German Legal Casualty Insurance (DGUV), Research Commission of the Medical Faculty of the Heinrich-Heine-University

linee guida istituzionali per la sicurezza degli animali e il comfort sono stati rispettati, e tutti gli interventi chirurgici e la cura degli animali pre e post-chirurgica sono stati forniti nel rispetto della legge sulla protezione degli animali tedesca (Ufficio di Stato, ambientale e tutela dei consumatori del Nord Reno-Westfalia, LANUV NRW ). 1. transezione completa del midollo spinale toracico di ratti femmina Wistar (220 - 250 g) <ol><li> Preparazione del midollo spinale <ol><li> Utilizzare isoflurano anestesia per inalazione (2 - 3% di isoflurano in O 2 / NO 2 con un rapporto di 1: 2) e bolo di Carprofen (sottocutanea [sc] 5 mg / kg). Si raccomanda la combinazione di carprofen e buprenorfina oppioidi (0,02 mg / kg sc). Inizia chirurgia quando palpebra riflesso al tocco leggero con un batuffolo di cotone e zampa ritiro reflex a pizzicare stimolo con una pinza non sono più rispettate. </li><li> Posto l&#39;animale su una coperta di riscaldamento a 37 ° C per mantenere la tempe corpore durante l&#39;intervento e mettere pomata occhio sugli occhi per evitare la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Shave dorso dell&#39;animale e preparare la pelle con un disinfettante pelle. </li><li> Tagliare la pelle sulla linea mediana lungo le vertebre toraciche per 4 cm con una lama chirurgica e aprirlo. Da questo punto in poi, utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati per tutte le procedure (in autoclave o immersione-sterilizzato). </li><li> Ritrarre i muscoli sopra le vertebre toraciche con la fascetta a piccoli muscoli. </li><li> Rimuovere i processi spinosi a livello toracico 8 (Th8) e Th9 con un rongeur osso da clipping cautamente piccoli pezzi di osso fino a quando le ossa vertebrali sono piatte. </li><li> Utilizzare pinze anatomiche per sollevare la colonna vertebrale al processo spinoso Th7 e utilizzare un rongeur per ritagliare piccoli pezzi di osso vertebrale da caudale a rostrale fino a quando una laminectomia viene eseguita a Th8 e Th9. Esporre la dura madre senza danneggiarlo rimuovendo accuratamente pochi e molto piccoli pezzi di osso vertebrale alla volta.</li><li> Bloccare la spina dorsale con 2 pinze di stabilizzazione a processi spinosi Th7 e D10, sollevare l&#39;animale a disaccoppiare i movimenti respiratori dalle vertebre. </li></ol></li><li> Completare Transezione midollo spinale a livello toracico 8/9 <ol><li> Sollevare la dura madre con una pinza sottile, tagliare la dura madre con le forbici occhio fini in direzione trasversale. </li><li> Tenere l&#39;estremità del taglio laterale della dura madre con una pinza sottile e inserire un gancio spinale nello spazio subarachnoidic tra la dura madre e arachnoidea. Evitare danni delle meningi, non pungendo nella pia o dura madre sia con una pinza o il gancio del midollo spinale. </li><li> Ruotare lentamente il gancio per posizionarlo lungo tutto il tessuto del midollo spinale, facendo attenzione a non pungere nella dura (pia è ancora intatto). </li><li> Sollevare il midollo spinale per circa 1 - 2 mm verso l&#39;alto, fino a quando uno spazio è visto dalla parte ventrale tra il tessuto del midollo spinale e dura. </li><li> Inserire le forbici occhi sottili nello spazio between dura e pia e tagliare il midollo spinale, mentre il gancio vertebrale viene lasciato in sede. </li><li> Sollevare i due monconi del midollo spinale con due pinze e garantire la completa visivamente transection. </li><li> Per gli animali di controllo-lesionati e animali con una lesione cronica, chiudere la dura dai punti staccati con monofilamento non assorbibili 9,0 discussioni. </li><li> Per le lesioni croniche seguire parte 1.6. </li></ol></li><li> Mms impianto <ol><li> Posizionare MMS sopra il sito della lesione con i due tubi che si trovano su ciascun lato laterale della vertebra e abbassarlo nella cavità lesione. </li><li> tubi sutura ai muscoli a lato della vertebra con non riassorbibile 4-0 filo per assicurare la stabilizzazione del MMS. Garantire una fissazione degli MMS utilizzando forcipe durante questa fase. </li><li> Rimuovere il pin del connettore MMS tagliando con un paio di forbici sottili. </li><li> Chiudere la dura sopra l&#39;MMS e suturare con 9,0 fili. </li><li> Attaccare un tubo alla pompa da vuoto, e sigillarel&#39;altra da bloccaggio. </li><li> Applicare una leggera pressione negativa per l&#39;MMS da una pompa a vuoto attraverso il tubo aperto, succhiando i ceppi del midollo spinale nel lume MMS. Applicare la pressione negativa per alcuni minuti (al massimo per 10 minuti) e monitorare da sensori (250 - 350 mbar). </li><li> Tagliare i tubi vicino alle MMS e rimuovere i tubi. Continuare con passo 1.6. </li></ol></li><li> Resezione di tessuto del midollo spinale Compresa la cicatrice lesione cronica alla settimana 5 dopo lesione iniziale <ol><li> Seguire i punti 1.1.1 - 1.1.5. </li><li> Identificare tessuto cicatriziale da comparsa marrone-giallo e del tessuto rigido sulla parte superiore del midollo spinale. Rimuovere delicatamente gli strati superficiali del tessuto cicatriziale tenendo con una pinza sottile e il taglio con le forbici sottili. Con questo metodo, riaprire il sito di laminectomia per esporre il tessuto che contiene l&#39;area lesioni del midollo spinale. Smettere di preparazione quando la sutura dura è identificato visivamente. </li><li> Bloccare la spina dorsale del 2 stabilizzazione morsetti a rotazioneprocessi OU TH7 e TH10, e quindi elevare l&#39;animale a disaccoppiare i movimenti respiratori dalle vertebre. </li><li> Con un piccolo righello cartone misurare l&#39;area del midollo spinale che deve essere asportato (lunghezza: 4 mm) e segnare i bordi di questo rispettiva area di tessuto con incisioni trasversali per consentire la successiva rimozione del tessuto. </li><li> Rimuovere tessuto cicatriziale tramite una combinazione di taglio e aspirazione. Estrarre il tessuto che è stato separato dal midollo spinale con le incisioni trasversali. Utilizzare una leggera aspirazione ogni volta che è sufficiente per consentire la rimozione del tessuto. Inoltre, ogni volta che la consistenza rigida del tessuto cicatriziale rende aspirazione dei tessuti troppo difficile, usare le forbici sottili per tagliare e rimuovere questo tessuto. </li><li> Inserire un pezzo (circa 5 mm x 5 mm x 5 mm cubo) di emostatico spugna di gelatina nella fessura del tessuto fino placa sanguinamento. La spugna di gelatina si stringe appena è imbevuto di liquido. </li></ol></li><li> IMPLAntazione di PEG 600 <ol><li> Preparare 1 ml di puro diluito PEG 600 iniettabile per riscaldamento a 37 ° C. </li><li> Rimuovere spugna di gelatina. </li><li> Inserire quantità sufficiente (circa 5 - 7 ml) del PEG nella fessura utilizzando una siringa da 10 microlitri o una pipetta 10 microlitri. </li><li> coprire con cura la zona con un pezzo (circa 5 mm x 4 mm) di sostituzione del sigillante / dura. </li><li> Fissare il sigillante circonda il tessuto muscolare con qualche goccia di colla tessuto. Posizionare il sigillante sulla parte superiore del gap resezione PEG-riempita. Per evitare lo slittamento del sigillante, utilizzare piccole gocce di colla tessuto per fissare gli angoli del sigillante al tessuto muscolare circostante. Nota: evitare la fuoriuscita del collante del tessuto sul tessuto del midollo spinale! </li></ol></li><li> Chiusura di tessuti e postoperatoria cura <ol><li> muscoli di sutura e strato di pelle per lo strato con punti staccati con intrecciati assorbibili 4-0 discussioni </li><li> Iniettare 2 × 2,5 ml di cloruro di sodio (NaCl[0.9%]) a 36 ° C sc per la reidratazione dopo l&#39;intervento. Una singola iniezione di 5 ml NaCl allungherebbe pelle dell&#39;animale e potrebbe causare danni inutili per l&#39;animale. Non lasciare incustoditi animale fino a quando viene ripreso piena coscienza. </li><li> Iniettare carprofen giornaliero (sc 5 mg / kg) per almeno 2 giorni dopo l&#39;intervento. Animal House in un&#39;unica gabbia durante i primi 2 giorni, poi in gruppi di 2-3. </li><li> Applicare trattamento antibiotico (somministrazione orale giornaliera dell&#39;enrofloxacina) per la prima settimana post-operatorio. </li><li> Fare vescica manuale svuotamento a due o tre volte al giorno da accarezzando delicatamente il ventre dell&#39;animale da rostrale a caudale. Fare attenzione a non spostare la colonna vertebrale dell&#39;animale e non sollevare l&#39;animale in coda. annullare manualmente la vescica dell&#39;animale completamente spinalized tutti i giorni durante il tempo di sopravvivenza generale. Bisogna fare attenzione a posizionare pellet cibo e bottiglie d&#39;acqua in una altezza che può essere raggiunto dagli animali senzain piedi sulle loro hindpaws. Anche se essere lesi nella funzione posteriori trimestre, gli animali si muovono ed esplorare le gabbie attivamente subito dopo l&#39;intervento chirurgico. Si raccomanda di tenere i topi in gruppi socievoli. </li><li> Per le lesioni croniche lasciare un tempo di sopravvivenza degli animali di cinque settimane prima resezione cicatrice. Seguire i punti 1.4. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramer, L. M., Ramer, M. S., Bradbury, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+function+after+spinal+cord+injury:+towards+clinical+translation+of+experimental+strategies.">Restoring function after spinal cord injury: towards clinical translation of experimental strategies.</a> The Lancet. Neurology. 13 (12), 1241-1256 (2014).</li><li>McDonald, J. W., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+the+damaged+spinal+cord:+a+summary+of+our+early+success+with+embryonic+stem+cell+transplantation+and+remyelination.">Repairing the damaged spinal cord: a summary of our early success with embryonic stem cell transplantation and remyelination.</a> Prog. Brain Res. 137, 299-309 (2002).</li><li>Yoon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+spinal+cord+injury+treatment+using+autologous+bone+marrow+cell+transplantation+and+bone+marrow+stimulation+with+granulocyte+macrophage-colony+stimulating+factor:+Phase+I/II+clinical+trial.">Complete spinal cord injury treatment using autologous bone marrow cell transplantation and bone marrow stimulation with granulocyte macrophage-colony stimulating factor: Phase I/II clinical trial.</a> Stem Cells. 25 (8), 2066-2073 (2007).</li><li>Brotchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+spinal+cord+tumor+resection.">Intrinsic spinal cord tumor resection.</a> Neurosurgery. 50 (5), 1059-1063 (2002).</li><li>Estrada, V., Tekinay, A., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+ECM+mimetics.">Neural ECM mimetics.</a> Prog. Brain Res. 214, 391-413 (2014).</li><li>Tetzlaff, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Review+of+Cellular+Transplantation+Therapies+for+Spinal+Cord+Injury.">A Systematic Review of Cellular Transplantation Therapies for Spinal Cord Injury.</a> J.Neurotrauma. 28 (8), 1611-1682 (2010).</li><li>Brazda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+microconnector+system+for+restoration+of+tissue+continuity+and+long-term+drug+application+into+the+injured+spinal+cord.">A mechanical microconnector system for restoration of tissue continuity and long-term drug application into the injured spinal cord.</a> Biomaterials. 34 (38), 10056-10064 (2013).</li><li>Estrada, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+significant+functional+improvement+in+chronic+severe+spinal+cord+injury+following+scar+resection+and+polyethylene+glycol+implantation.">Long-lasting significant functional improvement in chronic severe spinal cord injury following scar resection and polyethylene glycol implantation.</a> Neurobiol. Dis. 67, 165-179 (2014).</li><li>Rasouli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+glial+scar+following+spinal+cord+injury.">Resection of glial scar following spinal cord injury.</a> J.Orthop.Res. 27 (7), 931-936 (2009).</li><li>Schira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+clinical,+neuropathological+and+behavioural+recovery+from+acute+spinal+cord+trauma+by+transplantation+of+a+well-defined+somatic+stem+cell+from+human+umbilical+cord+blood.">Significant clinical, neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood.</a> Brain. 135, 431-446 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui due diversi approcci chirurgici vengono presentati per colmare le lacune del tessuto del midollo spinale dopo (1) transezione completa acuta e MMS impianto e (2) cronica lesione del midollo spinale e la rimozione della cicatrice fibrosa più PEG matrice impianto. Entrambe le strategie portano alla conservazione dei tessuti e la rigenerazione assonale nonché significativo locomotoria miglioramento funzionale degli animali trattati. Per MMS impianto un&#39;adeguata fissazione dei MMS all&#39;interno del midollo spina...

Una lesione traumatica al midollo spinale porta non solo alla perdita di assoni ma ulteriori risultati in difetti del tessuto che impediscono tutte le risposte rigenerativi (per una rassegna vedi 1,2). tessuto del midollo spinale spesso si perde attraverso la degenerazione secondaria che porta alla formazione di cisti o buchi dentro e intorno alla zona della lesione. La maggior parte degli interventi terapeutici sperimentali si concentrano su incompleti danni al midollo spinale come transezione, schiacciare o contusione lesioni parziali con un bordo residuo di tessuto sano. Per le lesioni complete come transections totali derivanti da incidenti traumatici o interventi chirurgici, come la resezione del tumore, sono disponibili solo le opzioni di trattamento molto limitate oggi 3,4. Dopo la completa resezione, la tensione meccanica dei risultati di tessuto del midollo retrazione ceppo, lasciando un piccolo spazio nel midollo spinale. La maggior parte delle strategie si concentrano su colmare questa lacuna con tessuti, cellule o matrici 5,6. Qui, una strategia differentesi presenta, cioè riadattamento dei monconi separati mediante un dispositivo microconnettore novel 7. Per riadattare i due monconi, forza meccanica deve essere applicata come una pressione leggermente negativa per raggiungere questo (Figura 1). Il sistema microconnettore meccanico (MMS) è un sistema multi-canale di polimetilmetacrilato (PMMA) con fori a forma di nido d&#39;ape (Figura 1A) e provvisto di un sistema tubo di uscita. Si è impiantato nella fessura tessuto risultante dalla completa transection midollo spinale nel ratto (Figura 1C). Un tubo può essere collegato ad una pompa a vuoto per applicare una pressione negativa alle MMS (Figura 1D). La pressione tira le sconnesse ceppi del midollo spinale nei fori a forma di nido d&#39;ape dei MMS, che hanno pareti microstrutturate per tenere il tessuto in posizione quando la pressione viene rilasciata (Figura 1B). Il tubo può essere lasciato intatto dopo l&#39;intervento e collegato ad un minipompa osmotica in ordineinfondere sostanze nel nucleo lesione (Figura 1E-F). Oltre ad una transezione acuta del midollo spinale altro tipo di risultati completi lesione da rimozione chirurgica di un tumore spinale o un solido cicatriziale lesione cronica che porta a grandi lacune del tessuto di alcuni millimetri, che non possono essere superati mediante i MMS finora. La maggior parte dei pazienti con trauma del midollo spinale soffrono di lesioni croniche. In questi pazienti, una cicatrice completamente sviluppato occupa il nucleo lesione. La rimozione chirurgica della cicatrice lesione è un concetto per il trattamento che è attualmente indagato dopo SCI sperimentale 8,9. Mentre la procedura di resezione stessa può essere eseguita senza causare notevoli danni aggiuntivi, il divario tessuto risultante deve essere colmato con una matrice adatta che consente e promuove la rigenerazione dei tessuti e, nel caso specifico delle lesioni del midollo spinale, la rigenerazione delle fibre nervose per mantenere e promuovere le funzioni dell&#39;apparato locomotore. Eratrovato che a basso peso molecolare polietilene glicole (PEG 600) è un materiale molto adatto per questo scopo. La sua mancanza di immunogenicità e la viscosità molto bassa consentono un&#39;agevole integrazione nel tessuto circostante. Inserimento del biopolimero solo promuove l&#39;invasione delle cellule benefiche, comprese le cellule endoteliali, cellule di Schwann periferiche e astrociti, e - molto importante - la rigenerazione e l&#39;allungamento degli assoni di discendente e ascendente tratti di fibre così come la loro ensheathment da mielina compact 8. Queste risposte rigenerativa sono stati trovati ad essere accompagnato da lunga durata miglioramenti funzionali. La combinazione della resezione di tessuto cicatriziale e conseguente impianto di PEG 600 presenta un mezzo sicuro e semplice, ma molto efficace per colmare notevoli difetti del tessuto del midollo spinale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG 600 Ph Eur&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck/VWR&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8,170,041,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelastypt gelatine sponge&#160;&#160;</td>
			<td>sanofi Aventis</td>
			<td>PZN-8789582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nescofilm Sealant&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2569.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rimadyl (Carpofen)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forene (Isoflurane)</td>
			<td>Abbvie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodan (skin disinfectant)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histoacryl (tissue glue)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm cup, straight&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16020-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two-in-one Micro Spatula - 12 cm&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #7 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11273-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5/45 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spinal cord hook&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10162-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp&#160;</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>EA016R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethicon Vicryl 4-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-retaining retractor&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skin clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluspray&#160;</td>
			<td>Selectavet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental strategies to bridge large tissue gaps in the injured spinal cord after acute and chronic lesion

Dopo una lesione del midollo spinale (SCI) si forma una cicatrice nel nucleo della lesione che ostacola la rigenerazione assonale. Colmare il luogo della ferita dopo un insulto al midollo spinale, resezioni tumorali, o difetti del tessuto derivanti da incidenti traumatici possono aiutare a facilitare la riparazione dei tessuti in generale, così come la crescita di rigenerazione delle fibre nervose nella e oltre la zona interessata. Due strategie terapeutiche sperimentali sono presentati: (1) l&#39;impianto di un nuovo dispositivo microconnettore in una toracico midollo spinale di ratto acutamente e completamente sezionato per riadattare reciso ceppi tessuto del midollo spinale, e (2) riempimento polietilenglicole del sito SIC nei ratti cronicamente lesionati dopo la resezione cicatrice. La lesione del midollo spinale cronica in questo modello è un transection del midollo spinale completo che è stato inflitto 5 settimane prima del trattamento. Entrambi i metodi hanno recentemente ottenuto risultati molto promettenti e promosso ricrescita assonale, benefica invasione cellulare e miglioramenti funzionaliin modelli di roditori di lesioni del midollo spinale. Il sistema microconnettore meccanico (MMS) è un sistema multi-canale composto da polimetilmetacrilato (PMMA) con un sistema di tubo di uscita per applicare pressione negativa per l&#39;MMS lume tirando così i monconi del midollo spinale nei fori a nido d&#39;ape-strutturato. Dopo il suo impianto nella fessura tessuto 1 millimetro il tessuto viene aspirata nel dispositivo. Inoltre, le pareti interne delle MMS sono microstrutturata per una migliore aderenza dei tessuti. Nel caso dell&#39;approccio cronica lesioni del midollo spinale, midollo spinale tessuto - compresa la zona della lesione cicatriziale-riempita - viene resecato su una superficie di 4 mm di lunghezza. Dopo resezione cicatriziale microchirurgico la cavità risultante è riempita con polietilene glicole (PEG 600), che è stato trovato fornire un eccellente substrato per invasione cellulare, rivascolarizzazione, rigenerazione assonale e anche remyelination compatta in vivo.

Tissue Conservazione, assonale ricrescita e beneficio funzionale di MMS impianto dopo acuta transezione completa del midollo spinale E &#39;dimostrato che l&#39;impianto acuta degli MMS stabilizzato i completamente sezionato ceppi midollo spinale e diminuito il restringimento del tessuto (Figura 2A contro B). Come visualizzato da Trichrome colorazione nelle sezioni sagittali, il verde colorazione del tessuto connettivo de...

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Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Strategie sperimentali per colmare grandi lacune tessuto nel midollo leso spinale dopo acuta e cronica Lesione

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

experimental-strategies-to-bridge-large-tissue-gaps-injured-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Heinrich-Heine-University Medical Center. Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Video: Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusion Imaging nel midollo spinale cervicale Rat

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Corsi di formazione basati su attività su un tapis roulant con midollo spinale feriti ratti Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...