This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

1. Impostazione della triassiale bobine NOTA: la figura 1 mostra le bobine triassiali utilizzati per invertire la GMF. <ol><li> Accendere il magnetometro a tre assi, cui sonda è inserita nelle bobine triassiale. </li><li> Accendere il computer e avviare il software magnetometro che consente ai dati di essere raccolti da tre assi del magnetometro. </li><li> Utilizzare i valori dei componenti riportati dal magnetometro per calcolare la grandezza del GMF. Ad esempio, con valori magnetometro: Bx = 6.39 microtesla, Da = 36.08 microtesla, Bz = 20.40 microtesla calcolare un&#39;intensità di campo di 41.94 mT utilizzando la seguente equazione: B = B GMF + B supplementare, dove altro B = (Bx 2 + Con 2 + 2 Bz) ½ (cioè 41.9 mT nell&#39;esempio.) </li><li> Accendere i tre alimentatori in corrente continua (dual range: 0-8V / 5A e 0-20V / 2.5A, 50W) ciascuno collegato a tre couples di bobine di Helmholtz e collegato ad un computer tramite una connessione GPIB (Figura 1B). </li><li> Impostare tensioni degli alimentatori per generare il campo magnetico desiderato con un campo vettoriale magnetico inverso. Ad esempio, con B GMF come al punto 1.3 e con le dimensioni della bobina della strumentazione qui descritto, impostare le tensioni V x = 0,00 V, V y = 30.52 V, V z = 0.00 V per generare un nuovo risultante B = B + B GMF bobine triassiali = (6.38, -36,08, 20.39) microtesla. cioè, un nuovo campo con lo stesso ordine di grandezza B GMF, ma punta a una direzione diversa. </li><li> Verificare il nuovo campo con il software magnetometro utilizzando la procedura descritta in 1.3. </li><li> Esporre piante sia per normale e invertita condizioni GMF utilizzando piastre di Petri come descritto nella sezione 2. </li><li> Eseguire esperimenti esposizione sham mantenendo l&#39;intensità del campo pari a | B GMF | e conservazionela componente verticale del campo uguale a quella della GMF ma alterare la direzione (cioè, &quot;Nord, est o ovest&quot;) del componente orizzontale del campo con correnti uguali nelle bobine triassiali rispetto alla condizione inversione di campo. A tale scopo, alterando la tensione delle bobine come descritto in 1.5. Nota: Regole Questa esposizione farsa fuori potenziale di riscaldamento sottile o effetti vibrazionali da entrambi le bobine stesse o dalle elettronici usati per controllare le bobine. </li><li> Eseguire esperimenti in doppio cieco, applicando le condizioni del campo accecati dal personale che svolgono il resto degli esperimenti e / o di interpretazione dei dati. </li></ol> 2. Preparazione dei Materiali e condizioni per la crescita delle piante vegetali <ol><li> Utilizzare semi di Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia 0 (Col 0), quindi inserire in una provetta da 1,5 ml e sterilizzare superficie mediante trattamento con un 5% (w / v) Soluzione di ipoclorito di calcio e 0,02% (v / v) Triton X-100 in 80% di etanolo (EtOH), per 10-12 minuti a 25-28 ° C, con agitazione continua. Poi risciacquare due volte con 80% EtOH, lavare con il 100% EtOH ed infine risciacquare con acqua distillata sterile. </li><li> Preparare 1 L di Murashige e Skoog 22 (MS) modificato con l&#39;aggiunta di medio: 2.297 g di SM (0,5 x MS basale Salt Miscela), 10 g di saccarosio, acqua deionizzata fino a 1 L, pH 5,8-6,0 regolato con KOH. Aggiungere 16 g di agar e autoclave per 20 min, 120 ° C. </li><li> Prima di solidificazione, versare 80 ml ​​di terreno in ciascuna (120 x 120 mm 2) piastre Petri quadrati. Seminare trenta semi sterili sul piatto, e quindi sigillare le piastre con un film ceroso. </li><li> Vernalize le piastre orizzontalmente al buio a 4 ° C per 2 giorni per potenziare e sincronizzare la germinazione, e quindi esporre piastre Petri di normale o invertita GMF. </li><li> Esporre semi in un ambiente controllato climatica a 22 ° C in posizione verticale in esperimenti paralleli sia all&#39;interno delle bobine triassiali e fuori le bobine triassialisotto un programma fotoperiodo di 8 ore tenebre e la luce 16 ore, utilizzando lampade a vapore di sodio (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Utilizzare un film di gelatina blu per spotlight per ridurre la componente rossa delle lampade. </li><li> Esporre piante per 10 giorni prima di estrazione di RNA sia normale (controllo) e inversione (trattamento) GMF condizioni. </li><li> Dopo l&#39;esposizione, scattare foto di piastre di Petri. </li><li> Utilizzare il software ImageJ per calcolare lunghezza aree radice e foglia. <ol><li> Brevemente, misurare il lato della piastra Petri, quindi aprire l&#39;immagine della piastra Petri e utilizzando l&#39;opzione &quot;diritta&quot; linea per disegnare una linea che attraversa esattamente il lato piatto. </li><li> Nel menu &quot;analizzare&quot; selezionare &quot;scala set&quot; e inserire la distanza effettiva nella casella &quot;distanza nota&quot; (ad esempio, 120 mm), quindi inserire l&#39;unità di lunghezza (mm); infine fare clic sull&#39;opzione &quot;globale&quot; per configurare le impostazioni disponibili per tutte le misurazioni. </li><li> Per roolunghezza t, seguire attentamente la forma della radice utilizzando lo strumento a mano libera. Misurare la lunghezza utilizzando l&#39;opzione &quot;misura&quot; nel menu &quot;analizzare&quot;. Continuerà a misurare tutte le radici nella foto e salvare il file per ulteriori analisi statistiche. </li><li> Per superficie fogliare, dal menu &quot;immagine&quot;, utilizzare l&#39;opzione e quindi &quot;soglia di colore&quot; regolare. Selezionare la foglia individuo e nel menu &quot;analizzare&quot; selezionare &quot;analizzare particelle&quot;. Salvare le singole misure per le analisi statistiche. </li></ol></li></ol> 3. Arabidopsis RNA totale Estrazione, Quantitative Real-Time PCR (qPCR) Condizioni di reazione e Primer per Arabidopsis <ol><li> Raccogliere separatamente 30 germogli e 30 radici e congelare immediatamente in azoto liquido. Poi macinare in azoto liquido con mortaio e pestello. </li><li> Isolare RNA totale utilizzando un kit di purificazione e kit per il trattamento DNasi RNase-Free utilizzando manufacturistruzioni di Er. </li><li> Verifica qualità e quantità del campione utilizzando un kit di RNA elettroforesi nano e gel capillare secondo le istruzioni del produttore. Confermare la quantificazione di RNA spettrofotometricamente. </li><li> Utilizzare 2 mg di RNA totale e primer casuali utilizzando un kit cDNA trascrizione inversa per ottenere primi cDNA filo secondo le raccomandazioni del costruttore. </li><li> Eseguire tutti gli esperimenti su un Real-Time System con SYBR Green con ROX come standard di carico interno. </li><li> Eseguire la reazione con 25 ml di miscela costituita da 12,5 ml di 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 ml di cDNA e 100 primer nm. Utilizzare i primer elencati nella tabella 1. Includere nei controlli controlli non-RT (utilizzando RNA totale, senza trascrizione inversa per monitorare la contaminazione del DNA genomico) e controlli non di modello (acqua invece di modello). </li><li> Calcola Primer efficienza per tutte le coppie di primer che utilizzano lo standardmetodo della curva 23. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min a 95 ° C, 40 cicli di 15 s a 95 ° C, 30 sec a 58 ° C, e 30 sec a 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, tapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min a 95 ° C, 40 cicli di 15 s a 95 ° C, 20 sec a 57 ° C e 30 secondi a 72 ° C. </li><li> Leggere fluorescenza dopo ciascuna fase di ricottura e di estensione. Per tutte le corse, eseguire un sondo da 55 a 95 ° C includendo il segmento di dissociazione nel profilo termico. Utilizzare la schermata curva di dissociazione, si accede dalla scheda dei risultati per visualizzare il profilo di dissociazione (trama della fluorescenza in funzione della temperatura). Verificare che il set di dati raccolti durante il segmento di dissociazione dell&#39;esperimento viene selezionato per l&#39;analisi utilizzando la schermata di analisi / Setup. </li><li> Determinare il lgamma inear concentrazione modello a valore di ciclo soglia (valore Ct) eseguendo una serie di diluizioni di dieci volte (da 1 a 10 3 fold) utilizzando cDNA da tre estrazioni di RNA indipendenti analizzati in tre repliche tecniche 24,25. </li><li> Analizzare tutti i grafici di amplificazione con la Real-Time PCR strumento software per ottenere valori Ct. Calibrare e normalizzare i livelli di RNA relativi al livello dei migliori geni housekeeping come segue: 3.11.1) Accedi al amplificazione schermata trame attraverso la scheda Risultati, selezionare la rampa o plateau per cui i dati devono essere analizzati mediante lo schermo / Setup Analysis Selection, e quindi selezionare il DRN (baseline corretta fluorescenza normalizzato) dal menu a fluorescenza sul pannello di comando. Accedi al piatto dello schermo Valori di esempio attraverso la scheda Risultati per visualizzare i valori Ct per i pozzi campionati. </li><li> Utilizzare quattro geni di riferimento diversi [ad esempio, citoplasmatica deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato, (GAPC2), ubiquitina specific proteasi 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) e il fattore di allungamento 1B subunità alfa 2 (eEF1Balpha2)] per normalizzare i risultati della PCR in tempo reale. Selezionare la classifica top gene utilizzando un software di analisi 26; e utilizzare il gene più stabile per la normalizzazione. <ol><li> Brevemente, organizzare i dati di ingresso in un foglio Excel con la prima colonna contiene i nomi dei geni e prima riga contenenti i nomi dei campioni. Quindi selezionare il software di analisi dal menu-bar. Utilizzare la finestra di dialogo per selezionare i dati di input. </li><li> Successivamente, verificare i campi nomi dei campioni, i nomi di geni e di uscita semplice solo. Fare clic sul pulsante Vai per eseguire l&#39;analisi. Selezionare la parte superiore gene classificato (che ha il valore di stabilità più piccolo) come gene candidato più stabilmente espresso. </li></ol></li><li> Dati Plot mostrando l&#39;espressione fold change differenziale sia germogli e radici. </li></ol> 4. Analisi statistica <ol><li> Esprimere i dati come valori medi ± errore standard. Confrontare il control e i gruppi di trattamento per l&#39;esecuzione di analisi della varianza (ANOVA) e il test di Tukey con Bonferroni e Dunn-Sidak prova Probabilità rettificato (0,95 fiducia%). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Abbiamo recentemente dimostrato che esiste una correlazione tra la stupefacente inversioni GMF e il momento in cui la deviazione della maggior parte dei lignaggi Angiosperme familiari verificato 2. Tuttavia, nonostante le ipotesi stimolanti e la pletora di studi sugli effetti di varie intensità GMF, l&#39;ipotesi che GMF inversione stessa può indurre cambiamenti significativi nell&#39;espressione genica delle piante e la morfologia non è mai stata dimostrata. Qui mostriamo per la prima volta, un metodo che utilizza un triassiale ottagonale bobina di Helmholtz per invertire GMF nel nostro laboratorio, e che l&#39;inversione del campo magnetico ambientale può causare variazioni fenotipiche e la modulazione dell&#39;espressione genica nelle piante. Per ottenere GMF inversione (o modifica) in un volume sufficiente per gli esperimenti di crescita delle piante (2 x 2 x 2 m 3), abbiamo costruito un sistema di bobine di Helmholtz ottagonale. Questo sistema non è disponibile in commercio (bobine di Helmholtz solito sono sagomate ad anello e più piccolo)e le spese per la costruzione sono stati notevoli. È importante sottolineare che questo sistema offre robusto modifica campo, con eccezionale tempo stabilità e l&#39;omogeneità del campo magnetico modificati. Il sistema è progettato e costruito per ridurre il valore della GMF di un millesimo delle condizioni normali o invertire qualsiasi delle tre dimensioni del campo magnetico. Tuttavia, la progettazione delle bobine non consente di generare una alta intensità di campo magnetico. Pertanto, questo strumento nella forma attuale non è adatto per esperimenti volti a valutare l&#39;effetto della elevata resistenza di campo magnetico su piante o altri organismi. In laboratorio, alterazione della GMF simili a quelli descritti in questo metodo è stato ottenuto con metodi diversi, compresi schermatura circondando la zona sperimentale da piastre metalliche ferromagnetiche con elevata permeabilità magnetica, che si discostano campi magnetici e li concentrano all&#39;interno del metallo stesso. The vantaggio di utilizzare bobine di Helmholtz è che il sistema permette alle piante di essere esposti a condizioni più naturali (luce, la ventilazione, ecc), che lo rendono ideale non solo per gli studi in vitro (come con l&#39;uso di piastre Petri) ma anche in vivo la crescita delle piante e gli esperimenti di sviluppo. Le dimensioni del nostro sistema creano uno spazio che permette una soppressione fino a &lt;1 / 1000e del natural GMF tutto a 25 x 25 x 25 cm 3 volume sferico (vedere Figura 1A), permettendo così di ospitare più piastre Petri o qualche piccola vasi per la crescita delle piante. Il metodo qui presentato è stato applicato a studi di biologia vegetale; tuttavia, il sistema consente una vasta gamma di sperimentazione, compresi virologia e microbiologia, nonché studi su nematodi (Caenorhabditis elegans, ad esempio), artropodi e piccoli animali (compresi topi e ratti). Pertanto, test dell&#39;ipotesi che l&#39;inversione del GMF è in gradoper indurre cambiamenti morfologici e trascrizionali potrebbe anche essere esteso a molti altri sistemi viventi, forse in ultima analisi anche per le cellule umane. La GMF è in continua evoluzione e fluttuante. Pertanto, nei nostri esperimenti una sfida importante è quello di fornire una costante compensazione della GMF per ottenere i nuovi valori GMF desiderati. Questo può essere raggiunto solo da un controllo continuo di valori dei campi magnetici attraverso la lettura dei valori magnetometri e compensazione della tensione. Pertanto, il sistema può compensare la parte lentamente variabile della GMF ma non fa nulla per le fluttuazioni di frequenza superiore. In conclusione, l&#39;utilizzo di bobine triassiali per invertire il vettore GMF stato determinante per dimostrare che questa inversione del vettore GMF è in grado di indurre vegetali cambiamenti morfologici e l&#39;espressione genica differenziale. I risultati ottenuti con il metodo presentato forniscono una prova convincente a sostegno dell&#39;ipotesi che la ri GMFversals avrebbe potuto essere una delle forze trainanti per l&#39;evoluzione piante su scale temporali geologiche 2.

Il campo magnetico della Terra (o equivalentemente il campo geomagnetico, GMF) è un fattore ambientale imprescindibile per tutti gli organismi viventi del pianeta, incluse le piante. La GMF è sempre stata una caratteristica naturale della Terra, così durante l&#39;evoluzione, tutti gli organismi viventi sperimentato la sua azione. Un numero crescente di prove dimostra che il GMF è in grado di influenzare molti processi biologici 1. La GMF non è uniforme e vi sono differenze significative locali nella sua grandezza e direzione sulla superficie della Terra. La GMF sulla superficie della Terra mostra una vasta gamma di grandezze, che vanno da meno di 30 microtesla per quasi 70 microtesla. Il GMF protegge la Terra e la sua biosfera dagli effetti letali di vento solare deviando maggior parte delle sue particelle cariche attraverso la magnetosfera 2. Le piante rispondono agli stimoli ambientali; e le risposte classiche a fattori abiotici come la luce e la gravità sono stati thoroughly descritto definendo le cosiddette risposte fototropiche e gravitropica. Molto poco, o nulla, si sa sui meccanismi di percezione e le risposte delle piante a campi magnetici, nonostante la pletora di lavori pubblicati su questo argomento e recentemente recensito 1. A differenza del campo gravitazionale, la GMF è cambiato costantemente nel corso dell&#39;evoluzione dell&#39;impianto rappresenta quindi un fattore di stress abiotico importante che è stata recentemente considerata una potenziale forza trainante alla fine di contribuire a piantare diversificazione e speciazione 2. Inversioni geomagnetiche (o escursioni) sono cambiamenti nella polarità del GMF. Durante la vita-storia della Terra, inversioni GMF si è verificato più volte. Questi esposti il ​​pianeta a periodi di ridotta forza GMF durante ogni transizione polarità. Alcuni autori hanno ipotizzato che queste transizioni periodi di bassa forza GMF avrebbero permesso radiazioni ionizzanti dal vento solare di raggiungere la superficie terrestre, inducendo in tal modo unasforzo coerente per gli organismi viventi, che avrebbe potuto essere abbastanza forte da indurre alterazioni del gene che alla fine portano a piantare evoluzione 2. Un&#39;analisi dettagliata di esperimenti che descrivono gli effetti dei campi magnetici sulle piante mostra un gran numero di notizie contrastanti, caratterizzate da una carenza di plausibili meccanismi di interazione biofisici. Molti esperimenti sono semplicemente irrealistico, mentre altri mancano un&#39;ipotesi verificabile e, in ultima analisi, non sono convincenti 3. Negli ultimi anni, lo stato di avanzamento della ricerca sugli effetti dei campi magnetici sulla pianta è stato rivisto 2,4-11. Recentemente, l&#39;effetto sia del campo magnetico a bassa ed alta è stata ampiamente discussa 1, con una particolare attenzione al coinvolgimento degli eventi di inversione GMF sull&#39;evoluzione pianta 2. Il mezzo più diretto per comprovare l&#39;ipotesi che le inversioni GMF influenzano l&#39;evoluzione pianta è di sintetizzare un GMFinversione in laboratorio testando la risposta delle piante alle condizioni di campo magnetico normali e invertiti. Per verificare l&#39;ipotesi, quindi abbiamo costruito una ottagonale Helmholtz coil coppie campo magnetico sistema di compensazione triassiale (bobine triassiali), che è in grado di invertire precisione le normali condizioni GMF. Abbiamo usato Arabidopsis thaliana come pianta modello e abbiamo testato l&#39;effetto di inversione GMF sull&#39;espressione genica di alcuni geni importanti: CRUCIFERIN 3 (CRU3), che codifica per una proteina di riserva 12S seme che è tirosina-fosforilata e il suo stato di fosforilazione è modulata in risposta di ABA nei semi di Arabidopsis thaliana 12,13; il rame Trasporti protein1 (COTP1), che codifica per una proteina superfamiglia trasporto heavy metal / disintossicazione con la funzione predominante nel suolo acquisizione Cu e polline di sviluppo 14; e Redox Responsive Trascrizione Factor1 (RRTF1),che codifica un membro del FER (fattore di risposta etilene) sottofamiglia B-3 di ERF / AP2 famiglia fattore di trascrizione che contiene un dominio AP2 che facilitano la sinergica co-attivazione di geni vie di espressione e conferisce tolleranza crociata per abiotiche e biotiche sottolinea 15. Inoltre abbiamo anche analizzato cinque geni coinvolti nelle risposte allo stress ossidativo: Fe superossido Dismutase1, (FSD1), che codifica un enzima citoplasmatico che enzimaticamente e rapidamente converte l&#39;anione superossido (O 2 -) e acqua (H 2 O) al perossido di idrogeno (H 2 O 2) e ossigeno molecolare (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), che codifica e che enzima che catalizza la ripartizione di H 2 O 2 in acqua e ossigeno 17,18; Thylakoidal ascorbato perossidasi (tapX), che codifica una cloroplastica perossidasi tilacoidale che distrugge H 2 O2 19; ascorbato Peroxidase1 (APX1), che codifica una perossidasi citosolico che scavenges H 2 O 2 e rappresenta uno dei potenziali bersagli di modificazioni post-traduzionali mediata da molecole derivate NO 20; e NADPH- respiratoria proteina scoppio ossidasi D (RbohD) che codifica un enzima che genera O 2 - e svolge un ruolo cardine nella regolazione della crescita, lo sviluppo e le risposte allo stress in Arabidopsis 21. La nostra metodologia campo inversione fornisce la prima evidenza che GMF inversione può indurre un cambiamento significativo nell&#39;espressione genica morfologia e di A. radici e germogli. thaliana Questo protocollo fornisce un modo innovativo per valutare l&#39;effetto di inversione GMF sulla morfologia delle piante e l&#39;espressione genica e può essere utilizzato per valutare l&#39;effetto potenziale di GMF inversione su altri aspetti del comportamento delle piante, e quindi guidare discussione del role di GMF inversione sull&#39;evoluzione delle piante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>three-axis magnetometer</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03MC</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer power supply</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03PSU</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer software</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag03DAM</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>E3642A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hypochlorite&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>211389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GroLux Sodium vapor lamps&#160;</td>
			<td>OSRAM Sylvania</td>
			<td>600W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant RNA kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3000P</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Fermentas International, Inc</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5519&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish square (120x120)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z692344&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

Una delle osservazioni più stimolanti di evoluzione delle piante è una correlazione tra la presenza di campo magnetico terrestre (GMF) rigiri (o escursioni) e il momento della radiazione di Angiosperme. Ciò ha portato ad ipotizzare che alterazioni GMF polarità possono svolgere un ruolo nell&#39;evoluzione delle piante. Qui, si descrive un metodo per testare questa ipotesi esponendo Arabidopsis thaliana per invertire artificialmente condizioni GMF. Abbiamo usato un magnetometro a tre assi ei dati raccolti sono stati utilizzati per calcolare l&#39;entità del GMF. Tre alimentatori DC sono stati collegati a tre coppie bobina Helmholtz e sono stati controllati da un computer per modificare le condizioni GMF. Le piante coltivate in piastre di Petri sono stati esposti sia normale e invertite le condizioni GMF. Sono stati inoltre effettuati esperimenti di esposizione Sham. Piante esposte sono stati fotografati durante l&#39;esperimento e le immagini sono state analizzate per calcolare la lunghezza delle radici e le aree di foglie. Arabidopsis RNA totale è stato estratto e quantitativaTime-PCR reale (qPCR) è stato analizzato l&#39;espressione genica di CRUCIFERIN 3 (CRU3), trasporto del rame protein1 (COTP1), Redox Responsive Trascrizione Factor1 (RRTF1), Fe superossido dismutasi 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal ascorbato perossidasi (tapX), un ascorbato citosolica Peroxidase1 (APX1), e NADPH / respiratorio proteina scoppio ossidasi D (RbohD). Quattro differenti geni di riferimento sono stati analizzati per normalizzare i risultati della qPCR. Il migliore dei quattro geni è stato selezionato e il gene più stabile per la normalizzazione è stato utilizzato. I nostri dati dimostrano per la prima volta che invertendo la polarità GMF utilizzando bobine triassiali ha effetti significativi sulla crescita delle piante e l&#39;espressione genica. Questo supporta l&#39;ipotesi che GMF inversione contribuisce a indurre cambiamenti nello sviluppo pianta che potrebbero giustificare una pressione superiore selettiva, portando infine a pevoluzione lant.

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un metodo per valutare se l&#39;inversione del campo magnetico terrestre (GMF), può influenzare lo sviluppo delle piante e l&#39;espressione genica di Arabidopsis thaliana ecotipo Col 0. bobine triassiali come mostrato in Figura 1A sono utilizzati per invertire la GMF quando set con le tensioni di unità appropriate (Figura 1B), ottenuto come descritto al punto 1.5 nel protocollo. Le dimensioni delle bobine triassiali sono ~ 2 x 2 x 2 m 3, che ha permesso spazio sufficiente con condizioni GMF invertiti per ospitare più piastre di Petri. I controlli sono stati coltivati ​​nelle stesse condizioni ambientali e alle normali valori GMF. Dopo 10 giorni di esposizione normale e invertita condizioni GMF, il fenotipo delle piante mostrato evidenti alterazioni morfologiche. Come mostrato in figura 2, piante di controllo (cioè, coltivati ​​in condizioni normali GMF) mostravano lunghezze radicolari con Prob significativamente (Dunn-Sidak e Bonferroni rettificato &lt;0,001;T di Student = 10,68, df = 31) valori elevati (29.41 mm; SEM = 1,04; N = 32) rispetto alle piante esposte a invertita GMF (17.53 mm; SEM = 0,58; N = 36). Negli impianti GMF-invertite, la morfologia dei germogli è stata anche modificata mostrando un ridotto sviluppo di espansione foglio. Le piante esposte a condizioni normali hanno mostrato una superficie media foglia di 4,95 millimetri 2 (SEM 0,025, N = 54), mentre le piante esposte a condizioni GMF invertite hanno mostrato in modo significativo (Dunn-Sidak e Bonferroni rettificato Prob = &lt;0.001; t di Student = 31.32, df = 53) valori foglia inferiore dell&#39;area (3,71 millimetri 2; SEM = 0.032; N = 54). Pertanto, l&#39;esposizione di Arabidopsis a condizioni invertite GMF ha indotto una riduzione in lunghezza radice e superficie fogliare. Foglia espansione e la crescita delle radici dipendono sia la divisione e l&#39;allungamento di 27 cellule. Pertanto, lo sviluppo della pianta, la produttività e la forma fisica generale dipendono da un ottimale Ripresa e la radice del sistema architettura &lt;sup&gt; 28. La lunghezza della radice e foglia ridotte dimensioni delle piante esposte a condizioni GMF invertiti indica la presenza di un sistema di rilevamento in grado di percepire non solo variazioni di intensità del campo magnetico, ma anche per rispondere alle variazioni del campo magnetico &quot;direzione&quot; rispetto alla gravità. L&#39;ipotesi che GMF inversione può influenzare la crescita delle piante trova prove convincenti nei nostri esperimenti, che dimostrano che le condizioni di inversione GMF possono influenzare in modo significativo lo sviluppo della pianta. I cambiamenti morfologici sono stati accompagnati anche da cambiamenti nell&#39;espressione genica. Tra geni housekeeping, il gene più stabile era il fattore di allungamento 1B subunità alfa 2. Il primo gruppo di geni (CRU3, COTP1, RRTF1) mostrava un&#39;alterazione drammatica dell&#39;espressione genica (Figura 3). Sparare espressione di tutti i tre geni è risultato significativamente aumentato (P &lt;0,05) di circa 2,5 volte in impianti esposti a riservad condizioni GMF. Espressione radice di CRU3 stata sovraregolati nelle radici di piante esposte a condizioni normali di GMF, ma era significativamente (P &lt;0.05) downregulated in condizioni GMF invertiti. L&#39;opposto è stato trovato per COTP1 e RRTF1, che sono stati downregulated in condizioni normali e upregulated in presenza di GMF inversione (Figura 3). Cruciferin (una globulina 12 S) è il più abbondante proteina di riserva nei semi di A. thaliana e altre crocifere e viene sintetizzata come un precursore nel reticolo endoplasmatico rugoso. E &#39;poi ​​trasportato ai vacuoli di stoccaggio delle proteine ​​13. Piantina germinazione richiede la ripartizione dei cruciferin, che viene utilizzato come una prima fonte di azoto. Down-regulation dei cruciferin degrado riduce lo sviluppo di embrioni alterando strutture cellulari o componenti delle cellule di sviluppo 29,30. I nostri risultati mostrano che la sovraregolazione di CRU3 correla conminore espansione del foglio e una lunghezza radice ridotta, indicando così che questo gene in sensibile a GMF inversione e che la sua sovraespressione può contribuire alla riduzione dello sviluppo delle piante. Inoltre, GMF inversione induce una sottoregolazione significativa di CRU3 nelle radici, che è correlato con una lunghezza radice ridotta. Il rame è un cofattore essenziale per i processi chiave di piante, ma esercita effetti dannosi quando in eccesso; quindi, overexpressing trasporto del rame compromette la crescita delle piante. L&#39;effetto di GMF inversione è stata una sovraespressione significativo di COTP1 in entrambi i germogli e le radici, spiegando così la crescita delle piante ridotta. Lo stress Ion altera il metabolismo dei cloroplasti, che è strettamente legata allo stato redox della cellula. In Arabidopsis il fattore di trascrizione RRTF1 è importante per l&#39;espressione di geni associati alla capacità di adattarsi a cambiamenti redox 31. Pertanto, quando le piante sono esposte a stimoli esterni possono modificare il loro sviluppo fisiologico eAl programmi è prevista una sovraespressione di questo importante fattore di trascrizione. Inversione del GMF indotto un significativo sovraespressione di RRTF1 in entrambi i germogli e le radici, indicando così le risposte più elevati di stress ossidativo delle piante alle condizioni GMF invertiti. Risultati interessanti sono ottenuti analizzando i cinque geni coinvolti nello stress ossidativo. In generale, tutti i geni estratti e analizzati nei germogli non mostrano differenze significative (P&gt; 0,05) quando le piante sono state coltivate in condizioni normali o invertiti GMF (Figura 4 e Figura 5). Tuttavia, un significativo down-regulation è sempre osservata in radici di piante esposte a condizioni GMF invertiti. In particolare, CAT3 ha mostrato la down-regulation più alta (Figura 5), seguita in ordine di sottoregolazione da APX1, FSD1, RBOHD e tapX (Figura 4). Tolleranza trasversale di unstress biotici e biotici è fornito dalla attivazione di diversi geni coinvolti in numerose vie biochimiche. fattore di trascrizione RRTF1 facilita la sinergica coattivazione dell&#39;espressione genica di queste vie 15,31, e può essere potenzialmente coinvolti nello stress ossidativo 32. Pertanto, upregulation di RRTF1 è previsto quando scavenging ossigeno si riduce. L&#39;abbassamento di radice enzimi evacuazione correla con la upregulation di RRTF1, che agisce in risposta a un aumento dello stress ossidativo. La drammatica downregulation radice di CAT3, APX1 e tapX indica la ridotta capacità delle cellule di root per pulire H 2 O 2, che è accompagnato dalla ridotta capacità di dismutate l&#39;anione superossido da sottoregolazione di FSD1. Le risposte lo stress ossidativo è più elevata nelle radici, che sembrano essere il luogo principale di invertito percezione GMF. Figura 1. geomagnetico sistema di compensazione campo. (A) bobine triassiali (comprendenti una coppia di bobine ottagonali per ciascuno dei tre assi perpendicolari) utilizzati per invertire il campo vettoriale geomagnetico. (B) Un alimentatore controllato da computer è connesso a ciascuna coppia di bobine di Helmholtz. (Tensioni all&#39;interno di queste cifre sono arbitrari) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> Figura 2. Effetti di inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis morfologia. Dopo dieci giorni di esposizione, piante di controllo (ad esempio, quelli esposti alle normali condizioni GMF) mostrano una significativa maggior lunghezza radice e più expanvolantini ded rispetto agli impianti che sono stati esposti a condizioni GMF invertiti. Bar metrico = 18 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> Figura 3. Effetti di inversione di campo geomagnetico sull&#39;espressione genica Arabidopsis. Dopo dieci giorni di esposizione, RNA totale di controllo e piante trattate è stato estratto ed analizzato mediante Real-Time PCR per l&#39;analisi di espressione. L&#39;effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre un cambiamento drastico nella espressione genica di tutti i geni che sono stati testati CRU3, Cruciferin 3;. COTP1, rame Trasporto protein1; RRTF1, Redox Responsive Trascrizione Factor1. Barre indicano errore standard; asterischi indica significative (p &lt;0,05) differenze tra plformiche esposti a condizioni GMF invertito e normali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> Figura 4. Effetti di inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis geni antiossidanti legate. Dopo dieci giorni di esposizione, l&#39;RNA totale di controllo e di piante trattate è isolato e impiegato per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante Real-Time PCR. L&#39;effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre cambiamenti significativi nell&#39;espressione genica sparare; tuttavia, un drastico downregulation è stata osservata in espressione genica radicale delle piante coltivate in condizioni GMF invertite tapX, Thylakoidal Ascorbato perossidasi,. APX1, ascorbato Peroxidase1, FSD1, Fe superossido Dismutase1; RbohD, NA. DPH / respiratoria scoppio ossidasi proteina D Bar indicano errore standard; asterischi indica significativi (p &lt;0.05) le differenze tra le piante esposte a condizioni invertite GMF e normali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> Figura 5. Effetti della inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis catalasi 3 (CAT3) l&#39;espressione genica. Dopo dieci giorni di esposizione, l&#39;RNA totale di controllo e di piante trattate è isolato e impiegato per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante Real-Time PCR. L&#39;effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre cambiamenti significativi nell&#39;espressione genica sparare; tuttavia, una drastica downregulation stata osservata espressione genica radicale delle piante coltivate in condizioni GMF invertiti. Barre indicano erro normar; asterischi indica significativi (p &lt;0.05) le differenze tra le piante esposte a condizioni invertite GMF e normali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sviluppo e Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.0K Views.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Video: Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

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Biologia dello sviluppo

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday products. They are classified as endocrine disrupting compounds (EDC) with estradiol-like properties. Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked with various health defects including cancer, behavioral disorders, and infertility, with greater vulnerability during early developmental periods. To study the effects of BPA on the development of neuronal function, we used an in vitro neuronal network derived from the early chick embryonic brain as a model. We found that exposure to BPA affected the development of network activity, specifically spiking activity and synchronization. A change in network activity is the crucial link between the molecular target of a drug or compound and its effect on behavioral outcome. Multi-electrode arrays are increasingly becoming useful tools to study the effects of drugs on network activity in vitro. There are several systems available in the market and, although there are variations in the number of electrodes, the type and quality of the electrode array and the analysis software, the basic underlying principles, and the data obtained is the same across the different systems. Although currently limited to analysis of two-dimensional in vitro cultures, these MEA systems are being improved to enable in vivo network activity in brain slices. Here, we provide a detailed protocol for embryonic exposure and recording neuronal network activity and synchrony, along with representative results.

Exposure to environmental toxins can acutely impact developing embryos. Endocrine disrupting chemicals such as bisphenols are known to adversely affect the nervous system. Here we describe a protocol using an in vitro vertebrate (chick embryo) neuronal network model to study the functional impact of toxin exposure on early embryos.

Valutazione degli effetti di composti sullo sviluppo della funzione di vertebrati rete neurale utilizzando array di multi-elettrodi sistema endocrino

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...