Gli autori ringraziano Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge per la lettura critica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge aiuto per scattare foto e Pauline Formaglio per l&#39;insegnamento imaging in vivo di sporozoite motilità nella pelle del mouse. Vorremmo anche ringraziare Marek Szatanik e il Centro di Produzione e infezione di Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) per l&#39;allevamento di zanzare. Questo studio è stato sostenuto dal Fondo AXA Ricerca e fondi dal Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Biologia Integrativa di Emerging Infectious Diseases&quot; (Grant no. ANR-10-LabX-62-IBEID).

<html> Tutte le procedure sono state approvate dal comitato dell&#39;Istituto Pasteur e dal Comitato Etico locale sulla sperimentazione animale (comitato etico IDF-Paris 1, Paris, France; numero di contratto: 2.012-0.015) ed eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti applicabili. 1. Materiali e reagenti <ol><li> Utilizzare femmina Anopheles zanzare stephensi (ceppo Sda500) che si nutrono di topi infetti 3-5 giorni dopo la nascita e posteriore come descritto in precedenza 21. </li><li> Utilizzare i parassiti Plasmodium berghei ANKA clone che esprime il gene Green Fluorescent Protein (GFP) sotto il controllo del costitutiva Heat Shock Protein 70 (HSP70) promotore. Questo produce fluorescenza durante tutto il ciclo di vita del parassita 22. </li><li> topi C57BL / 6JRj uso femminile (7 settimane di età). Nota: Tutti i reagenti utilizzati nel protocollo descritto sono elencati nella T in grado di Materiali / attrezzature. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radiation-attenuato sporozoite isolamento dalla zanzara ghiandole salivari <ol><li> Tra 18-25 giorni dopo il pasto di sangue infetto, raccogliere e freddo anestetizzare le zanzare in una provetta da 15 ml su ghiaccio come descritto in precedenza 21. trasferirli attenzione su un piatto Petri invertendo la provetta. Mantenere gli insetti su ghiaccio ed esporre le zanzare ad una dose 12 krad di γ- o x-irradiazione. </li><li> Isolare sporozoiti attenuati da irradiati ghiandole salivari delle zanzare come descritto in precedenza 21. Raccogliere ghiandole salivari infetti in un piccolo volume (circa 15 ml) di tampone fosfato salina di 1x Dulbecco (DPBS) su ghiaccio e delicatamente schiacciare loro di rilasciare sporozoiti. NOTA: L&#39;iniezione di una sospensione parassita altamente concentrata in un piccolo volume essere critico, è quindi essenziale per raccogliere un numero sufficiente di ghiandole salivari da un elevato numero di preselezionati zanzare ben infette, come dimostra il loro robusta espressioneverde-fluorescenza. </li><li> Filtrare la sospensione sporozoite attraverso un tappo colino cella 35 micron atto ad un&#39;adesione 1,5 tubo partire ml microcentrifuga per eliminare grumi e detriti zanzara. </li><li> Contare il numero totale di sporozoiti isolate come precedentemente descritto 21 e regolare la concentrazione della sospensione parassita freddo 1x DPBS avere 83.000 sporozoiti / microlitro. Conservare i parassiti sul ghiaccio, pur continuando i prossimi passi. </li><li> Raccogliere il numero equivalente di ghiandole salivari di zanzare infette che verranno utilizzati come controllo negativo e processano il campione come descritto nei punti 2.2 e 2.3. Diluire il campione come indicato sopra per ottenere analoga concentrazione di estratti ghiandole salivari nella sospensione. NOTA: sporozoiti possono essere memorizzati su ghiaccio per un massimo di 2 ore. Tuttavia, idealmente vengono iniettati nel giro di un&#39;ora dopo la pigiatura delle ghiandole salivari. </li></ol> 3. L&#39;iniezione di sporozoiti nella Dermal Layer del Ear <ol><li> Anestetizzare animali mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) della miscela. Attendere 5-8 minuti per il mouse di essere in uno stato di incoscienza e applicare pomata oftalmica per gli occhi per evitare l&#39;essiccazione della cornea. Valutare la profondità di anestesia eseguendo un pizzico punta dolce su entrambi i piedi posteriori. NOTA: La dose di anestesia dura meno di 20 minuti, in modo che i prossimi passi deve essere fatto in fretta. </li><li> Stabilizzare il padiglione auricolare del mouse fissando il lato ventrale con nastro adesivo trasparente precedentemente posto sotto uno stereomicroscopio (Figura 1A). Premere delicatamente l&#39;orecchio per evitare danni del sistema vascolare. </li><li> Caricare un / 35 gauge smussato 10 microlitri siringa con 0,6 ml di parassiti risospese 10. </li><li> Consegnare la sospensione sporozoite in 4 siti di iniezione (0,15 ml per sito) inserendo con cautela l&#39;ago sul lato dorsale dell&#39;orecchio (Figura 1A), sotto l&#39;epidermide, conlo smusso up, avendo cura di evitare i vasi sanguigni. Lasciare l&#39;ago di rimanere nel derma per pochi secondi per impedire il riflusso del injectant prima di rimuoverla. Osservare una papula caratteristico ciascun sito di iniezione al termine della procedura (Figura 1B e 1C). </li><li> Dopo l&#39;iniezione, rimuovere con attenzione l&#39;orecchio dal nastro. </li><li> Iniettare dell&#39;orecchio controlaterale con la stessa dose di parassiti seguendo la procedura 3,2-3,4. </li><li> Iniettare 2 topi supplementare sia con 0,6 ml di 1x DPBS o 0,6 ml di 1x DPBS + estratto di ghiandola salivare dalle zanzare infettate per valutare la risposta infiammatoria mediata dalla sola iniezione e la deposizione di materiale zanzare nel derma. </li><li> Monitorare il recupero del mouse dall&#39;anestesia prima di metterlo nuovamente dentro la gabbia. NOTA: La deposizione sporozoite corretta nella pelle può essere monitorato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2A e 2B), Il mouse che viene preparato come descritto previsously 23. </li></ol> 4. Pelle e drenante dissezione linfonodale <ol><li> Preparare mezzo standard (SM) come segue: Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) supplementato con 400 U / ml di collagenasi e 50 ug / ml deossiribonucleasi (DNasi) . </li><li> Preparare due 6 piastre di coltura dei tessuti ben a fondo piatto sul ghiaccio con 4,5 ml di SM + 70 micron cella filtro per bene per i campioni DLN (tavola A) e 4,5 ml di SM per bene per i campioni di pelle (piastra B). </li><li> Al punto di tempo desiderato dopo l&#39;inoculazione sporozoite, profondamente anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) miscela prima dislocazione cervicale. Assicurarsi che il mouse dimostra segni di morte clinica e iniziare subito la dissezione. NOTA: La cinetica di reclutamento delle cellule mieloidi possono essere esaminate in tempi diversi dopo injessione (cioè 2 ore, 4 ore e 24 ore come descritto in precedenza 14). </li><li> Disinfettare l&#39;orecchio inoculato e la regione del collo corrispondente con il 70% di etanolo per ridurre la possibilità di contaminazione. </li><li> Utilizzando forbici e pinze sterili, in modo asettico sezionare il prossimale auricolare DLN senza raccogliere il grasso circostante. Eseguire una prima incisione nel solco giugulo-carotidian e rimuovere i peli dal campo operatorio. Stretch l&#39;incisione con 2 pinze per esporre il DLN che appare grigio rispetto al tessuto circostante. </li><li> Pizzicare i tessuti connettivi attenzione sulla parte superiore del DLN con una pinza per facilitarne la rimozione. Estrarre il DLN mettendo una pinza sotto il tessuto linfoide (Figura 3A e 3B). Posizionare il DLN in un pozzo contenente colino cella 4,5 ml SM + 70 micron (tavola A). </li><li> Raccolto l&#39;intero orecchio inoculato usando forbici affilate sterili e pinze (Figura 4A). Separmangiato gli aspetti dorsale e ventrale dell&#39;orecchio da pizzicare e distanziare il taglio termina con due pinze (Figura 4B - 4E). Mettetele in un pozzo contenente 4,5 ml di SM (tavola B) assicurandosi che entrambi i tessuti sono completamente immersi nel mezzo. NOTA: Al fine di migliorare l&#39;affidabilità dell&#39;esperimento e aumentare il numero di cellule di interesse, pool 2 iniettato orecchie o 2 dLNs dallo stesso animale per campione. </li><li> Raccolta e processo in parallelo le orecchie e dLNs di topi inoculati sia con 1x DPBS o estratti delle ghiandole salivari. Include 2 ulteriori campioni per le orecchie e linfonodali raccolte da un mouse ingenuo per i controlli di compensazione colorazione negativa e singole. </li></ol> 5. isolamento delle cellule da linfonodi <ol><li> Incubare i linfonodi (tavola A) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 15 minuti sotto agitazione. Aggiungere etilendiamminotetraacetico 10 mM finale (EDTA) per pozzetto per neutralizzare collagenasi e DNase actività. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio. </li><li> Dissociare linfonodi utilizzando l&#39;estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi. </li><li> Risciacquare il filtro delle cellule due volte con 500 ml DPBS 1x + 2% di siero fetale bovino (FBS) + 2mM EDTA. Trasferire intero volume del pozzetto in una provetta da 15 ml. </li><li> Lavare il ben due volte con 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 15 ml. Mantenere i tubi in ghiaccio. </li></ol> 6. isolamento delle cellule dalla pelle del Ear <ol><li> Incubare i volantini per le orecchie (tavola B) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 1 ora sotto agitazione. NOTA: Dopo 20 min di incubazione, tagliare i volantini per le orecchie con le forbici in piccoli pezzi per facilitare la digestione dei tessuti e mettere il campione di nuovo in incubatrice per il restante 40 min. Singole cellule possono essere osservati in mezzo al termine del tempo di incubazione. </li><li> Aggiungere 10 mM finale<html> EDTA per pozzetto per neutralizzare le attività collagenasi e DNasi. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio. </li><li> Trasferire i frammenti di tessuto dell&#39;orecchio e l&#39;intero volume del mezzo in un nuovo pozzo contenente un filtro cella 70 micron con una pipetta 1 ml. Tagliare 2 a 3 mm dall&#39;estremità della punta per raccogliere i frammenti di tessuto dell&#39;orecchio più facilmente. </li><li> Dissociare frammenti di tessuto dell&#39;orecchio con l&#39;estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi. </li><li> Lavare le cellule due volte con filtri 500 DPBS microlitri 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Trasferire l&#39;intero volume del pozzo in 50 ml-tubo attraverso un colino cella 70 micron. </li><li> Risciacquare pozzo con 500 microlitri 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 50 ml. Mantenere la provetta in ghiaccio. NOTA: Le diverse fasi di isolare cellule totali dalla pelle e tessuti DLN sono riassunti nella Figura 5. </li></ol>title &quot;&gt; 7. Conte e la vitalità delle cellule raccolte <ol><li> Centrifugare la pelle e campioni DLN per 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Raccogliere un piccolo volume di ogni campione per contare il numero totale di cellule isolate dalla pelle e DLN con un emocitometro. Aggiungere 0,04% trypan blu per determinare la vitalità cellulare. </li></ol> 8. Blocco di non antigene-specifica Binding <ol><li> Aggiungere 10 ug / ml di CD16 non marcato / CD32 Fc-block anticorpi. Incubare 20 minuti a 4 ° C (può andare più). </li><li> Aggiungere 2 ml di freddo 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugare il campione per 5 minuti a 450 xga 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e mantenere i campioni in ghiaccio. </li></ol> 9. macchie sulla pelle e le cellule mieloidi Linfonodo <ol><li> Incubare sci precedentemente bloccaton e DLN isolato cellule con Live / inseguitore Morto (cioè 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole o DAPI), anti-CD45 e anti-CD11b anticorpi specifici. NOTE: Al fine di arricchire le sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse, in particolare quelli rari, le cellule e linfociti CD45 + possono essere, rispettivamente, purificati dalla pelle o impoverito dal DLN dal tallone magnetica ordinamento delle cellule di facilitazione. Poiché la maggior parte delle cellule isolate dal DLN sono CD45 +, l&#39;uso di anti-CD45 non è obbligatoria. Altri marcatori possono essere inclusi per identificare sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse dalla strategia positiva o negativa-gating. In questo protocollo, le cellule mieloidi reclutate nel DLN sono stati arricchiti escludendo cellule CD8α + (tutto il compartimento di cellule T può essere bersaglio di utilizzare anti-CD3 anticorpo specifico). </li><li> Incubare 30 minuti a 4 ° C al buio. Aggiungere 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifugare il campione 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il supernatant. Ripetere la fase di lavaggio due volte. </li><li> Risospendere i campioni con 300 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Trasferire l&#39;intero volume in un tubo FACS attraverso un colino cella 35 micron. Lavare il filtro con 100 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Eseguire le cellule colorate in un citometro di flusso. Porta di vivere celle singole (DAPI -, FSC-W) di ​​escludere le cellule morte e doppiette. Trama CD45 + CD11b + eventi per la pelle (figura 6A) e (CD45 +) CD8α - CD11b + eventi per il DLN (Figura 6B). </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nella prospettiva della vaccinazione su larga scala degli esseri umani utilizzando un intero vaccino contro la malaria sporozoite, una delle principali sfide da superare è quello di sviluppare percorsi e metodi di somministrazione parassita ottimizzati per garantire l&#39;immunizzazione e la protezione 24,25 successo. Negli esseri umani, la valutazione della efficacia protettiva mediata da parassiti vivi attenuati (LAP) sono seguite zanzara naturale morde 2, nonché intradermica, sottocutanea <sup...

La malaria è una delle più letali malattie infettive in tutto il mondo, uccidendo più di mezzo milione di persone all&#39;anno. Infezione da Plasmodium, l&#39;agente causale della malattia, inizia una fase di pre-eritrocitaria (PE). Durante questa fase, sporozoiti iniettati nella pelle ospitante da una femmina anopheline zanzara raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno e si differenziano epatociti all&#39;interno nelle forme parassiti che infettano i globuli rossi e causano i sintomi della malattia. Le fasi PE di Plasmodium rappresentano un bersaglio privilegiato per la vaccinazione anti-malaria. In effetti, i vaccini vivi attenuati contro queste fasi, come la radiazione di attenuazione sporozoiti (RAS), parassiti geneticamente arrestati (GAP) o chemioprofilassi e sporozoiti (CPS) hanno dimostrato la loro capacità di proteggere sia roditori e ospiti umani 1-9. Nel modello di roditore, la maggior parte degli studi di vaccinazione sono condotti utilizzando l&#39;immunizzazione per via endovenosa, Che è lo standard in termini di efficacia protettiva. Tuttavia, la descrizione di una fase pelle e l&#39;importanza del linfonodo pelle associata drenante (DLN) nell&#39;elicitazione protezione ha cambiato la nostra percezione della fase PE e sottolineato l&#39;importanza della somministrazione intradermica di iniezione. L&#39;imaging intravitale di P. sporozoiti berghei iniettati nella pelle dei roditori ha dimostrato che solo ~ 25% dell&#39;inoculo raggiunge il fegato attraverso il flusso sanguigno. Il restante 75% ~ distribuisce tra prossimale DLN (~ 15%) e la pelle (~ 50%) 10,11, dove una piccola percentuale può trasformare e rimanere in vita per settimane all&#39;interno delle cellule della pelle 12,13. Inoltre, studi successivi descrivono che l&#39;istituzione di un&#39;efficace immunità protettiva dopo la vaccinazione intradermica avviene principalmente nella pelle-DLN, in cui si attivano specifiche cellule parassita T CD8 +, e solo marginalmente nella milza o del fegato-dLNs 14,15. Mentrela maggior parte degli studi si sono concentrati sulla caratterizzazione delle cellule effettrici implicati nella creazione di risposta immunitaria protettiva, e tanto meno si sa circa il destino dei parassiti vivi attenuati iniettati nella pelle, in particolare le loro interazioni con il sistema immunitario innato. In particolare, la caratterizzazione di cellule presentanti l&#39;antigene coinvolti nella parassita antigene captazione, l&#39;elaborazione e la presentazione di cellule T CD8 + è di importanza critica, sapendo che l&#39;acquisizione di antigene PE può avvenire sia nella pelle e scomparti DLN. Precedenti studi di imaging intravitale descritto un afflusso iniziale di cellule positive fluorescenza brillante Lys-GFP nella pelle in seguito ad un morso di zanzara infettiva 16 mentre i primi interazioni tra sporozoiti e cellule dendritiche sono stati osservati nel DLN 10,17. Più recentemente, è stato riportato che sporozoiti inoculati nella pelle dalle zanzare aumenta la motilità sia delle cellule T dendritiche e regolamentari nella pelletopi, mentre è stata osservata una serie diminuzione di cellule presentanti l&#39;antigene nel DLN 18. Si è voluto identificare e quantificare più precisamente i sottoinsiemi di leucociti reclutati nella pelle e corrispondenti DLN nonché coloro che interagiscono con il parassita dopo iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS 19. In questo contesto, abbiamo isolato le cellule mieloidi (CD45 + CD11b +) da entrambi i tessuti e caratterizzato sottopopolazioni di interesse da parte di più = flusso parametrico citometria. Coerentemente con la risposta immunitaria descritto nella fase iniziale della Leishmania importante infezione della pelle 20, la risposta dell&#39;ospite principale per sporozoite iniezione è costituito da una assunzione successiva di neutrofili polimorfonucleati (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguita da monociti infiammatorie (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) che sono identificate in base ad DifferentiAl espressione dei marcatori di superficie Ly6G e Ly6C. Descriviamo qui un protocollo per isolare cellule mieloidi dalla pelle del mouse e DLN dopo l&#39;iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS estratti da infetti ghiandole salivari delle zanzare. iniezioni intradermiche riproducibili e lavorazione dei tessuti sono passi fondamentali per quantificare i cambiamenti fenotipici di infiltrazione popolazione di cellule all&#39;interno dei tessuti infetti. L&#39;approccio seguito dettagliato fornisce un test affidabile per valutare la pelle e la risposta infiammatoria DLN al Plasmodium parassita e può essere esteso a vari sistemi sperimentali.

<table><tbody><tr><td>Ketamine: Imalgene&amp;reg; 1,000</td><td>Merial</td><td>-</td><td>50 mg/kg: prior sporozoite injection

125 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>Xylazine: Rompun&amp;reg; 2%</td><td>Bayer</td><td>-</td><td>5 mg/kg: prior sporozoite injection

12.5 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Omnican&amp;reg; 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U.</td><td>B. Braun Medical&amp;nbsp;</td><td>9151125</td><td>-</td></tr><tr><td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &amp;ndash; Flat Bottom</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>-</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td>-</td></tr><tr><td>2 ml syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-02S</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352098</td><td>-</td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 &amp;micro;m Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td>-</td></tr><tr><td>DPBS 1x CaCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt; and MgCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt;-free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>-</td></tr><tr><td>DMEM 1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>-</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM or 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypan blue Stain (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Dilution 1:10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &amp;micro;g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPure&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; grade</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &amp;micro;g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&amp;alpha; (5H10 clone)</td><td>Life Technologies</td><td>MCD0830</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&amp;nbsp;</td><td>Janvier Laboratories</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

Malaria inizia quando la fase sporozoite di Plasmodium è inoculata in pelle di un mammifero ospite attraverso una puntura di zanzara. Il parassita altamente mobili non raggiunge solo il fegato per invadere epatociti e la trasformazione in forma eritrociti-infettiva. Si migra anche nella pelle e per il linfonodo drenante prossimale sito di iniezione, dove può essere riconosciuto e degradato da residenti e / o di cellule mieloidi reclutate. L&#39;imaging intravitale ha riferito l&#39;assunzione precoce di fluorescenza brillante Lys-GFP leucociti positivi nella pelle e le interazioni tra sporozoiti e CD11c + cellule del linfonodo drenante. Presentiamo qui una procedura efficiente per recuperare, identificare e contare i sottoinsiemi di cellule mieloidi che vengono reclutati per la pelle del mouse e drenanti linfonodi dopo l&#39;iniezione intradermica di immunizzare dosi di sporozoites in un modello murino. La caratterizzazione fenotipica usando flusso multi-parametrica fornisce citometriaun test affidabile per valutare i primi cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium.

Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;ago-siringa per iniezione di immunizzare dosi di P. berghei sporozoiti nella pelle del mouse induce un reclutamento successiva di neutrofili polimorfonucleati seguite da monociti infiammatorie della pelle e DLN 19. La Sezione protocollo descritto in dettaglio la procedura utilizzata per isolare con successo cellule mieloidi dal vivo da entrambi i tessuti seguenti iniezioni multiple di gran numero di sporozoiti nel derma dell&#...

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Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.1K Views.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

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Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l&#39;infezione con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting cells. When the skin encounters invading pathogens, different cutaneous DCs initiate a distinct T cell immune response to protect the body. Among the invading pathogens, fungal infection specifically drives a protective interleukin-17-producing Th17 immune response. A protocol was developed to efficiently differentiate Th17 cells by intradermal Candida albicans infection to investigate a subset of cutaneous DCs responsible for inducing Th17 immunity. Flow cytometry and gene expression analyses revealed a prominent induction of Th17 immune response in skin-draining lymph nodes and infected skin. Using diphtheria toxin-induced DC subset-depleting mouse strains, CD301b+ dermal DCs were found to be responsible for mounting optimal Th17 differentiation in this model. Thus, this protocol provides a valuable method to study in vivo function of differential subsets of cutaneous DCs to determine Th17 immunity against deep skin fungal infection.

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Here, we demonstrate the in vivo function of cutaneous dendritic cell subsets in Th17 immunity of deep dermal Candida albicans infection.

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting ...

Intradermal Immunization with Live Attenuated Sporozoites in a Mouse Model

Source: Mac-Daniel, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53796">Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay for immunizing a mouse model with live attenuated sporozoites. The radiation-attenuated Plasmodium sporozoites are injected into the dorsal side of the mouse&#39;s ear. After injections at multiple locations on both ears, the mouse is allowed to recover.

Immunizzazione intradermica con sporozoiti vivi attenuati in un modello murino

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l'analisi fenotipica e

Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l'isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l'infezione con

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Immunizzazione intradermica con sporozoiti vivi attenuati in un modello murino