Il sostegno finanziario per la maggior parte degli studi è stato fornito dalla svedese Medical Research Council (Grant 5942).

1. Animali <ol><li> Piccoli roditori, come i ratti, topi e porcellini d&#39;India, sono stati utilizzati come modelli animali. Purtroppo, topi adulti (molti ceppi di topi sono stati valutati) tendono a mancare o che hanno solo un numero molto basso di potenziale genitore microvasi (da cui possono provenire angiogenesi) all&#39;interno delle loro finestre mesenterica, che rende gli studi con i topi inaffidabili. Pertanto, il test è stato sviluppato principalmente per i ratti. </li><li> I topi, che sono acclimatate ad un ambiente standard per almeno 7 giorni dopo la consegna dal selezionatore, di solito sono alloggiati a coppie in una gabbia standard in un 12-ore ciclo luce / buio con libero accesso all&#39;acqua e pellet. Ogni animale è segnato. Noi usiamo per lo più giovani ratti adulti (di solito 7-10 settimane di età di ceppi diversi, ma di solito maschi Sprague-Dawley, nei ratti più giovani di 5-6 settimane di età il numero dei microvasi nativi tendono ad essere bassi) ottenuti da allevatori diversi. Nel periodo precedente l&#39;esperimento e per tutta l&#39;esperimento, gli animali sono pesati ogni due giorni, e sempre il giorno del sacrificio. Quando gli animali sono trattati contemporaneamente ip (per l&#39;induzione di angiogenesi, vedi sotto) e SC o EV o PO, si sono pesati ogni giorno. Ciò consente la creazione di gruppi sperimentali e di controllo del peso corpo uguale all&#39;inizio dell&#39;esperimento, e permette di controllare l&#39;influenza del trattamento sul corpo-peso-guadagno durante il corso dell&#39;esperimento. Dal ratti maschi adulti crescere fortemente fisiologicamente (guadagnando circa 40-60 g per settimana a seconda del tipo di ceppo), il peso-guadagno ritardo è un marker surrogato della tossicità, sistemica benessere, anoressia, e difetto di crescita. </li></ol> Lavoriamo in una struttura di alto livello animale cura e notevoli sforzi sono fatti per ridurre al minimo i livelli di stress sperimentato dagli animali. Le attuali linee guida etiche sono quelli stabiliti dalla Workman P. et al. (Linee guida per il benessere e l&#39;uso di animali nella ricerca sul cancro. Fr. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). Il Comitato Animal Ethics dell&#39;Università di Göteborg ha approvato questi studi. 2. Pro-angiogenici trattamento intraperitoneale <ol><li> Il fattore pro-angiogenico candidato da testare è sciolto e diluito nel endotossina senza soluzione salina utilizzata per l&#39;infusione di pazienti (anche a livelli estremamente bassi, endotossine è pro-angiogenici). Tutte le soluzioni sono composte da appena il giorno di iniezione, sterile, filtrata (Millipore 0,22-micron di filtrazione), controllata per il pH neutro (7,1-7,3), e utilizzate a temperatura ambiente. L&#39;agente di test viene iniettato a concentrazioni basse o molto basse. Per esempio, ratto rVEGF 164 (564-RV/CF, R &amp; D Systems Europe, Ltd., Oxon, UK), che è la predominante isoforma VEGF-A nei ratti, è diluito a 96 pmole / ml in endotossine senza soluzione salina, congelati e scongelati e un volume di 5 ml viene iniettata ip nel ratto. Noi usiamo una siringa da 5 ml con 0,8 mm ago (ago verde, 21G) per l&#39;iniezione ip. Questo trattamento, due volte al giorno per 4,5 giorni, cioè., Dal Lunedi mattina (giorno 0) a Venerdì mattina (giorno 4), induce una risposta robusta angiogenesi spuntano nel tessuto prova mesenterica un picco intorno al giorno 21. Amministrazione del ip soluzione garantisce che l&#39;intero volume viene consegnato nella cavità peritoneale (e non in, vescica, intestino o qualsiasi altro organo). L&#39;iniezione rapida di 5 ml permette conferma tattile da parte dell&#39;operatore che il getto del liquido sia passato attraverso la parete addominale nella cavità addominale. In seguito, prima o in concomitanza con l&#39;ip pro-angiogenici trattamento, ogni agente di test di scelta può essere somministrata per via sistemica. </li></ol> 3. Administation sistemica di angiogenesi-modulante agenti <ol><li> Ogni itinerario diverso da ip route può essere utilizzato, in quanto il trattamento ip possono influenzare la reazione in corso angiogenico attraverso l&#39;induzione di infiammazione o, eventualmente, attivando mastociti nel tessuto di prova, che può portare a una forte pro-angiogenici risposta. Oltre a somministrazione orale o una singola iniezione sottocutanea o endovenosa, si usano spesso somministrazione sottocutanea utilizzando minipompe osmotica (uno o più, con vari volumi e di pompaggio volte) per offrire la soluzione ad una velocità costante per un massimo di due o più settimane. </li><li> Infusione continua sottocutanea di agenti di test Riempimento e l&#39;impianto di minipompe osmotica Di solito il giorno 5, vale a dire, un giorno dopo la fine del trattamento VEGF ip, minipompe osmotici (ad esempio, Modello 2ML2, con costante di velocità di pompaggio su 5,0 microlitri / h per 14-15 giorni; Alzet Pompe osmotica, Mountain View, CA , USA) sono riempiti in condizioni di sterilità con l&#39;agente di prova o il veicolo appropriato. Dopo stoccaggio in sterile 0,9% (w / v) di NaCl durante la notte a 37 ° C, la pompa (s) sono chirurgicamente impiantati sc sulle spalle (a lato della colonna vertebrale column nella regione delle scapole) di ratti che sono stati anestetizzati con isoflurano gas (veterinario Isoba, Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), inizialmente in una camera stagna trasparente e successivamente attraverso una maschera (per minimizzare lo stress causato alle animale a seguito, la camera viene lavata con l&#39;aria prima di essere riutilizzato). L&#39;incisione cutanea fatto per l&#39;impianto della pompa viene suturata immediatamente post-impianto con filo di seta. Dal momento che gli animali di peso fisiologicamente durante il periodo di sperimentazione e gli agenti di test vengono somministrati ad un tasso costante, il dosaggio attuale selezionati per un farmaco di prova per kg di peso corporeo è superiore alla dose media all&#39;inizio del periodo di infusione ed è più bassa rispetto alla dose media alla fine del periodo di infusione. Infusione continua, come descritto qui, può essere visto come una forma estesa di trattamento metronomico. </li></ol> 4. Terminare la Experiment <ol><li> Un animale alla volta è posto in una camera trasparente a tenuta d&#39;aria, che viene lavata con gas CO 2, che uccide rapidamente gli animali. La camera viene lavata con l&#39;aria, prima di essere riutilizzati. </li></ol> 5. La raccolta di campioni di tessuto <ol><li> Come mostrato nel DVD, la parete addominale è aperta e il piccolo intestino mesentere è identificato, compresa la parte più distale che raggiunge la valvola ileo-cecale (la giunzione del piccolo intestino e l&#39;intestino crasso). Quattro (o più) dei più distalmente trova &quot;finestre&quot; sono numerati e diffondere sul oggettivi standard di Superfrost non trattati Plus-slide (DAKO Danimarca A / S, Glostrup, Danimarca). E &#39;importante evitare, se possibile, contaminando i campioni di sangue, contenuto intestinale o altri fluidi corporei, in quanto questi materiali possono essere colorati in modo non specifico, anche se questo non invalida la successiva visualizzazione immunoistochimica dei microvasi. </li><li> Ogni esemplare finestra mesenterica con annesso segmento dell&#39;intestino piccolo si sviluppa su un vetrino ed essiccata a temperatura ambiente per 20 minuti. Poi, il moncone intestinale è tagliato fuori, mentre i campioni intatti mesentere membranose sono conservati a -20 ° C per lunghi periodi. Questo è mostrato nel DVD. </li></ol> Va ricordato che la vascolarizzazione dei tessuti e brevetti possono essere visualizzati prima del raccolto con trasmessa microscopia ottica intravitale. 6. Protocollo per la colorazione immunoistochimica dei microvasi <ol><li> Giorno 0 I campioni sono autorizzati a disgelo da -20 ° C a temperatura ambiente, essiccate in un armadio a 60 ° C per 1 ora, e tenuto a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Giorno 1 Porre i vetrini nella colorazione titolari di scorrimento (in ogni seconda traccia) in una vaschetta di colorazione e lavare due volte con TBS (pH 7.8) per 10 minuti a temperatura ambiente. La soluzione viene scartata e sostituita con la soluzione successiva, e così via per tutte le seguenti operazioni. </li><li> Tripsina trattamento Riempire la vaschetta di colorazione che porto il supporto diapositive colorazione con soluzione di tripsina (25 ° C per 20 minuti). Scartare la soluzione e incubare per due volte con soluzione di saccarosio al 2,5% (temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta). Scartare la soluzione e lavare un paio di volte in acqua distillata (temperatura ambiente per alcuni minuti ciascuno). </li><li> Blocco Riempire la vaschetta di colorazione che porto il supporto diapositive colorazione con lo 0,5% H 2 O 2 in metanolo (temperatura ambiente per 30 minuti). Scartare la soluzione e risciacquare con acqua distillata (temperatura ambiente per qualche minuto). Gettare la soluzione e lavare due volte con TBS (pH 7.4) (temperatura ambiente per 8 minuti ogni volta). </li><li> Incubazione Ogni incubazione in una camera umidificata a temperatura ambiente. Circa 150 ml di ciascuna delle soluzioni elencate di seguito sono utilizzati per vetrino. I vetrini sono posti in una camera umidificata e le soluzioni vengono aggiunti sul esemplari (il non-membranosa parti non hanno bisogno di essere coperte dalle soluzioni). Per ciascuna delle seguenti fasi, con attenzione scrollarsi di dosso tutta la soluzione prima che la soluzione successiva viene aggiunta. <ol><li> Incubazione con normale (blocco) nel siero (cavallo) (ABC kit) 3 gocce di soluzione di colore giallo / 10 ml di tampone di diluizione per 20 minuti. </li><li> L&#39;incubazione con l&#39;anticorpo primario ARU0181, che le etichette topo le cellule endoteliali vascolari. L&#39;anticorpo è diluito 1:600 ​​con il tampone di diluizione (Biosource) (100 microlitri diluito 40 volte [congelati] più 900 microlitri di tampone di diluizione) e l&#39;incubazione si svolge la notte a 4 ° C. </li></ol></li><li> 2 ° giorno Le diapositive vengono rimossi dalla camera umidificata, l&#39;anticorpo primario viene scartato, e le diapositive sono posti in un supporto per diapositive colorazione, che è immersa nella vaschetta di colorazione e risciacquati due volte con TBS(PH 7,8) per 8 minuti. <ol><li> Incubazione con anticorpo biotinilato (ABC kit) I vetrini sono posti orizzontalmente in una camera umidificata e incubate con 1 goccia di soluzione di blu / 10 ml di tampone di diluizione per 30 minuti. Scartare la soluzione e posto le diapositive in un portavetrini colorazione sommerso nel vaso colorazione e lavare due volte con TBS (pH 7,4) per 8 minuti. </li><li> Incubazione con il reagente ABC I vetrini sono ancora posti orizzontalmente in una camera umidificata e le soluzioni che seguono sono pipettati sulle parti membranosa dei campioni: 2 gocce di soluzione di arancio e 2 gocce di soluzione di colore marrone / 10 ml di TBS (pH 7,4) per 30 minuti. Mescolare con cura 30 minuti prima dell&#39;uso! Scartare la soluzione e posto le diapositive nel supporto diapositive nella vaschetta di colorazione e lavare due volte con TBS (pH 7,4) per 8 minuti. </li></ol></li><li> Colorazione con DAB (0,05%) Questa operazione deve essere eseguita in una cappa chimica ventilato! Porre i vetrini e aggiungere il 3,3-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich) soluzione con una pipetta: soluzione DAB 0,1% in TBS (pH 7,4) [congelati] è diluito 1:1 con una miscela di 10 microlitri H 2 O 2 e 7,5 ml TBS (pH 7,4). Questa soluzione è sterile filtrata prima dell&#39;uso (per eliminare eventuali particelle che possono oscurare l&#39;immagine microscopica). Macchiare i campioni per 8 minuti. Scartare la soluzione e posto le diapositive nel supporto diapositive colorazione immerso nella vaschetta di colorazione. Sciacquare con acqua di rubinetto e poi in acqua distillata per pochi minuti. </li><li> Disidratazione I vetrini sono conservati nel supporto diapositive colorazione. Risciacquare scartando e riempire la vaschetta di colorazione contenente acqua distillata / etanolo: acqua distillata, alcool al 70%, 95% di alcol, alcool assoluto, con 2 minuti in ogni soluzione. </li></ol> 7. Imaging e valutazione della rete microvascolare in ogni campione finestra mesenterica Dopo la colorazione immunoistochimica di cellule endoteliali vascolari Come mostrato nel film, microvasi sono microscopicamente visualizzati in situ nel tessuto intatto. <ol><li> Per prima cosa, noi usiamo un microscopio disegno con la gamma di ingrandimento 14-34 (M Leica Selvaggio 3Z) a matita su carta bianca tutta l&#39;area finestra, così come tutta l&#39;area vascolarizzata (VA) per finestra mesenterica. VA, in percentuale di tutta l&#39;area, può essere facilmente misurata con planimetria computerizzato o non computerizzato (o semplicemente tagliando fuori e ponderazione l&#39;immagine di tutta la finestra, e le immagini di tutte le sue parti vascolarizzato). </li><li> Usando un altro microscopio disegno, profili microvasi individuali, che sono facilmente identificabili, sono disegnati con inchiostro nero su carta bianca a 80 ingrandimenti all&#39;interno dei campi scelti a caso. Questo è il punto di partenza per la successiva valutazione morfometrica computerizzata della lunghezza microvascolari (MVL), che è sostanzialmente una misura della densità microvascolare. </li><li> Opzionalmente, le variabili relative alla formazione di pattern microvascolare, così come quelli per la valutazione del numero di germogli microvascolare e la lunghezza dei singoli germogli microvascolare (SP n ° e Le. SP, rispettivamente) può essere determinato. -Il contrasto ottimale tra le strutture raffigurato nave nero e lo sfondo bianco facilita l&#39;analisi dettagliata delle immagini, nella maggior parte dei programmi commerciali morfometriche computerizzate. </li><li> Nella maggior parte dei casi, le variabili principali sono VA e MVL, che se moltiplicati insieme generano la lunghezza totale microvascolari (TMVL). </li></ol> 8. Analisi statistica Noi di solito utilizzare lo standard non parametrico di Mann-Whitney U-test per analizzare spaiato (due code) osservazioni. Una media di quattro finestre mesenterica per animale viene utilizzato come indipendente dati-punto per ogni variabile della finestra mesenterica. Il criterio di significatività statistica è P ≤ 0,05.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il dosaggio è stato introdotto nel 1986 3 e ha successivamente stato ulteriormente sviluppato e raffinato nel nostro laboratorio 7,10-12. Come discusso in documenti di revisione (invitato) 1, 2, il saggio mette a confronto anche con altri mammiferi test in vivo l&#39;angiogenesi in particolare riguardo a caratteristiche importanti come il tessuto di prova degli adulti è nativamente vascolarizzato e privo di angiogenesi fisiologica; traumi minimi, se presente, viene inflitta il tessuto; variabili quantitative sono misurate veramente, che consente una valida analisi statistica per quanto riguarda dose-risposta e molecolare-attività degli studi; angiogenesi germinazione si verifica, che è predominante in tessuti normali e tumori, e dati sulla tossicità sono facilmente accumulato nei ratti che crescere fortemente fisiologicamente in età adulta. Caratteristiche svantaggiose possono includere il fatto che il saggio è relativamente molto tempo, soprattutto nel valutare il numero e la lunghezza dei singoli segmenti microvasi e germogli di microvasi, che non permette osservazioni real-time/serial, e che è poco adatto per i topi poiché molte finestre mesenterica nei topi mancanza microvasi potenziale genitore da cui può nascere nuovi capillari. In tempo reale le osservazioni sono, tuttavia, ha permesso al microscopio intravitale dove sono aperte le finestre, ma esteriorizzato intatto mesenterica nell&#39;arco di un microscopio a fase, mentre l&#39;animale è anestetizzato, come discusso in 1. Progressi significativi nella ricerca angiogenesi sono stati raggiunti negli ultimi decenni con modelli come la micropocket corneale, membrana corioallantoidea pulcino, e sc saggi spina Matrigel, che sono strumenti utili ma alla fine limitata. Future applicazioni cliniche di terapie anti-angiogenico e pro-angiogenici richiedono l&#39;istituzione e la convalida dei più sensibili e biologicamente rilevanti, veramente quantitativa modelli pre-clinici, come quello descritto nel report corrente.

Tamponi e reagenti 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) Soluzione Tris (idrossimetil) aminomethan (60,57 g) viene sciolto in ~ 900 ml di acqua distillata e ~ 45 ml di HCl 25% (concentrato) si aggiunge per raggiungere pH 7,8 seguito da diluizione di 1 litro con acqua distillata. Tris-tampone salino (TBS, pH 7,8) A 200 ml della soluzione di riserva è aggiunto 18 g di NaCl sciolto in ~ 1800 ml acqua distillata con regolazione del pH a 7,8 con soluzione di riserva, seguita da diluizione a 2 litri con acqua distillata. TBS (pH 7,4) A 200 ml della soluzione di riserva è aggiunto 18 g di NaCl sciolto in disciolti in ~ 1800 ml di acqua distillata con regolazione del pH a 7,4 con soluzione di riserva, seguita dalla diluizione a 2 litri con acqua distillata. Soluzione di tripsina (0,05% tripsina, 0,1% CaCl 2) Contiene 0,1 g di tripsina e 0,2 g di CaCl 2 in 200 ml di TBS (pH 7,8). Soluzione di saccarosio 2,5% Contiene 5 g di saccarosio in 200 ml di TBS (pH 7,8). Soluzione madre di sodio azide 1% in TBS (pH 7,4) Contiene 1 g di Na-azide in 100 ml di TBS (pH 7,4). Diluendo tampone: 0,1% di BSA, 0,01% Na-azide (Usato per diluire gli anticorpi in ABC Vectastain kit). Contiene 0,1 g di albumina sierica bovina (BSA) e 1 ml di 1% di Na-azide, diluito a 100 ml con TBS (pH 7,4). ABC Kit Vectastain PK 4002, ABC perossidasi IgG di topo Cavallo normale siero; blocco siero; giallo soluzione: 3 drops/10 tampone di diluizione ml. Biotinilato anticorpi, anti-IgG di topo; soluzione di blu: 1 drop/10 tampone di diluizione ml. ABC-reagente: soluzione d&#39;arancia, 2 gocce più soluzione marrone 2 drops/10 ml di TBS (pH 7,4). Mescolare le soluzioni di 20 minuti prima dell&#39;uso! Mouse (monoclonali) anti-ratto endotelio (Biosource International, Camarillo, CA, USA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalogo </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clone # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Questo anticorpo è diretto contro tutte le cellule endoteliali vascolari nel ratto, ad eccezione di quelli nel cervello. Vectastain perossidasi avidina biotina Complex (ABC) Kit Il kit contiene l&#39;anticorpo primario, anticorpo secondario biotinilato, avidina-biotinilato complesso enzimatico (ABC), enzima e substrato. Vedi <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> o <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> per i protocolli. Albumina sierica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich, catalogo # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-diaminobenzidina Isopac (Sigma-Aldrich, catalogo # D 9015). Tripsina da pancreas bovino (Sigma-Aldrich, catalogo # T 4665). Vectastain perossidasi ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, Svezia)

rat mesentery angiogenesis assay

L&#39;adulto mesentere ratto saggio finestra angiogenesi è biologicamente appropriato ed è particolarmente adatta allo studio della germinazione angiogenesi in vivo [vedi documenti di revisione], che è la forma dominante di angiogenesi nei tumori umani e non-tessuti tumorali, come discusso in rassegna invitato carte 1,2. L&#39;angiogenesi indotta nella parte membranosa mesenterica da intraperitoneale (ip) l&#39;iniezione di un fattore pro-angiogenico può essere modulata per via sottocutanea (SC), per via endovenosa (ev) o orale (po) il trattamento con agenti modificatori di scelta. Ogni parte membranosa del mesentere è traslucido e incorniciato da tessuto adiposo, dandogli una finestra-come l&#39;apparenza. Il test ha le seguenti caratteristiche vantaggiose: (i) il tessuto di prova è nativamente vascolarizzato, anche se scarsamente, e poiché è estremamente sottile, la rete dei microvasi è praticamente a due dimensioni, che permette l&#39;intera rete da valutare microscopicamente in situ; ( ii) in ratti adulti il tessuto di prova significativo manca l&#39;angiogenesi fisiologica, che caratterizza la maggior parte dei tessuti adulti normali dei mammiferi, il grado di vascolarizzazione nativa, tuttavia, è correlata con l&#39;età, come discusso in 1, (iii) il livello trascurabile di traumi indotti angiogenesi garantisce elevata sensibilità, (iv) il saggio riproduce la situazione clinica, in quanto l&#39;angiogenesi, modulando la droga test sono somministrati per via sistemica e le risposte osservate riflette l&#39;effetto netto di tutte le metabolici, cellulari, molecolari e le alterazioni indotte dal trattamento, (v) il test permette di valutazioni obiettive, quantitativi, le variabili imparziali di microvascolare estensione spaziale, la densità e la formazione di modello di rete, così come della capillare germinazione, consentendo così robuste analisi statistiche della dose-effetto e molecolare la struttura-attività, e (vi ) il test rivela con alta sensibilità agli effetti tossici o nocivi di trattamenti in termini di tasso di diminuzione fisiologica del peso corporeo, come ratti adulti crescere fortemente. Mast-cellulo-mediata angiogenesi è stato dimostrato da questo test 3,4. Il modello dimostra un elevato livello di discriminazione in materia di dose-effetto e gli effetti misurati di via sistemica chimicamente o funzionalmente farmaci strettamente correlati e proteine, tra cui: (i) a basso dosaggio, metronomically somministrati chemioterapici standard di rendimento diversi, farmaco-specifici effetti (cioè, le attività di angiogenesi-soppressiva, neutro o angiogenesi-stimolante 5), (ii) naturale ferro-insaturi umano lattoferrina, che stimola VEGF-A-angiogenesi mediata 6 e naturale ferro-insaturi lattoferrina bovina, che inibisce VEGF-A- dell&#39;angiogenesi mediata 7; e (iii) a basso peso molecolare frazioni eparina prodotta in vari modi 8,9. Inoltre, l&#39;analisi è molto adatto a studi sugli effetti combinati di angiogenesi di agenti che sono somministrati per via sistemica in modo simultaneo o sequenziale. L&#39;idea di realizzare questo video origine dal compianto Dr. Judah Folkman quando ha visitato il nostro laboratorio e testimoniato la metodologia essere dimostrata. Recensione carte (invitato) discutere e valutare il dosaggio Norrby, K. Nei modelli in vivo di angiogenesi. J. cella. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, Drug test K. con modelli angiogenesi. Expert Opin. Droga. Sco. 3, 533-549 (2008).

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Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l&#39;angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l&#39;avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Rat mesentere angiogenesi Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  University of Gothenburg. Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Video: Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: un modello in vitro per lo studio dell&#39;angiogenesi (Intervista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

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Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

Preparazione T fattore di crescita cellulare da splenociti Rat

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Intracellular Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds with inhibitory/stimulating activity. Molecular chaperones are proteins involved in regulation of protein folding1 and have a crucial role in promoting cell survival upon stress insults like heat shock2, nutrient starvation and exposure to chemicals/poisons3. For this reason chaperones are found to be involved in events like tumor development, chemioresistance of cancer cells4 as well as neurodegeneration5. Design of small molecules able to inhibit or stimulate the activity of these enzymes is therefore one of the most studied strategies for cancer therapy7 and neurodegenerative disorders9. The assay here described offers the possibility to measure the refolding activity of a particular molecular chaperone and to study the effect of compounds on its activity. In this method the gene of the molecular chaperone investigated is transfected together with an expression vector encoding for the firefly luciferase gene. It has been already described that denaturated firefly luciferase can be refolded by molecular chaperones10,11. As normalizing transfection control, a vector encoding for the renilla luciferase gene is transfected. All transfections described in this protocol are performed with X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cells. In the first step, protein synthesis is inhibited by treating the cells with cycloheximide. Thereafter protein unfolding is induced by heat shock at 45&deg;C for 30 minutes. Upon recovery at 37&deg;C, proteins are re-folded into their active conformation and the activity of the firefly luciferase is used as read-out: the more light will be produced, the more protein will have re-gained the original conformation. Non-heat shocked cells are set as reference (100% of refolded luciferase).

In this protocol a method to measure intracellular protein refolding after heat shock is described. This method can be used to study foldases like molecular chaperones and their co-factors or compounds able to influence their activity. Firefly luciferase activity is used as reporter to measure chaperone refolding activity.

Ripiegamento di analisi intracellulari

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo alcalina Comet Assay e l&#39;enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...