Ringraziamo il Dr. Jessica Habashi per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo il Dr. Xianyong Sheng di Imaging Center, College di Scienze della vita, Capital Normal University (Cina), per eseguire la localizzazione del dosaggio di DR5-GFP . Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni della Beijing Municipal governo Science Foundation (CIT &#38; TCD20150102) e dal National Natural Science Foundation of China (31600248).

Nota: Questo protocollo ha tre parti: 1) osservando la formazione di pattern in embrioni di Arabidopsis di selvaggio-tipo usando microscopia DIC; 2) che caratterizza l'embrione modello formazione tramite l'osservazione dell'espressione della proteina marker utilizzando laser confocale microscopia; e 3) determinazione del ruolo di un gene specifico nell'embriogenesi (utilizzando il mutante di naa10 ad esempio).
1. ovulo schiarimento
<ol>
	<li>Preparazione del materiale vegetale Nota: Il protocollo descritto qui è un esempio su come far crescere piante sane; funzionano anche altri modi per far crescere piante sane.<ol>
		<li>Aggiungere 100 semi in una provetta da 1,5 mL e quindi aggiungere 1 mL di 1,5% di ipoclorito di sodio (mix 15 mL di 10% di cloro con 85 mL di acqua) per sterilizzare i semi per 5 min, Inverti il tubo più volte per garantire che i semi e la soluzione siano ben mescolate per sterilizzare il superfici semi completamente.</li>
		<li>I semi della forza verso il basso del tubo mediante centrifugazione per 30 s a 1.200 x g, eliminare il surnatante e lavare i semi con acqua sterile quattro volte una panchina per rimuovere il residuo di ipoclorito di sodio.</li>
		<li>Aggiungere 4,4 g di miscela di sale basale di Murashige e Skoog (MS) e 10 g di saccarosio in 1 L di acqua ultrapura. Mescolare per sciogliere i sali e saccarosio. Regolare la soluzione a pH 5,8 con 1m KOH, aggiungere 3 g di agente gelificante, ad esempio Phytagel, la soluzione di MS-saccarosio e sterilizzare la soluzione a 121 ° C per 15 min rendere MS Media.</li>
		<li>Versare 30 mL di terreno MS in una piastra di coltura di 12 cm per generare piastre di terreno di MS.</li>
		<li>Collocare i semi sterilizzati sulla piastra di MS. Trasferire la piastra ad una camera di crescita e mantenere la piastra in condizioni di giorno lungo (22 ° C per 16 h nella luce e a 18 ° C per 8 h al buio) dopo stratificazione di seme (3 giorni a 4 ° C al buio).</li>
		<li>Dopo 8 giorni di crescita, trasferire le piante al suolo (mix ricco di sostanze nutritive del terreno e vermiculite con un rapporto 1:1) in un vassoio, coprire il vassoio con coperchio bianco, trasparente per 5 giorni evitare la perdita di acqua e lasciare uno spazio vuoto per evitare la vetrificazione delle piante.</li>
		<li>Prendere il coperchio del vassoio e coltivare le piante in una camera di cabina in condizioni di giorno lungo (Vedi 1.1.5). Accendere la luce alle 6:00 e si spegne alle 22:00. Dopo circa 20 giorni di crescita nella camera di cabina, le piante saranno hanno fiorito e prodotto silique.</li>
		<li>Mark i boccioli dei fiori con un thread nella posizione del seme gambi in infiorescenza alle 20:00 (non utilizzare il primo per i terzi boccioli di fiori; silique generati da questi boccioli di fiori di solito sviluppano alcuni semi abortiti, e ciò può alterare la proporzione di normale di ovuli anormali). Definire l'inizio dell'impollinazione dell'ovulo come quando il germoglio contrassegnato apre al fiore alle 8:00 la mattina successiva.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione della soluzione di Hoyer
	<ol>
		<li>Aggiungere 24 g di idrato di cloralio in una provetta da 50 mL e avvolgere il tubo completamente con foglio di alluminio (soluzioni di idrato di cloralio non sono stabili alla luce).</li>
		<li>Successivamente, aggiungere 9 mL di acqua ultrapura e 3 mL di glicerolo per la soluzione di cui sopra e agitare la provetta per scioglierne l'idrato di cloralio. Per rendere la soluzione di Hoyer, lasciare riposare per una notte a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquidazione e separazione dell'ovulo
	<ol>
		<li>Attaccare un pezzo di nastro bi adesivo per un vetrino per microscopio. Posizionare un anemofila coltivata per il numero desiderato di giorni dopo l'impollinazione (DAP) sulla diapositiva con la pseudoseptum perpendicolare alla superficie; Questo renderà più facile dividere i carpelli (figure 1A e 1B).</li>
		<li>Dividere i carpelli su entrambi i lati della pseudoseptum con un ago di siringa e collegare i due carpelli dissecati alla diapositiva in modo che gli ovuli nell'anemofila sono visibili sotto uno stereoscopio (figure 1 e 1 D).</li>
		<li>Dispensare 70 µ l di soluzione di Hoyer su lastra di vetro e quindi inumidire la punta di un paio di pinzette a punta fine con soluzione di Hoyer immergendo. Utilizzando lo stereoscopio, spostare gli ovuli in soluzione di Hoyer sul vetrino con le pinzette per pulire gli embrioni. Applicare un vetrino coprioggetti alla diapositiva delicatamente per evitare di generare tutte le bolle.</li>
		<li>Mettere il vetrino finito in una scatola in una stanza buia per 2-12 h (più un ovulo è maturo, più tempo sarà necessario) a temperatura ambiente. Embrioni allo stadio di 2/4-cella (1-2 DAP) possono essere osservati microscopicamente dopo 2 h, mentre gli embrioni tra l'ottante e prime fasi globulare (DAP 3) possono essere osservati dopo 4 h. Più maturi embrioni (4-8 DAP) possono essere osservati dopo 12 h.</li>
		<li>Esaminare gli ovuli eliminati utilizzando la funzione DIC di un microscopio. Individuare gli embrioni in un campo di bassa potenza (10x) e quindi modificare a un campo ad alta potenza (100 X obiettivo ad immersione) per osservare il modello cellulare negli embrioni sviluppati.</li>
		<li>Esaminare gli embrioni a diversi stadi di sviluppo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. caratterizzazione di Patterning di embrione e identità cellulare tramite l'osservazione dell'espressione della proteina Marker
<ol>
	<li>Preparazione di materiali vegetali
	<ol>
		<li>Clonare il promotore e la sequenza dell'elemento di risposta marcatore gene o ormone di codificazione e poi si fondono con una proteina fluorescente (ad esempio di GFP); Successivamente, è possibile inserire il costrutto nel vettore binario (ad esempio pCambia1300). Qui, l'elemento di risposta dell'auxina DR5 è presentato come un esempio10.</li>
		<li>Introdurre il plasmide DR5-GFP risultante le piante di selvaggio-tipo di Agrobacterium tumefaciens-mediata trasformazione11. Selezionare le piante T1 utilizzando MS medie piastre contenenti igromicina (50 mg/mL di acqua madre, diluito 1:1, 000). Le piante transgeniche si esibiscono le radici lunghe e generare due foglie di Rosetta dopo 8 giorni di crescita nelle condizioni descritte in 1.1.5.</li>
		<li>Trasferire le piante transgeniche per il suolo e coltivarli come indicato in 1.1.6 e 1.1.7.</li>
		<li>Raccogliere i semi di T2 dalle linee T1 indipendente. Seminare i semi su MS-igromicina piastre, selezionare le piante che trasportano una copia dell'inserzione DR5-GFP (il rapporto di piante resistenti a piante sensibili sarà circa 3:1) e trasferirli al suolo.</li>
		<li>Coltivare le piante di T2 come indicato in 1.1.6 e 1.1.7.</li>
		<li>Raccogliere i semi di T3 dalle piante T2. Seminare i semi su MS-igromicina piastre, selezionare le piante transgeniche omozigoti (tutte le piante da una singola riga esporrà igromicina resistenza) e trasferirli al suolo.</li>
		<li>Segnare i boccioli dei fiori delle piante omozigoti T3 come indicato nella 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osservazione del segnale GFP
	<ol>
		<li>Mescolare 3 mL di glicerolo con 47 mL di acqua ultrapura per generare una soluzione di glicerolo di 6%.</li>
		<li>Attaccare un pezzo di nastro bi adesivo per un vetrino per microscopio e fissare un anemofila come indicato in 1.3.1.</li>
		<li>Split dei carpelli su entrambi i lati della pseudoseptum con un ago di siringa e collegare i due carpelli dissecati il vetrino sotto uno stereoscopio come indicato in 1.3.2.</li>
		<li>Versare 30 µ l di 6% glicerolo su lastra di vetro e inserire tutti gli ovuli da carpelli dissecati nella soluzione usando la pinzetta appuntita. Appoggiate delicatamente un vetrino coprioggetto sul vetrino.</li>
		<li>Come il cappotto di seme ed endosperma in ogni ovulo può impedire l'osservazione dei segnali GFP nell'embrione, estrarre l'embrione da ovulo. Tocca la diapositiva rapidamente e delicatamente per estrudere l'embrione da ovulo (più un ovulo è maturo, meno la forza deve essere applicata alla diapositiva).</li>
		<li>Esaminare il vetrino per fluorescenza GFP mediante microscopia a scansione laser confocale. Trovare gli embrioni isolati sotto un campo di bassa potenza (10x) e registrare la loro posizione, poi cambiare per un campo ad alta potenza (100 X obiettivo ad immersione) per osservare il DR5-GFP espressione negli embrioni impostando la sorgente di luce di eccitazione a 488 nm per il rilevamento del segnale GFP.</li>
		<li>Rilevare l'espressione di GFP negli embrioni per selezionare la linea T3 adatta per ulteriori analisi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. caratterizzazione della formazione di Pattern dell'embrione in un embrione-letale mutante tramite Clearance dell'ovulo e l'osservazione di proteina Marker: Naa10 come un esempio
<ol>
	<li>Patterning di embrione in piante mutanti naa10
	<ol>
		<li>Preparare i materiali vegetali come indicato in 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>Identificare il naa10+ / − piante mediante PCR usando gli iniettori di gene-specific5e poi mark i boccioli dei fiori di naa10+ / − piante come indicato in 1.1.8.</li>
		<li>Eseguire la clearance dell'ovulo e l'esame al microscopio di naa10+ / − embrioni come indicato in 1.2 e 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi delle proteine marker utilizzando embrioni naa10
	<ol>
		<li>Ottenere il DR5-GFP adatti linee transgeniche utilizzando la procedura descritta al punto 2.1-2.2.</li>
		<li>Attraversare una linea di transgenici omozigotica DR5-GFP con un naa10+ / − pianta per ottenere naa10+ / − piante che sono omozigotiche per il marcatore di fluorescenza di GFP alla generazione F2 (identificata dalla PCR del gene-specifico) per caratterizzare naa10+ / −5 e osservare il segnale GFP sotto un microscopio utilizzando una linea di DR5-GFP omozigotica.</li>
		<li>Contrassegnare i boccioli dei fiori di naa10+ / − piante che sono omozigotiche per DR5-GFP come indicato in 2.1.7.</li>
		<li>Ricerca il segnale GFP in embrioni di naa10 che sono omozigotici per DR5-GFP come indicato al punto 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model.">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li><li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+plant:+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis.">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li><li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+monopteros+gene+in+organising+the+basal+body+region+of+the+Arabidopsis+embryo.">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis.">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aux/IAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements.">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li><li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis.">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La clearance dell'ovulo è un metodo utile per rilevare la divisione cellulare e valutare morfologia durante l'embriogenesi in Arabidopsis; utilizzando questa tecnica, gli embrioni possono essere osservati direttamente nel DIC microscopia5,12. Il passaggio fondamentale per lo sdoganamento dell'ovulo è punto 1.3.4. Il tempo richiesto per lo sdoganamento dell'ovulo nel passaggio 1.3.4 è variabile. Embrioni allo stadio di 2/4-cellule possono essere osserv...

L'embriogenesi è l'evento più iniziale in maggiore sviluppo delle piante. Forma un embrione maturo da uno zigote attraverso divisione delle cellule e differenziazione sotto rigoroso controllo genetico1,2. Embrioni di Arabidopsis sono un modello utile per studiare il controllo della morfogenesi, perché la sequenza di divisioni cellulari durante l'embriogenesi segue un modello previsto3,4. Tuttavia, un embrione di Arabidopsis contenente uno a parecchie cellule è troppo piccolo per essere osservata e analizzata. Inoltre, la mutazione di determinati geni possa causare embrione letalità5, che indica il ruolo chiave di questi geni nell'embriogenesi. La caratterizzazione della formazione di pattern nei mutanti embrione-letale fornisce una base per la comprensione del meccanismo molecolare con cui geni essenziali regolano lo sviluppo dell'embrione.
Un metodo dettagliato è descritto qui per la caratterizzazione di formazione modello dell'embrione nella pianta modello Arabidopsis mediante osservazione microscopica diretta. Il metodo prevede la liquidazione dell'ovulo seguita dall'osservazione al microscopio di un embrione. La caratterizzazione di un mutante di embrione-letale è anche descritto.
La morfologia degli embrioni a diversi stadi di sviluppo può essere determinata direttamente da microscopia utilizzando gli ovuli che sono stati cancellati con soluzione6,7 di Hoyer. Tali ovuli esibiscono un alto indice di rifrazione; così, questo ovulo metodo di compensazione è particolarmente vantaggioso per gli esemplari che devono essere osservati da microscopia (DIC) contrasto differenziale di interferenza.
Inoltre, i geni che sono espressi in una determinata cella o un numero limitato di cellule durante l'embriogenesi utilizzabile come marcatori per identificare le cellule di un embrione. Pertanto, la specifica identità cellulare durante l'embriogenesi può essere annotata monitorando l'espressione della GFP-etichettato marker proteici mediante microscopia a scansione laser confocale. Al contrario, osservando il pattern di espressione di un gene funzionale sconosciuto -GFP fusione durante l'embriogenesi può fornire un collegamento tra embrione patterning e l'espressione di quel gene e facilitare l'identificazione di nuovi geni che sono necessari per l'embriogenesi in Arabidopsis.
Il metodo qui descritto è utilizzabile anche per caratterizzare il fenotipo di un embrione-letale mutante e per determinare l'impatto del gene interessato su embriogenesi a livello cellulare. Inoltre, in combinazione con un confronto del modello di espressione dei geni marcatori durante l'embriogenesi tra piante wild-type e mutanti, il metodo può produrre indizi circa i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione coinvolte nella embriogenesi8,9. Infatti, il metodo è stato applicato agli impianti di naa10 , e si è constatato che la divisione anormale del hypophysis nel mutante può essere causata da un cambiamento nella distribuzione dell'auxina durante l'embriogenesi5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Chloral Hydrate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15307</td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phytagel</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Hygromycin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber&#160;</td>
			<td>Percival</td>
			<td style="width:119px;">CU36L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss Image M2</td>
			<td>camera: AxioCam 506 color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss LSM 5</td>
			<td>filters: BP 495-555 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Axio Zoom V16</td>
			<td>camera: AxioCam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient-rich&#160;soil</td>
			<td colspan="2">KLASMANN, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">10% sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture dish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vermiculite</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass slide</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syringe needle</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine-tipped tweezers</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">super clean bench</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

Data la natura altamente prevedibile del loro sviluppo, embrioni di Arabidopsis sono stati utilizzati come modello per gli studi della morfogenesi in piante. Tuttavia, primi embrioni di pianta di fase sono piccoli e contengono poche cellule, che li rende difficili da osservare e analizzare. Un metodo è descritto qui per caratterizzare la formazione di pattern in embrioni di pianta sotto un microscopio usando l'organismo modello Arabidopsis. A seguito della liquidazione di ovuli freschi utilizzando soluzione di Hoyer, il numero di cell in e la morfologia degli embrioni ha potuto essere osservati, e loro stadio di sviluppo potrebbe essere determinata da microscopia di contrasto di interferenza differenziale utilizzando un 100x obiettivo d'immersione in olio. Inoltre, l'espressione delle proteine marker specifici contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) è stato monitorato per annotare la specifica identità cellulare durante patterning di embrione di microscopia a scansione laser confocale. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per osservare la formazione di pattern in embrioni di selvaggio-tipo pianta a livello cellulare e molecolare e di caratterizzare il ruolo di geni specifici nel patterning embrione confrontando la formazione di pattern in embrioni da piante wild type e mutanti embrione-letale. Pertanto, il metodo può essere utilizzato per caratterizzare l'embriogenesi in Arabidopsis.

Il metodo descritto in questo documento può essere utilizzato per osservare l'embriogenesi direttamente sotto un microscopio, annotare la specifica identità cellulare durante l'embriogenesi con marcatori specifici e caratterizzare il ruolo di un gene particolare durante l'embriogenesi.
Risultati rappresentativi dall'analisi dell'embrione patterning (dalla fase di zigote allungata per la fase matura del bastone) nel selvaggio-t...

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A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

a-method-for-characterizing-embryogenesis-in-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

11.0K Views.  Capital Normal University. Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

Video: A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Metodo di studio palatale Fusion utilizzando Statico Cultura Organo

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...