le indicazioni manoscritte, e scolare i contenitori sopra la pressione dopo averli tornati alla temperatura appropriata. Questo protocollo è stato utilizzato per creare bioreattori in miniatura che conducono digestione anaerobica. Triptofano, tirosina, fenilalanina, estratto di carne e caseina sono stati aggiunti a 3 diverse concentrazioni e la produzione di metano è stata monitorata in un periodo di incubazione di 28 giorni.
I metanogeni sono stati visualizzati irradiando il co-enzima F420, che è un vettore elettronico nella metanogenesi, e mostra una fluorescenza blu-verde con un assorbimento massimo a 420 nanometri. In concomitanza con l'analisi dei gas, sono stati analizzati campioni per acidi grassi volatili e concentrazioni di acido fenile durante il periodo di incubazione. I metodi biologici molecolari che mira all'abbondanza di microrganismi specifici e/o alla composizione della comunità microbica, ad un certo punto dell'esperimento, possono essere applicati secondo la procedura descritta.
