Questo protocollo ELISA modificato consente la purificazione e la quantificazione accurata del CGRP nel plasma umano. È stato sottoposto ai necessari esperimenti di convalida e può servire a standardizzare le future metodologie di quantificazione. Questo protocollo offre i vantaggi di includere l'elaborazione del campione prima di una significativa degradazione della proteasi, la purificazione tramite estrazione in fase solida e la limitazione del legame non specifico mediante l'applicazione di tampone bloccante alle piastre di microtitolazione.
CGRP svolge un ruolo punitivo nella fisiopatologia dell'emicrania e forse un candidato per lo status di biomarcatore. È stato anche implicato nei processi patologici cardiologici, dermatologici, virali e persino correlati a COVID-19. Per iniziare, raccogliere 5 millilitri di sangue intero dalla vena antecubitale attraverso metodi di venipuntura standard in un tubo di EDTA vacutainer da 6 millilitri.
Per bloccare la lisi del peptide bersaglio, aggiungere 0,5 millilitri di inibitore competitivo della proteasi serina dell'aprotinina. Capovolgere il tubo 10 volte e conservarlo sul ghiaccio fino al passaggio successivo. Quindi centrifugare il tubo a 600 4g per quattro minuti a 4 gradi Celsius.
E trasferire la frazione plasmatica in una fiala crioplastica sterile rotonda da 2 millilitri. Conservare immediatamente il flaconcino criogenico a meno 80 gradi Celsius per un massimo di due settimane. Per estrarre il campione di plasma, posizionare una cartuccia di estrazione all'interno di una provetta conica da centrifuga da 15 millilitri.
Passare 5 millilitri di metanolo al 100%, quindi 10 millilitri di acqua ultrapura attraverso la cartuccia per attivarla. Il fluido verrà raccolto nel tubo mentre passa attraverso la cartuccia dal flusso guidato dalla gravità. Smaltire il liquido accumulato in eccesso per evitare che inghiottisca la cartuccia e assicurarsi che non si asciughi durante l'esperimento.
Diluire 250 microlitri di plasma in 750 microlitri di acido acetico al 4% e passarlo lentamente attraverso la cartuccia. Quindi lavare la cartuccia con 10 millilitri di acido acetico. Una volta rimosso il fluido in eccesso, trasferire la cartuccia in una nuova provetta conica da centrifuga da 15 millilitri.
Preparare 3 millilitri di soluzione di acido acetico metanolo per eluire il peptide correlato al gene della calcitonina o CGRP. Passare 1 millilitro di esso attraverso la cartuccia e attendere 25 minuti tra ogni eluizione. Dopo l'ultima eluizione, il tubo contiene 3 millilitri di eluente totale.
Trasferire 1 millilitro di eluente in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri e centrifugarlo in una mini centrifuga per un secondo per depositare l'eluente. Quindi asciugare il campione in una centrifuga sottovuoto a 1.400 giri / min e 4 gradi Celsius. Immediatamente prima del test, ricostituire il campione essiccato con un saggio immunoenzimatico scongelato o un tampone EIA.
Per il blocco delle piastre, aggiungere 250 microlitri di tampone bloccante della gelatina di pesce TBS a ciascun pozzetto. Posizionare un foglio di copertura sopra il piatto e incubare per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il foglio di copertura e svuotare la piastra capovolgendolo.
Quindi asciugare la piastra su un tovagliolo di carta per eliminare eventuali tracce di liquido e asciugarlo in una cappa a flusso laminare per 10 minuti. Una volta che la piastra è visibilmente asciutta, metterla in una busta di alluminio sigillata con una bustina essiccante in gel di silice. Conservare a meno 20 gradi Celsius per 24 ore.
Prima di eseguire il test, scongelare tutti i campioni e i reagenti preparati a temperatura ambiente. Per sciacquare i pozzetti della piastra di blocco, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio e lasciare riposare per 30 secondi. Quindi gettare il tampone di lavaggio e ripetere il risciacquo cinque volte.
Dopo l'ultimo risciacquo, asciugare la piastra come dimostrato in precedenza. Quindi, erogare 100 microlitri di tampone EIA ai due pozzetti di legame o NSB dedicati non specifici. Aggiungere 100 microlitri degli standard CGRP, seguiti dal campione ricostituito e dal controllo di qualità in duplicato in pozzetti appropriati.
Aggiungere 100 microlitri di tracciante CGRP a ciascun pozzetto, ad eccezione dei pozzetti vuoti. Infine, sigillare la piastra utilizzando un foglio di copertura trasparente, assicurandosi che i campioni e i reagenti non evaporino, e incubare la piastra per 16-20 ore a 4 gradi Celsius. Al termine del periodo di incubazione, preparare il reagente di Ellman secondo le istruzioni del produttore.
Una volta che la piastra è decantata, lavare ogni pozzetto tre volte come precedentemente dimostrato. Dopo l'ultimo risciacquo, agitare la piastra a 120 RPM per due minuti. Ancora una volta, sciacquare la piastra tre volte e asciugarla.
Picchiettare la piastra rovesciata fino a quando il liquido non viene rimosso visibilmente dai pozzetti. Quindi aggiungere 200 microlitri di reagente di Ellman in ciascun pozzetto tranne i pozzetti vuoti. Una volta coperta la piastra, avvolgerla in un foglio di alluminio per evitare qualsiasi esposizione alla luce e incubarla al buio a temperatura ambiente per un'ora prima di registrare l'assorbanza.
Il presente studio ha dimostrato che l'aggiunta della fase di blocco, i tassi di recupero in ciascun campione di picco CGRP erano all'interno dell'intervallo accettabile. Tuttavia, quando la fase di blocco è stata esclusa, il legame non specifico ha comportato tassi di recupero superiori al limite superiore del 125%È importante aggiungere aprotinina per contenere campioni di sangue poco dopo la raccolta per limitare la degradazione di CGRP. Inoltre, il buffer di blocco deve essere aggiunto alla piastra del microtitolo prima del test ELISA per ridurre ulteriormente il legame non specifico.
Quindi questo protocollo può essere utilizzato per esplorare la candidatura di CGRP come biomarcatore per l'emicrania vestibolare quantificando i livelli di CGRP nei pazienti plasmatici con emicrania ed emicrania vestibolare rispetto ai controlli.
