Name: a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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Ringraziamo il Dr. Jessica Habashi per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo il Dr. Xianyong Sheng di Imaging Center, College di Scienze della vita, Capital Normal University (Cina), per eseguire la localizzazione del dosaggio di DR5-GFP . Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni della Beijing Municipal governo Science Foundation (CIT &#38; TCD20150102) e dal National Natural Science Foundation of China (31600248).

Nota: Questo protocollo ha tre parti: 1) osservando la formazione di pattern in embrioni di Arabidopsis di selvaggio-tipo usando microscopia DIC; 2) che caratterizza l'embrione modello formazione tramite l'osservazione dell'espressione della proteina marker utilizzando laser confocale microscopia; e 3) determinazione del ruolo di un gene specifico nell'embriogenesi (utilizzando il mutante di naa10 ad esempio).
1. ovulo schiarimento
<ol>
	<li>Preparazione del materiale vegetale Nota: Il protocollo descritto qui è un esempio su come far crescere piante sane; funzionano anche altri modi per far crescere piante sane.<ol>
		<li>Aggiungere 100 semi in una provetta da 1,5 mL e quindi aggiungere 1 mL di 1,5% di ipoclorito di sodio (mix 15 mL di 10% di cloro con 85 mL di acqua) per sterilizzare i semi per 5 min, Inverti il tubo più volte per garantire che i semi e la soluzione siano ben mescolate per sterilizzare il superfici semi completamente.</li>
		<li>I semi della forza verso il basso del tubo mediante centrifugazione per 30 s a 1.200 x g, eliminare il surnatante e lavare i semi con acqua sterile quattro volte una panchina per rimuovere il residuo di ipoclorito di sodio.</li>
		<li>Aggiungere 4,4 g di miscela di sale basale di Murashige e Skoog (MS) e 10 g di saccarosio in 1 L di acqua ultrapura. Mescolare per sciogliere i sali e saccarosio. Regolare la soluzione a pH 5,8 con 1m KOH, aggiungere 3 g di agente gelificante, ad esempio Phytagel, la soluzione di MS-saccarosio e sterilizzare la soluzione a 121 ° C per 15 min rendere MS Media.</li>
		<li>Versare 30 mL di terreno MS in una piastra di coltura di 12 cm per generare piastre di terreno di MS.</li>
		<li>Collocare i semi sterilizzati sulla piastra di MS. Trasferire la piastra ad una camera di crescita e mantenere la piastra in condizioni di giorno lungo (22 ° C per 16 h nella luce e a 18 ° C per 8 h al buio) dopo stratificazione di seme (3 giorni a 4 ° C al buio).</li>
		<li>Dopo 8 giorni di crescita, trasferire le piante al suolo (mix ricco di sostanze nutritive del terreno e vermiculite con un rapporto 1:1) in un vassoio, coprire il vassoio con coperchio bianco, trasparente per 5 giorni evitare la perdita di acqua e lasciare uno spazio vuoto per evitare la vetrificazione delle piante.</li>
		<li>Prendere il coperchio del vassoio e coltivare le piante in una camera di cabina in condizioni di giorno lungo (Vedi 1.1.5). Accendere la luce alle 6:00 e si spegne alle 22:00. Dopo circa 20 giorni di crescita nella camera di cabina, le piante saranno hanno fiorito e prodotto silique.</li>
		<li>Mark i boccioli dei fiori con un thread nella posizione del seme gambi in infiorescenza alle 20:00 (non utilizzare il primo per i terzi boccioli di fiori; silique generati da questi boccioli di fiori di solito sviluppano alcuni semi abortiti, e ciò può alterare la proporzione di normale di ovuli anormali). Definire l'inizio dell'impollinazione dell'ovulo come quando il germoglio contrassegnato apre al fiore alle 8:00 la mattina successiva.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione della soluzione di Hoyer
	<ol>
		<li>Aggiungere 24 g di idrato di cloralio in una provetta da 50 mL e avvolgere il tubo completamente con foglio di alluminio (soluzioni di idrato di cloralio non sono stabili alla luce).</li>
		<li>Successivamente, aggiungere 9 mL di acqua ultrapura e 3 mL di glicerolo per la soluzione di cui sopra e agitare la provetta per scioglierne l'idrato di cloralio. Per rendere la soluzione di Hoyer, lasciare riposare per una notte a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquidazione e separazione dell'ovulo
	<ol>
		<li>Attaccare un pezzo di nastro bi adesivo per un vetrino per microscopio. Posizionare un anemofila coltivata per il numero desiderato di giorni dopo l'impollinazione (DAP) sulla diapositiva con la pseudoseptum perpendicolare alla superficie; Questo renderà più facile dividere i carpelli (figure 1A e 1B).</li>
		<li>Dividere i carpelli su entrambi i lati della pseudoseptum con un ago di siringa e collegare i due carpelli dissecati alla diapositiva in modo che gli ovuli nell'anemofila sono visibili sotto uno stereoscopio (figure 1 e 1 D).</li>
		<li>Dispensare 70 µ l di soluzione di Hoyer su lastra di vetro e quindi inumidire la punta di un paio di pinzette a punta fine con soluzione di Hoyer immergendo. Utilizzando lo stereoscopio, spostare gli ovuli in soluzione di Hoyer sul vetrino con le pinzette per pulire gli embrioni. Applicare un vetrino coprioggetti alla diapositiva delicatamente per evitare di generare tutte le bolle.</li>
		<li>Mettere il vetrino finito in una scatola in una stanza buia per 2-12 h (più un ovulo è maturo, più tempo sarà necessario) a temperatura ambiente. Embrioni allo stadio di 2/4-cella (1-2 DAP) possono essere osservati microscopicamente dopo 2 h, mentre gli embrioni tra l'ottante e prime fasi globulare (DAP 3) possono essere osservati dopo 4 h. Più maturi embrioni (4-8 DAP) possono essere osservati dopo 12 h.</li>
		<li>Esaminare gli ovuli eliminati utilizzando la funzione DIC di un microscopio. Individuare gli embrioni in un campo di bassa potenza (10x) e quindi modificare a un campo ad alta potenza (100 X obiettivo ad immersione) per osservare il modello cellulare negli embrioni sviluppati.</li>
		<li>Esaminare gli embrioni a diversi stadi di sviluppo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. caratterizzazione di Patterning di embrione e identità cellulare tramite l'osservazione dell'espressione della proteina Marker
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	<li>Preparazione di materiali vegetali
	<ol>
		<li>Clonare il promotore e la sequenza dell'elemento di risposta marcatore gene o ormone di codificazione e poi si fondono con una proteina fluorescente (ad esempio di GFP); Successivamente, è possibile inserire il costrutto nel vettore binario (ad esempio pCambia1300). Qui, l'elemento di risposta dell'auxina DR5 è presentato come un esempio10.</li>
		<li>Introdurre il plasmide DR5-GFP risultante le piante di selvaggio-tipo di Agrobacterium tumefaciens-mediata trasformazione11. Selezionare le piante T1 utilizzando MS medie piastre contenenti igromicina (50 mg/mL di acqua madre, diluito 1:1, 000). Le piante transgeniche si esibiscono le radici lunghe e generare due foglie di Rosetta dopo 8 giorni di crescita nelle condizioni descritte in 1.1.5.</li>
		<li>Trasferire le piante transgeniche per il suolo e coltivarli come indicato in 1.1.6 e 1.1.7.</li>
		<li>Raccogliere i semi di T2 dalle linee T1 indipendente. Seminare i semi su MS-igromicina piastre, selezionare le piante che trasportano una copia dell'inserzione DR5-GFP (il rapporto di piante resistenti a piante sensibili sarà circa 3:1) e trasferirli al suolo.</li>
		<li>Coltivare le piante di T2 come indicato in 1.1.6 e 1.1.7.</li>
		<li>Raccogliere i semi di T3 dalle piante T2. Seminare i semi su MS-igromicina piastre, selezionare le piante transgeniche omozigoti (tutte le piante da una singola riga esporrà igromicina resistenza) e trasferirli al suolo.</li>
		<li>Segnare i boccioli dei fiori delle piante omozigoti T3 come indicato nella 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osservazione del segnale GFP
	<ol>
		<li>Mescolare 3 mL di glicerolo con 47 mL di acqua ultrapura per generare una soluzione di glicerolo di 6%.</li>
		<li>Attaccare un pezzo di nastro bi adesivo per un vetrino per microscopio e fissare un anemofila come indicato in 1.3.1.</li>
		<li>Split dei carpelli su entrambi i lati della pseudoseptum con un ago di siringa e collegare i due carpelli dissecati il vetrino sotto uno stereoscopio come indicato in 1.3.2.</li>
		<li>Versare 30 µ l di 6% glicerolo su lastra di vetro e inserire tutti gli ovuli da carpelli dissecati nella soluzione usando la pinzetta appuntita. Appoggiate delicatamente un vetrino coprioggetto sul vetrino.</li>
		<li>Come il cappotto di seme ed endosperma in ogni ovulo può impedire l'osservazione dei segnali GFP nell'embrione, estrarre l'embrione da ovulo. Tocca la diapositiva rapidamente e delicatamente per estrudere l'embrione da ovulo (più un ovulo è maturo, meno la forza deve essere applicata alla diapositiva).</li>
		<li>Esaminare il vetrino per fluorescenza GFP mediante microscopia a scansione laser confocale. Trovare gli embrioni isolati sotto un campo di bassa potenza (10x) e registrare la loro posizione, poi cambiare per un campo ad alta potenza (100 X obiettivo ad immersione) per osservare il DR5-GFP espressione negli embrioni impostando la sorgente di luce di eccitazione a 488 nm per il rilevamento del segnale GFP.</li>
		<li>Rilevare l'espressione di GFP negli embrioni per selezionare la linea T3 adatta per ulteriori analisi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. caratterizzazione della formazione di Pattern dell'embrione in un embrione-letale mutante tramite Clearance dell'ovulo e l'osservazione di proteina Marker: Naa10 come un esempio
<ol>
	<li>Patterning di embrione in piante mutanti naa10
	<ol>
		<li>Preparare i materiali vegetali come indicato in 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>Identificare il naa10+ / − piante mediante PCR usando gli iniettori di gene-specific5e poi mark i boccioli dei fiori di naa10+ / − piante come indicato in 1.1.8.</li>
		<li>Eseguire la clearance dell'ovulo e l'esame al microscopio di naa10+ / − embrioni come indicato in 1.2 e 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi delle proteine marker utilizzando embrioni naa10
	<ol>
		<li>Ottenere il DR5-GFP adatti linee transgeniche utilizzando la procedura descritta al punto 2.1-2.2.</li>
		<li>Attraversare una linea di transgenici omozigotica DR5-GFP con un naa10+ / − pianta per ottenere naa10+ / − piante che sono omozigotiche per il marcatore di fluorescenza di GFP alla generazione F2 (identificata dalla PCR del gene-specifico) per caratterizzare naa10+ / −5 e osservare il segnale GFP sotto un microscopio utilizzando una linea di DR5-GFP omozigotica.</li>
		<li>Contrassegnare i boccioli dei fiori di naa10+ / − piante che sono omozigotiche per DR5-GFP come indicato in 2.1.7.</li>
		<li>Ricerca il segnale GFP in embrioni di naa10 che sono omozigotici per DR5-GFP come indicato al punto 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model.">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li><li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+plant:+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis.">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li><li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+monopteros+gene+in+organising+the+basal+body+region+of+the+Arabidopsis+embryo.">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis.">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aux/IAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements.">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li><li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis.">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La clearance dell'ovulo è un metodo utile per rilevare la divisione cellulare e valutare morfologia durante l'embriogenesi in Arabidopsis; utilizzando questa tecnica, gli embrioni possono essere osservati direttamente nel DIC microscopia5,12. Il passaggio fondamentale per lo sdoganamento dell'ovulo è punto 1.3.4. Il tempo richiesto per lo sdoganamento dell'ovulo nel passaggio 1.3.4 è variabile. Embrioni allo stadio di 2/4-cellule possono essere osserv...

L'embriogenesi è l'evento più iniziale in maggiore sviluppo delle piante. Forma un embrione maturo da uno zigote attraverso divisione delle cellule e differenziazione sotto rigoroso controllo genetico1,2. Embrioni di Arabidopsis sono un modello utile per studiare il controllo della morfogenesi, perché la sequenza di divisioni cellulari durante l'embriogenesi segue un modello previsto3,4. Tuttavia, un embrione di Arabidopsis contenente uno a parecchie cellule è troppo piccolo per essere osservata e analizzata. Inoltre, la mutazione di determinati geni possa causare embrione letalità5, che indica il ruolo chiave di questi geni nell'embriogenesi. La caratterizzazione della formazione di pattern nei mutanti embrione-letale fornisce una base per la comprensione del meccanismo molecolare con cui geni essenziali regolano lo sviluppo dell'embrione.
Un metodo dettagliato è descritto qui per la caratterizzazione di formazione modello dell'embrione nella pianta modello Arabidopsis mediante osservazione microscopica diretta. Il metodo prevede la liquidazione dell'ovulo seguita dall'osservazione al microscopio di un embrione. La caratterizzazione di un mutante di embrione-letale è anche descritto.
La morfologia degli embrioni a diversi stadi di sviluppo può essere determinata direttamente da microscopia utilizzando gli ovuli che sono stati cancellati con soluzione6,7 di Hoyer. Tali ovuli esibiscono un alto indice di rifrazione; così, questo ovulo metodo di compensazione è particolarmente vantaggioso per gli esemplari che devono essere osservati da microscopia (DIC) contrasto differenziale di interferenza.
Inoltre, i geni che sono espressi in una determinata cella o un numero limitato di cellule durante l'embriogenesi utilizzabile come marcatori per identificare le cellule di un embrione. Pertanto, la specifica identità cellulare durante l'embriogenesi può essere annotata monitorando l'espressione della GFP-etichettato marker proteici mediante microscopia a scansione laser confocale. Al contrario, osservando il pattern di espressione di un gene funzionale sconosciuto -GFP fusione durante l'embriogenesi può fornire un collegamento tra embrione patterning e l'espressione di quel gene e facilitare l'identificazione di nuovi geni che sono necessari per l'embriogenesi in Arabidopsis.
Il metodo qui descritto è utilizzabile anche per caratterizzare il fenotipo di un embrione-letale mutante e per determinare l'impatto del gene interessato su embriogenesi a livello cellulare. Inoltre, in combinazione con un confronto del modello di espressione dei geni marcatori durante l'embriogenesi tra piante wild-type e mutanti, il metodo può produrre indizi circa i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione coinvolte nella embriogenesi8,9. Infatti, il metodo è stato applicato agli impianti di naa10 , e si è constatato che la divisione anormale del hypophysis nel mutante può essere causata da un cambiamento nella distribuzione dell'auxina durante l'embriogenesi5.

<table><tbody><tr><td>Chloral Hydrate</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>camera: AxioCam 506 color</td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>filters: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>camera: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>nutrient-rich soil</td><td>KLASMANN, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sodium hypochlorite solution</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>sucrose</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>glycerol</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>culture dish</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>glass slide</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>syringe needle</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>fine-tipped tweezers</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>super clean bench</td><td></td><td></td><td>Domestic equipment</td></tr></tbody></table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

Data la natura altamente prevedibile del loro sviluppo, embrioni di Arabidopsis sono stati utilizzati come modello per gli studi della morfogenesi in piante. Tuttavia, primi embrioni di pianta di fase sono piccoli e contengono poche cellule, che li rende difficili da osservare e analizzare. Un metodo è descritto qui per caratterizzare la formazione di pattern in embrioni di pianta sotto un microscopio usando l'organismo modello Arabidopsis. A seguito della liquidazione di ovuli freschi utilizzando soluzione di Hoyer, il numero di cell in e la morfologia degli embrioni ha potuto essere osservati, e loro stadio di sviluppo potrebbe essere determinata da microscopia di contrasto di interferenza differenziale utilizzando un 100x obiettivo d'immersione in olio. Inoltre, l'espressione delle proteine marker specifici contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) è stato monitorato per annotare la specifica identità cellulare durante patterning di embrione di microscopia a scansione laser confocale. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per osservare la formazione di pattern in embrioni di selvaggio-tipo pianta a livello cellulare e molecolare e di caratterizzare il ruolo di geni specifici nel patterning embrione confrontando la formazione di pattern in embrioni da piante wild type e mutanti embrione-letale. Pertanto, il metodo può essere utilizzato per caratterizzare l'embriogenesi in Arabidopsis.

Il metodo descritto in questo documento può essere utilizzato per osservare l'embriogenesi direttamente sotto un microscopio, annotare la specifica identità cellulare durante l'embriogenesi con marcatori specifici e caratterizzare il ruolo di un gene particolare durante l'embriogenesi.
Risultati rappresentativi dall'analisi dell'embrione patterning (dalla fase di zigote allungata per la fase matura del bastone) nel selvaggio-t...

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A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

11.1K Views.  Capital Normal University. Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

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Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biologia

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Come la Germinazione Controlli endosperma del seme in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di

Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico