Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca e sviluppo per la società della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT &amp; Future Pianificazione (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. Estrazione del DNA da linee cellulari FFPE di riferimento standard Nota: Per questa procedura, estrazione del DNA è stata effettuata da linee cellulari standard di riferimento FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) utilizzando il tessuto DNA Kit di isolamento FFPE come descritto nel protocollo di seguito. Estrazione del DNA automatizzato è stato ottenuto seguendo le istruzioni del produttore per l&#39;estrazione del DNA totale. <ol><li> Utilizzando un microtomo e il blocco FFPE originale, preparare manualmente sezioni fresche prima di estrazione del DNA e analisi, secondo le procedure stabilite. Assicurarsi che l&#39;ingresso campione per la sezione di tessuto (s) analizzato non superi uno spessore totale di 10 micron e che la superficie non supera 600 mm 2 per una singola sezione. </li></ol> 1.2 Protocollo di TPS Nota: I volumi indicati nella tabella 1 corrispondono al minimo richiesto per elaborare 48 campioni, e la proceduraindicato è in conformità con le linee guida TPS. Prima di iniziare l&#39;esperimento sistemarsi i campioni FFPE nell&#39;e-tubo per centrifugazione a 600 xg, per evitare la perdita dei campioni nel corso del programma automatico. <ol><li> Accendere lo strumento isolamento del DNA automatizzato e il computer. Aprire il software di controllo Esegui e inserire un vassoio di caricamento automatico nella zona di piano di carico TPS. </li><li> Versare il reagente nelle loro depressioni corrispondenti, come mostrato in Figura 1. <ol><li> Posizionare i 4 campioni (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% e 1%) nei rack vettore campione. </li><li> Posizionare le scatole di punta nelle vaschette nelle colonne 2 e 3 e consultare i suggerimenti per la presenza di più di un filtro per ogni suggerimento, che interrompe la corsa. </li><li> Assicurare corretta miscelazione del tampone di lisi e tampone di lavaggio invertendo loro 3-5 volte e caricarle nelle rispettive depressioni nella colonna 4 (Figura 1). </li><li> Dopo l&#39;inversione per poche volte o Vort miteexing, caricare il tampone di eluizione, sfere magnetiche, e di buffer FFPE nelle piccole depressioni nella colonna 5, lasciando 1 slot vuoto dove indicato (Figura 1, Tabella 1). </li><li> Caricare un 2 ml profondo pozzetti (DWP) sul supporto piastra (Figura 1). </li></ol></li><li> Effettuare le seguenti operazioni finali prima di iniziare una corsa: <ol><li> Stappare tutti i tubi e le depressioni dei reagenti. Confermare che dispone di sufficiente capacità nella bottiglia rifiuti liquidi. Verificare che la bottiglia rifiuti solidi è vuota e foderato con un sacchetto. Verificare che la piastra di punta di espulsione è centrata nel gruppo dei rifiuti. </li><li> Chiudere il coperchio anteriore. </li></ol></li><li> Avviare il software. Aprire il file NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li> Fare clic su &quot;Start&quot;. Lo stato dello strumento passa dal minimo a correre. </li><li> Inserire il numero di campioni per questa esecuzione. Scegliere il metodo desiderato per questa esecuzione (DNA = 0). Inserire la posizione della prima alta volume punta, selezionando &quot;1&quot; se tutti i vassoi sono pieni. Inserire la posizione della prima punta volume standard, selezionando &quot;1&quot; se tutti i vassoi sono pieni. Nota: Lo strumento quindi eseguire attraverso passaggi automatizzati senza l&#39;intervento dell&#39;utente. Un flusso di lavoro dettagliato è illustrato nella figura 2. Una volta che l&#39;esperimento è finito, rifiuti reagenti e punte sono iniettati nella piletta. </li><li> Quantificare DNA genomico purificato utilizzando un metodo fluorimetrico. Nota: campioni di DNA che contengono una concentrazione minima di 3,3 ng / ml sono sottoposti a ddPCR analisi (sezione 2). </li></ol> 2. DNA Mutazione Profiling: ddPCR protocollo Nota: Il protocollo per mutazione del DNA profiling consiste di 3 fasi principali: 1) generazione Droplet, 2) Convenzionale amplificazione PCR, 3) la lettura di gocce e 4) mutazione del DNA profiling. 2.1. Generazione Droplet Nota: ddPCR Supermix èconsigliato per ddPCR, come questa miscela contiene reagenti necessari per la generazione di goccioline. <ol><li> Per evitare la contaminazione, seguire le precauzioni standard, ad esempio indossando guanti, utilizzando una cappa pulita PCR, pipette pulite, e tubi basso contenuto proteico vincolante. </li><li> Assicurarsi che la concentrazione minima di campione di DNA genomico umano è di 3,3 ng / ml. Nota: La quantità di concentrazione del campione di DNA purificato varia in base all&#39;analisi di rilevamento della frequenza di mutazione%. </li><li> Montare miscele di reazione a piastre PCR da 96 pozzetti. Scongelare ed equilibrare i componenti di reazione di RT. Preparare le reazioni PCR combinando 2X ddPCR supermix (10 ml) e 20 primer (avanti e indietro, 900 nm) e sonda (250 Nm), con ogni campione di DNA purificato (66ng / 2 ml), portare a 20 ml con acqua distillata (come secondo il protocollo generatore di gocce) </li><li> Agitare accuratamente la miscela di garantire l&#39;omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto al fondo della provetta prima di dispensare. Carico 20 &amp; #181; l sulla cartuccia per la formazione di goccioline. </li><li> Il funzionamento del generatore di gocce, per protocollo consigliato dal produttore <ol><li> Inserire la cartuccia nel supporto con la tacca nella cartuccia posizionato sul lato superiore sinistro del titolare. Aggiungere 20 ml di miscela di reazione contenente campioni in mezzo, e 70 ml di olio di generatore nei pozzetti inferiori. </li><li> Fissare la guarnizione nella parte superiore della cartuccia. Assicurarsi che la guarnizione sia saldamente agganciato su entrambe le estremità del titolare; altrimenti, pressione sufficiente per la generazione di goccioline non sarà raggiunto. </li><li> Aprire il generatore gocciolina premendo il tasto verde sulla parte superiore dello strumento e inserire la cartuccia. Quando la porta è nella posizione corretta, sia la potenza (sinistra a destra) e il supporto (destra centro) spie sono verdi. </li><li> Premere il pulsante in alto sullo strumento nuovo per chiudere la porta e avviare la generazione delle gocce. Nota: Dopo aver premuto il button, un collettore si posizioni sopra i pozzi di scarico, disegno e campioni di olio attraverso i canali microfluidica, dove vengono create le goccioline. Goccioline confluiscono goccia pozzo, dove si accumulano. La spia delle gocce (a destra) lampeggia in verde dopo 10 secondi per indicare che la generazione delle gocce è in corso. </li><li> Quando la generazione delle gocce è completo, tutti gli indicatori 3 luci cambiano a verde fissa; aprire la porta premendo il pulsante, e rimuovere il supporto dall&#39;unità. Rimuovere la guarnizione usa e getta dal supporto e scartarla. Nota: I primi pozzetti della cartuccia contengono goccioline, ed i pozzetti medio e basso sono quasi vuoto, con una piccola quantità di olio residuo. </li></ol></li></ol> 2.2. Preparazione per la PCR <ol><li> Per ciascun campione, Pipettare 40 ml del contenuto goccioline dall&#39;alto bene le cartucce in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti PCR raccomandata indicata nella protocollo dello strumento del produttore. Note: Usando una pipetta multicanale è ideale per trasferire le goccioline emulsioni. Lento e dolce l&#39;aspirazione di goccioline si consiglia di ridurre al minimo delle gocce di taglio durante i trasferimenti. </li><li> Sigillare la piastra PCR con pellicola subito dopo il trasferimento gocce per evitare l&#39;evaporazione. Utilizzare piastra del foglio perforabili che sono compatibili con la pellicola sigillante PCR e gli aghi nel lettore gocciolina. Seguire le istruzioni riportate nel manuale di istruzioni sigillante piatto PCR. </li><li> Impostare la temperatura della piastra sigillante a 180 ° C e il tempo di 5 sec. </li><li> Toccare la freccia per aprire lo sportello del vassoio. Posizionare il blocco di supporto sul vassoio con il lato di 96 pozzetti rivolto verso l&#39;alto. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul blocco di supporto e assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono allineati con il blocco di supporto. </li><li> Coprire la piastra a 96 pozzetti con 1 foglio di pellicola di sigillo perforabile. Una volta che la piastra a 96 pozzetti è fissato sul blocco di supporto e coperto con la pellicola di sigillo perforabile, toccare il pulsante di tenuta. Il vassoio si chiudee saldatura a caldo avvierà. </li><li> Quando termosaldatura è completa, la porta si apre automaticamente; rimuovere la piastra dal blocco calore per cicli termici e quindi rimuovere il blocco di calore. </li><li> Assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono sigillate verificando che le depressioni del foglio sono evidenti su ogni bene. Una volta sigillato, il piatto è pronto per cicli termici. </li><li> Una volta che le goccioline vengono rimossi, premere i fermi sul supporto della cartuccia per aprirlo. Rimuovere la cartuccia vuota e disfarsene. </li><li> Eseguire convenzionale amplificazione PCR seguendo i parametri descritti nella tabella 2. </li></ol> 2.3 lettura Droplet (come da protocollo consigliato dal produttore) Nota: Dopo l&#39;amplificazione PCR del target di acido nucleico nelle goccioline, lo strumento lettore gocciolina analizza ogni gocciolina singolarmente usando un sistema di rilevamento 2-colore 13. Noi di solito impostato per rilevare un FAMd VIC fluorofori giornalista. <ol><li> Fai clic su &quot;Sistema Flush&quot; per innescare il lettore droplet e renderlo pronto per l&#39;analisi ddPCR. </li><li> Caricare la piastra nel lettore droplet e cliccare su &quot;start&quot;. Il lettore gocciolina aspira ogni campione, singulates le goccioline, e torrenti in fila davanti a un rilevatore a 2 colori. Il rivelatore legge le goccioline enumerare campioni positivi e negativi. </li><li> Quando la lettura delle gocce, aprire la porta e rimuovere il supporto targa dall&#39;unità. Rimuovere la piastra PCR a 96 pozzetti dal supporto e scartarla. </li><li> Per una corretta manutenzione, sostituire l&#39;olio lettore di droplet e svuotare il contenitore di raccolta in base alle esigenze. Aggiungere 50 ml di candeggina al 10% per la bottiglia degli scarti per evitare la crescita microbica. </li></ol> 2.4 DNA mutazione del profilo (come da protocollo consigliato dal produttore) Nota: le goccioline PCR-positivi e PCR-negativi sono contate per fornire quantific assolutozione di destinazione mutazioni BRAF V600E DNA in forma digitale, utilizzando software di analisi dei dati. <ol><li> Fare clic su Imposta per inserire le informazioni relative ai campioni, saggi, ed esperimenti. </li><li> Nella finestra di installazione, caricare una piastra (filename.qlp), quindi fare clic su Analizza per aprire e analizzare i dati. L&#39;interfaccia di analisi dei dati è suddiviso in tre finestre: Tabella Risultati, ben Selector e dati oggetto di trattamento / grafico di visualizzazione. </li><li> Nella finestra dati elaborati, i dati di concentrazione per ogni target appaiono nei pozzetti nella mappa piastra e sono riportati nella tabella dei risultati. Clicca Concentrazione per visualizzare i dati Terreni di concentramento. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma.">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair.">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim e Young Kim Deug sono dipendenti di ABION CRO.

Qui, si evidenzia l&#39;applicabilità di ddPCR e isolamento del DNA da campioni di linee cellulari normali di riferimento FFPE una specifica valutazione mutazione del gene. In questo studio, TPS DNA metodo di isolamento automatico viene utilizzato, che può essere facilmente adattato, automatizzato, e può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo per esperimenti su scala più ampia e bassa variabilità. Uno dei limiti di isolamento del DNA nel presente lavoro è che ogni campione FFPE è unic...

L&#39;accumulo di mutazioni genetiche nei principali geni regolatori altera programmazione cellula normale come la proliferazione cellulare, il differenziamento e la sopravvivenza, che porta al cancro 1. La chinasi RAS-RAF-MAP media le risposte cellulari ai segnali di crescita. Mutazioni BRAF oncogeno possono derivare da mutazioni del driver nel gene BRAF, che possono causare il BRAF oncoprotein a diventare iperattiva 2. Le mutazioni nel gene BRAF anche tradursi nella segnalazione a valle iperattiva tramite MEK e ERK 3, che, a sua volta, porta alla crescita eccessiva delle cellule e la proliferazione indipendentemente da fattore di crescita-mediata regolazione 4-6. Sono disponibili diversi strumenti per la mutazione del DNA profiling, come ad esempio in tempo reale mutazioni BRAF V600E quantitativi fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) di riferimento standard di linee cellulari di ddPCR. ddPCR è un metodo basato sulla PCR per la quantificazione assolutaoffrendo una maggiore precisione rispetto ai tradizionali quantitativa real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fornisce anche una maggiore potenza e precisione la risoluzione per la rilevazione di mutazioni rare nei modelli di DNA, consentendo la ricerca sul cancro più informativo e la diagnosi 9. Ulteriori vantaggi di ddPCR oltre qPCR convenzionale sono la sua maggiore sensibilità e precisione quando si studia il numero di copie a basso modello 10-12. Qui, un protocollo per estrarre automaticamente DNA da linee cellulari normali riferimento FFPE, seguiti da determinare la presenza o l&#39;assenza di mutazioni BRAFV600E da ddPCR è dimostrata. L&#39;utilizzo di software per l&#39;analisi dei dati e una rappresentazione grafica dei risultati sono anche descritti. L&#39;intera procedura è relativamente semplice e totalmente dipende dal numero di campioni da profilati e il numero delle macchine convenzionali PCR e ddPCR disponibili. Il protocollo che segue descrive le procedure standard per la BR<html> AF-V600E positivi di riferimento FFPE linee di cellule normali (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) viene eseguita in uno strumento completamente automatico che utilizza il protocollo Tissue preparazione sistema (TPS). Successivamente, i campioni di DNA isolati vengono analizzati per la presenza di mutazioni BRAF V600E utilizzando il sistema ddPCR. Analisi mirata mutazione viene eseguita dopo tutti i campioni sono stati profilato e i dati sono stati caricati nel software di analisi dati. A seconda del numero di campioni / gruppi studiati, analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. Il componente sperimentale della metodologia richiede accuratezza nella gestione <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="L&#39;isolamento degli acidi nucleici da lievito, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di RNA">DNA</a> erological Pipette e pipette, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di pipettaggio &quot;&gt; pipettaggio in 96 pozzetti, mentre l&#39;analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Per la nostra analisi ddPCR, abbiamo studiato le linee di cellule normali di riferimento mutazione FFPE BRAFV600E. Il lettore droplet si connette a un software portatile di analisi dei dati del computer in esecuzione. Ogni singola goccia viene definita sulla base dell&#39;ampiezza fluorescente come positivo o negativo. Il software fornito dal produttore permette anche un taglio definito dall&#39;utente da immettere per definire la soglia tra le goccioline positivi e negativi. Il numero di goccioline positivi e ...

Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

L&#39;obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l&#39;estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l&#39;utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Views.  Seoul National University.  L'obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l'estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l'utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE. 

Video: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Ricerca

Biologia

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...