Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL44485 e HL28607.

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali istituzionale. 1. Fabbricazione preliminare di Micropipette, la limitazione dei movimenti, e bloccanti <ol><li> Estrarre diversi tubi capillari di vetro borosilicato pulite in metà con un estrattore elettronico regolato in modo che, quando viene tirato, la porzione allungata del tubo è di circa 1 cm di lunghezza e le due metà sono piuttosto simmetriche. Assicurarsi che il cono è coerente con le dimensioni in figura 1. Utilizzare le due metà per micropipette, la limitazione dei movimenti e bloccanti. <ol><li> Bevel le micropipette con un&#39;aria azionato mola 30 con 0,5 micron carta abrasiva bagnata con acqua. Impostare l&#39;angolo del supporto micropipetta in modo che sia di circa 30 gradi rispetto all&#39;orizzontale. </li><li> Lavare accuratamente e asciugare le micropipette utilizzando aspirazione a tirare acetone pulita attraverso la punta e il pozzo. Ispezionare le micropipette (Figura 1A) con un piccolo microscopio verticale con 4 × 40 × e gli obiettivi dotati di un supporto micropipetta coccodrillo e un reticolo oculare. </li><li> Selezionare le micropipette con apertura punta di circa 50 micron di lunghezza con uno smusso il cui rapporto lunghezza / larghezza è compresa tra 3.1 e 3.5 e con un punto di profonda rastrematura che aiuta a penetrare le fibre di collagene dure nel mesentere. </li><li> Conservare 15-20 micropipette di leggermente diverse dimensioni in una scatola senza polvere. </li></ol></li><li> Fai la limitazione dei movimenti che utilizzano tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare di vetro tirato brevemente vicino a un microfiamma per formare una punta smussata (Figura 1B). Conservare diversi in una scatola senza polvere. </li><li> Fai microoccluders utilizzando tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare tirato sotto un microfiamma e delicatamente piegare (tramite un adattatore tubi, ad es., 23G) la punta fine (circa 4 mm dalla punta) a formare un angolo di quasi 120 gradi all&#39;albero ( <strong&gt; Figura 1C). Marca e memorizzare diversi. </li></ol> Preparazione degli animali 2. e Chirurgia <ol><li> Anestetizzare maschile (350-450 g) o ratti femmina Sprague-Dawley (200-300 g) con sodio pentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) per via sottocutanea; proteggere il mesentere non usando iniezione intraperitoneale. </li><li> Nel corso procedure chirurgiche e protocolli sperimentali, mantenere l&#39;anestesia con iniezioni supplementari (30 mg / kg) in base alle esigenze. Determinare profondità dell&#39;anestesia per pizzico piedi o riflesso corneale. Dopo il completamento della procedura sperimentale, eutanasia ratto con pentobarbital sovradosaggio o iniezione intra-cardiaca di cloruro di potassio saturo sotto anestesia. </li></ol> 3. Preparare Soluzioni e eritrociti da utilizzare come flusso Marcatori <ol><li> Preparare la soluzione dei mammiferi di Ringer per superfusate e soluzione di controllo perfusato (mammiferi soluzione di Ringer contenente 10 mg / ml di acido grasso in generegratis albumina sierica bovina, BSA). <ol><li> Filtro perfusato attraverso 0,2 micron filtri siringa per rimuovere le particelle molto piccole che potrebbero bloccare la punta micropipetta; filtrare nel piccolo contenitore pulito. </li></ol></li><li> Preparare eritrociti disegnando circa 0,2 ml di sangue dalla vena della coda del topo anestetizzato in un ago 20G in una piccola siringa contenente 0,05 ml di eparina (1.000 U / ml) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente circa 14 ml di mammifero soluzione Ringer . <ol><li> Centrifuga per imballare delicatamente le cellule rosse (circa max 200 × g per 7 minuti). Aspirare il surnatante e risospendere i globuli rossi in soluzione di Ringer. </li><li> Dopo centrifugazione e la rimozione del supernatante tre volte lasciano i globuli rossi concentrati nella parte inferiore del tubo per un uso successivo. Si noti che questa procedura riduce piastrine nei perfusates finali a meno dello 0,1% dei livelli normali 31. </li></ol></li></ol> 4. Disporre il tessuto sul AnimalVassoio <ol><li> Radere l&#39;addome del topo anestetizzato da sotto l&#39;ombelico al processo xifoideo. Assicurarsi che l&#39;area rasata estende intorno al lato destro (per ratto posto sul lato destro) in modo che i capelli non forma uno stoppino per disegnare il superfusate fuori del tessuto ben. Rimuovere i peli tagliati con una garza bagnata o tessuto. <ol><li> Tenere la pelle con un ottuso pinza dentata e fare un&#39;incisione linea centrale (lunga 2-3 cm) attraverso la pelle utilizzando un paio di forbici robuste. Utilizzando una multa (iris) forbici fanno un&#39;incisione simile attraverso la linea alba, sollevando la parete addominale con una pinza dentata per evitare di danneggiare l&#39;intestino. </li><li> Con l&#39;animale su un fianco sul vassoio animale, estrarre delicatamente l&#39;intestino dalla cavità addominale utilizzando applicatori con punta in cotone (bastone di legno) imbevute di soluzione di Ringer e pinze dentellate smussato. Disporre l&#39;intestino nel tessuto bene in modo che il mesentere è drappeggiato su colonna per la visualizzazione al microscopio facendo attenzione a non toccare il mesentere (potentially danneggiando microvasi) sia con pinze o cotone. Nota: Il vassoio animale (Figura 2A) può essere costruito da plexiglas e richiede un tessuto ben (circa 3 mm di profondità), una colonna otticamente trasparente (ad esempio, quarzo lucidato circa 2 cm di diametro e 5 mm di altezza.), E un tampone riscaldamento regolato per mantenere la temperatura dell&#39;animale. Lo spessore del pilastro non deve superare la distanza di lavoro dell&#39;obiettivo. </li></ol></li><li> Posizionare il vassoio animale sul palco microscopio in modo che il mesentere è visibile attraverso gli oculari. </li><li> Posizionare una linea di gocciolamento per gravità a superfuse continuamente mesentere con la soluzione dei mammiferi di Ringer mantenuta a 35-37 ° C. Utilizzare garze per tenere l&#39;intestino in luogo, contribuire a mantenere l&#39;umidità e favorire la soluzione in eccesso di Ringer fuori dalla superficie. Regolare il flusso e aspirare l&#39;effluente di mantenere uno spessore superfusate coerente. </li><li> Identificare bersaglio microvasi venulari, che sonosegmenti non ramificate a valle del flusso convergente, uno o due rami distali ai veri capillari. Trovare un vaso non ramificato (idealmente, da 600 a 1.000 micron di lunghezza) che hanno attivo il flusso di sangue e privo di globuli bianchi che spuntano sulle pareti del serbatoio. </li><li> Posizionare microrecipiente prova nel centro del campo ottico e spostare il dispositivo di immobilizzazione nella posizione vicino al sito cannulazione prescelto. </li></ol> 5. Riempire Micropipetta e il Monte di Holder <ol><li> Poco prima cannulating, sospendere i globuli rossi del perfusato. Aggiungere 7 ml di globuli rossi concentrati a 0,5 ml perfusato in una provetta pulita borosilicato. Nota: ematocrito del 1-3% può essere utilizzato, ma ematocrito coerente porterà a concentrazioni perfusato coerenti di eventuali sostanze rilasciate dai globuli rossi. </li><li> Montare una siringa da 1 ml con un adattatore tubi 23G e PE 50 tubi (5-15 cm di lunghezza). Disegna la / miscela di cellule rosso perfusato nella siringa. Capovolgere la siringa per mescolare ed espellere tutte le bolle dal tubo eadattatore. Per una maggiore efficienza, la tubazione adatta a diverse siringhe prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento e tenerli in una scatola senza polvere o sacchetto di plastica. </li><li> Riempire il micropipetta avanzando il tubo nel grande fine della micropipetta fino a che non confina con la regione rastremata. Applicare una spinta rapida delicato sulla stantuffo della siringa per riempire la punta micropipetta. Nota: Un piccolo ruscello o di goccioline devono essere visibili sulla punta di evidenziare riempimento completo. </li><li> Ritirare il tubo mentre spingendo delicatamente lo stantuffo per riempire la parte più larga dell&#39;albero micropipetta. Rimuovere piccole bolle nel vasto pozzo muovendo con cautela l&#39;albero micropipetta. Nota: Una procedura simile è stata illustrata 32. </li><li> Posizionare la micropipetta in un supporto pipetta con una porta laterale che consente un collegamento di fluido continuo ad un manometro ad acqua. Assicurarsi che il titolare, che è attaccato ad un azionamento idraulico utilizzato per controllare l&#39;avanzamento molto fine della micropipetta, è con una leggera angolazione (15-25 °)all&#39;orizzontale in modo che il bordo del cono micropipetta non colpisce l&#39;intestino o il vassoio. </li><li> Montare l&#39;azionamento idraulico su un micromanipolatore mobile, che ha x, y, z e unità per consentire stretto allineamento al recipiente di prova (figura 2). </li><li> Regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta con una siringa o bulbo di gomma pieno d&#39;acqua per modificare l&#39;altezza del liquido nella colonna d&#39;acqua del manometro a circa 40 cm H 2 O sopra mesentere. </li><li> Incannulare microrecipiente appena possibile dopo il riempimento della pipetta; globuli rossi si depositano sul fondo della pipetta, in modo che dopo circa 40 min pochissimi globuli rossi fluirà nel recipiente. </li></ol> 6. Microcannulation e microvascolari pressione misura <ol><li> Prima di posizionare la micropipetta pieno sotto il microscopio, premere delicatamente il restrainer sul tessuto pressi microrecipiente applicare una forza sufficiente per afferrare il tessuto. Disegnare larestrainer indietro, leggermente l&#39;allungamento dei tessuti in linea con microrecipiente modo che le sollecitazioni nelle fibre di collagene mesenterici sono allineate con il vaso. <ol><li> Allineare la micropipetta con la nave e abbassarlo in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di incannulamento scelto e abbassarlo sul tessuto in modo che ostruisce parzialmente il flusso all&#39;interno del recipiente, ma non occlude esso. </li></ol></li><li> Incannulare la nave guidando la punta della pipetta lentamente nel lume del vaso con l&#39;azionamento idraulico. Fare attenzione a non spingere attraverso il lato inferiore del recipiente. Nota: Poiché la micropipetta entra nel lumen, il perfusato lava rapidamente il sangue nel vaso di lume e perfusato liberamente sfocia circolazione distale degli animali alla microrecipiente prova, spostando parte del normale perfusione sanguigna nei vasi a valle. </li><li> Abbassare la pressione di perfusione regolando manometro finché il sangue (come indicatoda globuli rossi dell&#39;animale) viene tirato indietro nel segmento perfusione; questo determina la pressione equilibrio in cui i globuli rossi oscillano dolcemente nel lume del vaso e misura la pressione idrostatica microvasi (P c) all&#39;estremità distale del segmento microvasi. Mantenere nave perfusione a tutte le pressioni di cui sopra questa pressione equilibrio. </li></ol> 7. Microocclusion e raccolta dei dati <ol><li> Passaggio facoltativo: Prima di utilizzare il micro-occlusore per bloccare la nave, premere in tessuto, in una zona non utilizzata di mesentere lontano da ogni nave in modo che la punta si accumula un bel blocco di tessuto che protegge la nave sperimentale durante micro ripetuto occlusioni. </li><li> Posizionare il blocco di sopra del recipiente perfuso vicino al bordo inferiore del campo del microscopio. </li><li> Registrare il seguente con il video e l&#39;audio. <ol><li> Verbalmente registrare la posizione del sito di blocco e il bordo schermo inferiore come visto sul reticolo oculare. </li><li> Con la puntadel bloccante posta proprio sopra il microvasi, utilizzare il controllo z multa di micromanipolatore per abbassare delicatamente il blocco fino a quando il flusso nel serbatoio è occluso. Nota la pressione manometro (P c) audio. Applicare l&#39;occlusione di solito per 3-10 secondi, quindi rilasciare, ripristinando la perfusione gratuito. Spostare il sito blocco la nave verso la punta della pipetta in 5-10 micron passi in base al tempo (&gt; 5 min dopo il blocco iniziale in un sito), il numero di occlusioni (3-5), per evitare di danneggiare parete del vaso presso il sito del blocco . </li></ol></li></ol> 8. Analisi dei dati e valutazione di L p (acqua permeabilità) <ol><li> Durante la riproduzione video, determinare la distanza iniziale (ℓ 0) da una cella rossa marcatore per il sito dell&#39;occlusione dall&#39;uso di un&#39;immagine di un micrometro e le posizioni note sulle immagini. Determinare la velocità iniziale (dℓ / dt) della cella marcatore dalla sua posizione in diversi frame durante la 3-10 sec di immagini registrate. Dissuadereminiera il raggio del serbatoio (r) dalle immagini scattate durante l&#39;occlusione (Figura 3). </li><li> Calcola J v / S per ogni occlusione (dℓ / dt) × (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcolare L p ad una pressione costante (J v / S) diviso per la pressione di pilotaggio (pressione microvasi - efficace pressione osmotica colloide; vedi Discussione). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dettagli dei calcoli p L. Anche se il movimento fluido transvascular si verifica mentre la nave è liberamente perfuso, tale scambio è troppo piccolo per essere misurato durante la perfusione libero perché è in genere inferiore allo 0,01% del tasso di perfusione nave. Tuttavia, in condizioni di perfusione viene transitoriamente fermato occludendo microrecipiente, flusso transvascular (cioè, filtrazione) è misurata dal movimento dei globuli rossi marcatori nel lume della colonna di fluid...

Microperfusione nella vascolatura comporta istituisce controllato flusso di perfusato artificiale di composizione nota mediante una micropipetta in un vaso sanguigno di solito meno di 40 micron di diametro. Il vaso perfuso rimane nel suo ambiente tessuto normale e viene perfuso con dell&#39;animale sangue fino al momento della cannulazione. Quando utilizzato in combinazione con una serie di video di immagini o di tecniche fluorimetrica, in situ microperfusione consente la misurazione dei flussi idrici e dei soluti attraverso le pareti dei microvasi in condizioni quali siano note le forze trainanti di questi flussi e le proprietà di permeabilità della parete vascolare può essere direttamente valutati. Inoltre, controllando la composizione del fluido circostante microrecipiente nel tessuto (perfusato e superfusate), la regolazione della permeabilità microvascolare e di scambio può essere indagata attivando le cellule endoteliali formano la parete microrecipiente essere esposti a una varietà di econdizioni Xperimental (agonisti, le condizioni di perfusione modificate, indicatori fluorescenti per misurare la composizione intracellulare e di segnalazione) per periodi misurati con precisione di tempo (sec a hr). Inoltre, le valutazioni ultrastrutturali o citochimici di chiave strutture molecolari cellulari che regolano la barriera possono essere studiate nelle stesse microrecipienti in cui la permeabilità viene misurata direttamente. L&#39;approccio costituisce così un ponte tra studio dei meccanismi cellulari e molecolari di modificare la funzione di barriera endoteliale in coltura monostrato di cellule endoteliali e indagine microvasi intatti. Vedere le seguenti recensioni per un&#39;ulteriore valutazione 1-6. Una limitazione di microperfusione è che può essere utilizzato solo in letti microvascolari che sono sottili, trasparenti e con integrità strutturale sufficiente a consentire incannulazione con una micropipetta di vetro. Mentre i primi accertamenti utilizzati microvasi rana in mesenterio e sottile cutanea pectoris muscle 7,8, di gran lunga la preparazione più comunemente usato nei modelli di mammiferi è il topo mesentere 9-15. La maggior parte delle indagini si sono concentrate sui cambiamenti acuti in permeabilità vascolare studiato per periodi di 1-4 ore, ma le indagini più recenti sono state estese a misurazioni su singoli pescherecci 24-72 ore dopo un iniziale perfusione 12,16. La tecnologia CRISPR recentemente sviluppato, che promette di rendere più modelli di ratto geneticamente modificati per lo studio vascolare regolazione della permeabilità 17 dovrebbe consentire i metodi descritti nella presente comunicazione da applicare in microvasi venulari del mesentere di questi nuovi importanti modelli di ratto. Il metodo richiede un microscopio rovesciato dotato di un palco microscopio su misura sufficientemente grande per contenere sia la preparazione degli animali e almeno tre micromanipolatori utilizzato per posizionare microtools vicino alla nave perfuso e per allineare una micropipetta perfusione con la navelumen. Ad esempio una piattaforma personalizzata per un palco microscopio xy (circa 90 × 60 cm) può essere fabbricata da una piastra di acciaio dello spessore di 1 cm con un rivestimento antiruggine. Lo stadio è collegato a una tabella indice ingegneria o due slitte a coda di rondine montate ad angolo retto e supportati su pilastri teflon o trasferimenti a sfere per il movimento nel piano orizzontale. Un impianto tipico (vedi figura 2) ha molto in comune con il microscopio e microposizionamento attrezzature utilizzate per una serie di esperimenti microcircolazione intravitale come quelli per misurare il flusso unico dei vasi sanguigni e dell&#39;ematocrito, il trasporto di ossigeno locale sangue perfusione microvasi, regolazione di vascolare liscio il tono muscolare, e l&#39;accumulo microvascolare locale dei traccianti fluorescenti iniettate nel suo complesso circolazione. 18-26 L&#39;aspetto fondamentale della tecnica è la misura della portata (J v) attraverso una superficie definita (S) della parete microvascolare. Realizzarequesto tramite la tecnica Landis modificato qui descritta una semplice microscopio invertito è adeguata. Una piccola videocamera è montata sulla porta immagine e il segnale video, con una base tempo aggiunto, viene visualizzato su un monitor video e registrate in forma digitale su un computer o un segnale digitale o analogico su un videoregistratore. Una volta microrecipiente si incannula la porzione di microvasi visibile alla telecamera può essere modificato spostando la fase e manipolatori come unità senza interrompere la cannulazione. Misurazione dei flussi transvascular può anche essere combinato con indagini più dettagliate utilizzando un sofisticato microscopio a fluorescenza con filtri appropriati, quali impianti utilizzati per la misurazione di soluto permeabilità, controllo rapporto fluorescente di calcio citoplasmatico o di altri meccanismi cellulari, e confocale 6,12,13, 27. Un vantaggio fondamentale di tutti gli approcci microperfusione è la capacità di fare misure ripetute, sulla nave, Sotto cambiamento controllato di forza motrice, come pressioni idrostatiche e oncotica, o cambiamento indotto nella risposta dei vasi alle condizioni infiammatorie. Il tipo più comune è un confronto accoppiato di conduttività idraulica misurata (L p) sulla nave con il vaso prima perfuso con una micropipetta riempito con un perfusato controllo e sospensione di eritrociti per stabilire uno stato basale permeabilità, quindi con una seconda pipetta con l&#39;agente di test aggiunto perfusato. Molteplici cannulazioni sono possibili con il ciclo ripetuto dopo riperfusione con la pipetta di controllo. Il presente protocollo dimostra la cannulazione e microperfusione di un vaso venulare nel ratto mesentere registrare flussi di acqua attraverso la parete microvessel e misurare la L p della parete del vaso, un indice utile della permeabilità del percorso comune per l&#39;acqua e soluti attraverso intatto barriera endoteliale. La procedura si chiama techniq Landis modificatoue perché il principio originale Landis di utilizzare il movimento relativo dei globuli rossi come misura di scambio fluido transvascular dopo perfusione è bloccato è conservato 28, ma la gamma di condizioni sperimentali (ad esempio, le differenze di pressione oncotica idrostatica e albumina attraverso la parete microrecipiente) disponibile dopo microperfusione è di gran lunga maggiore rispetto al sangue perfuso uncannulated microvasi 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>narrow diameter, long working distance objective: example</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&amp;times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td><td>welding shop</td><td></td><td>this should be heavy to reduce vibration</td></tr><tr><td>Unislide x-y table: dove tail slides</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD video camera: example</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (no longer available)</td><td>no color needed</td></tr><tr><td>video capture system with audio--generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small microphone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (no longer available)</td><td></td><td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td></tr><tr><td>hydraulic probe drive, one way</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>need to buy either manual drive or electronic drive</td></tr><tr><td>manual drum drive&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>or hydraulic drive, 3 way</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td><td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td></tr><tr><td>connectors/rods/holders</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>pin vise</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>to hold restrainer</td></tr><tr><td>pipette holder</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>water manometer ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPE TRAY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>custom</td><td>&amp;nbsp;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td></tr><tr><td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>medical adhesive for tissue well</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&quot; L x 2&quot; W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td></tr><tr><td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vertical pipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 with nichrome filament</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td><td></td><td></td><td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Machine</td><td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; with ceramic sharpening disc</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>use &quot;as is&quot; or attach lapping film</td></tr><tr><td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td><td>3M</td><td>part no. 051144 80827</td><td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Gli esperimenti per misurare le proprietà di permeabilità dei microvasi irrorati individualmente forniscono un ponte tra studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano la permeabilità vascolare in coltura monostrato di cellule endoteliali e le proprietà di scambio funzionali di interi letti microvascolari. Un metodo per cannulare e perfusione microvasi venulari di ratto mesentere e misurare la conduttività idraulica della parete dei microvasi è descritta. Le principali attrezzature necessarie include un microscopio intravitale con un grande palco modificato che supporta micromanipolatori di posizionare tre differenti microtools: (1) una micropipetta di vetro smussato a cannulare e perfusione microrecipiente; (2) un vetro micro-occlusore per bloccare transitoriamente perfusione e consentire la misurazione di transvascular movimento flusso d&#39;acqua ad una pressione idrostatica misurata, e (3) una bacchetta di vetro smussato per stabilizzare il tessuto mesenterico nel sito di incannulamento. Il Landis micro-occlusione techniq modificatoue utilizza globuli rossi sospese nel perfusato artificiale come marcatori di fluido movimento transvascular, e consente inoltre misurazioni ripetute di questi flussi condizioni sperimentali sono cambiati e differenza idrostatica e colloide pressione osmotica attraverso i microvasi sono attentamente controllati. Le misurazioni della conducibilità idraulica prima con un perfusato controllo, quindi dopo la ri-incannulamento della stessa microvasi con i perfusates prova consentono confronti della risposta dei microvasi in queste condizioni ben controllate associati. I tentativi di estendere il metodo per microvasi nel mesentere di topi con modificazioni genetiche che si prevede di modificare la permeabilità vascolare erano fortemente limitata a causa dell&#39;assenza di lunghi microvasi dritti e ramificati nel mesentere del mouse, ma la recente disponibilità dei ratti con modificazioni genetiche simili utilizzando la tecnologia / Cas9 CRISPR è prevista l&#39;apertura di nuove aree di indagine in cui possono essere applicati i metodi qui descritti. </p&gt;

La Figura 4 mostra i risultati di misurazione del decorso temporale delle variazioni di L p in un ratto venulare microvasi cannulato successivamente con quattro perfusates. 33 L&#39;entità di L p calcolata a pressione costante è stato usato come una misura delle variazioni di microvasi permeabilità della parete, prima nello stato di controllo con un perfusato contenente 1% di albumina sierica bovina poi, quando la nave è stata esposta per la bradichinina agente infia...

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Ricerca

Medicina

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Biologia dello sviluppo

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mesentere angiogenesi Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biologia

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Meccanismi di secrezione dell'ormone intestinale utilizzando l'isolato irrorati intestino tenue del ratto

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, such as gastric dilatation volvulus (GDV), mesenteric torsion, and colic, are observed in animals such as dogs and horses. An initial interruption of blood flow causes tissues to become ischemic. Although necessary to salvage viable tissue, subsequent reperfusion can induce further injury. The main mechanism responsible for IRI is free radical formation upon reperfusion and reintroduction of oxygen into damaged tissue, but there are many other components involved. The resulting local and systemic effects often impart a poor prognosis. 
Intestinal IRI has been the subject of extensive research over the past 50 years. An in vivo rodent model in which the base of the superior mesenteric artery (SMA) is temporarily ligated is currently the most common method used to study intestinal IRI. Here, we describe a model of intestinal IRI utilizing isoflurane anesthesia in 21% O2 medical air that yields reproducible injury, as demonstrated by consistent histopathology of the small intestines. Tissue injury was also assessed in the colon, liver, and kidneys.

We describe how to generate a widely used surgical model of intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rodents. The procedure involves occlusion of the superior mesenteric artery followed by the restoration of blood flow. This model is useful for studies investigating occlusive causes of intestinal IRI in both veterinary and human medicine.

Modello di roditore di danno da ischemia-riperfusione intestinale attraverso l'occlusione dell'arteria mesenterica superiore

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modello di ratto per studi di malperfusione d'organo viscerale

Controlled Reversible Visceral Arterial Ischemia, Venous Congestion and Combined Malperfusion via Midline Laparotomy in Rats

Besides sepsis and malignancy, malperfusion is the third leading cause of tissue degradation and a major pathomechanism for various medical and surgical conditions. Despite significant developments such as bypass surgery, endovascular procedures, extracorporeal membrane oxygenation, and artificial blood substitutes, tissue malperfusion, especially of visceral organs, remains a pressing issue in patient care. The demand for further research on biomedical processes and possible interventions is high. Valid biological models are of utmost importance in enabling this kind of research. Due to the multifactorial aspects of tissue perfusion research, which include not only cell biology but also vascular microanatomy and rheology, an appropriate model requires a degree of biological complexity that only an animal model can provide, rendering rodents the obvious model of choice. Tissue malperfusion can be differentiated into three distinct conditions: (1) isolated arterial ischemia, (2) isolated venous congestion, and (3) combined malperfusion. This article presents a detailed step-by-step protocol for the controlled and reversible induction of these three types of visceral malperfusion via midline laparotomy and clamping of the abdominal aorta and caval vein in rats, underscoring the significance of precise surgical methodology to guarantee uniform and dependable results. Prime examples of possible applications of this model include the development and validation of innovative intraoperative imaging modalities, such as Hyperspectral Imaging (HSI), to objectively visualize and differentiate malperfusion of gastrointestinal, gynecological, and urological organs.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento della caratterizzazione spettrale dei tessuti fisiologici e malperfusi

This article introduces a standardized procedure for controlled, reversible malperfusion of visceral organs in rat models. The aim is to induce these malperfusion states with a high degree of methodological certainty and control while maintaining technical simplicity and error resilience.

Ischemia arteriosa viscerale reversibile controllata, congestione venosa e malperfusione combinata tramite laparotomia della linea mediana nei ratti

Besides sepsis and malignancy, malperfusion is the third leading cause of tissue degradation and a major pathomechanism for various medical and surgical ...