Questa ricerca è stata sostenuta dal Naval Medical Research Center, la ricerca unità di lavoro 6000.RAD1.J.A0310. Le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente la politica ufficiale o la posizione del Dipartimento della Marina, Dipartimento della Difesa, o il governo degli Stati Uniti. Wei-Mei Ching è un dipendente del governo degli Stati Uniti. Questo lavoro è stato preparato come parte dei suoi doveri d&#39;ufficio. Titolo 17 USC §105 prevede che &#39;La protezione del copyright sotto questo titolo non è disponibile per qualsiasi lavoro del governo degli Stati Uniti.&#39; Titolo 17 USC §101 definisce un lavoro del governo degli Stati Uniti come un lavoro preparato dal membro del servizio militare o dipendente del governo degli Stati Uniti, come parte delle funzioni ufficiali di quella persona.

1. Preparare plasmidi DNA diluizioni come standard per LAMP Reazione <ol><li> Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica (OD) a 260 nm per determinare il plasmide (contenente gene target IS1111a di C. burnetii RSA 493) concentrazione di DNA. Un OD 260 di 1 equivale a 50 mg / mL di DNA. </li><li> Convertire la quantità di DNA plasmide nel numero di copie. Poiché la dimensione del plasmide è 6.330 bp, il peso molecolare di questo plasmide è 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). La concentrazione di DNA del plasmide è 34,2 ng / ml (come determinato dal punto 1.1). 1 ml di questo campione di DNA contiene 34,2 ng di DNA plasmide, pari a 5 x 10 9 copie (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6,02 x 10 23) di DNA. </li><li> Aggiungere 10 ml di DNA plasmidico (5 x 10 9 copie / ml) a 90 ml di acqua per una diluizione di 10 volte per fare un campione di DNA di 5 x 10 8 copie / ml. </li><li> Ripetere passaggio 1.3 per preparare campioni di DNA di 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 e 5 x 10 0 copie / ul. </li></ol> 2. Preparare modello di DNA da campioni per la lampada di reazione <ol><li> Eseguire l&#39;estrazione del DNA da campioni di plasma umano utilizzando un kit mini DNA commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare un totale di 200 campioni microlitri per l&#39;estrazione ed eluire DNA estratto in un volume di 20 ml. </li></ol> 3. Preparare 2x Buffer LAMP Reazione <ol><li> Mescolare 200 ml di 10x Pol Buffer, 320 ml di 5 M trimetilglicina, 12 ml di 1 M MgSO 4, 280 ml ​​di miscela dNTP (10 mm ciascuno) e 188 microlitri di acqua per fare 1 ml di tampone 2x LAMP. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi. </li></ol> 4. Eseguire lampada standard di reazione <ol><li> Mescolare 12,5 ml di 2x LATampone MP (come preparato al punto 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimetilglicina, 1.4 mM miscela dNTP), 1,2 ml di miscela di primer, 1 ml di polimerasi Bst DNA (8 U / ml), e 5,3 l di acqua per fare miscela di reazione (20 ml) in un tubo di 0,2 ml PCR. </li><li> Aggiungere 5 ml di DNA (dal punto 1 o 2) alla miscela di reazione di 20 microlitri e mescolare bene. </li><li> Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento. Questa è la temperatura di reazione ottimale determinata in precedenza. </li><li> Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione. </li><li> Carico 5 microlitri di prodotti di reazione di un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell&#39;acido nucleico. </li><li> Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE. </li><li> Visualizzare i risultati di raggi UV. </li></ol> 5. Eseguire Reazione lampada con ricostituitoreagenti <ol><li> Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO 4, 667.5 ml di acqua per fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi. </li><li> Rimuovere i tubi che contengono i reagenti liofilizzati dal sacchetto di alluminio sigillato. Non utilizzare i tubi se la borsa foglio di alluminio non è sigillato o se è danneggiato. </li><li> Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione in ciascuna provetta per risospendere reagenti liofilizzati. </li><li> Mescolare pipettando tampone su e giù per 5 volte. Date un&#39;occhiata per assicurarsi che i reagenti liofilizzati sono completamente ri-sospesi. La polvere bianca dovrebbe scomparire nel tubo. </li><li> Aggiungere 5 ml di DNA stampo (dal punto 1 o 2) per i reagenti ricostituiti e mescolare bene. </li><li> Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento. </li><li> Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione. </li><li> Carico 5 ml di reazioneprodotti ad un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell&#39;acido nucleico. </li><li> Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE. </li><li> Visualizzare i risultati di raggi UV. </li></ol> 6. Eseguire LAMP Reazione con tampone di ricostituzione contenenti HNB o fluorescente intercalante Dye <ol><li> Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO 4, 7,5 ml di 20 mm HNB (o 12,5 ml di 100x fluorescente intercalante colorante) e 660 ml (o 655 ml) di acqua a fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi. </li><li> Utilizzare il buffer ricostituito preparato nella sezione 6 di ripetere i passi 5.2 - 5.6. </li><li> Visualizzare i risultati ad occhio nudo (reazione contenente HNB) o una luce UV (reazione contenente colorante intercalante fluorescente). </li></ol> 7. Eseguire in tempo reale reazione lampada con tubo Scanner <ol><li> Aggiungere 5 microlitri DNA alla reconstitutreagenti ED contenenti colorante fluorescente intercalante, chiudere il tubo e inserirlo allo scanner tubo. </li><li> Impostare temperatura di incubazione a 60 ° C. Misurare la fluorescenza a 520 nm per 60 min. </li></ol>

<ol>
	<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States,+2013:+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group.">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li><li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis.">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li><li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li><li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li><li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia.">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li><li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification.">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li><li>Huber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+targeting+the+47-kDa+gene+of+Orientia+tsutsugamushi.:+A+rapid+and+sensitive+alternative+to+real-time+PCR.">Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR.</a> J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).</li><li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li><li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation.">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li><li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+(LAMP)+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates.">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li><li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii.">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In precedenza, abbiamo sviluppato un saggio LAMP sensibile e specifico mira l&#39;elemento di inserimento IS1111a 14. L&#39;elemento IS1111 è stato scelto perché è altamente conservata tra i diversi ceppi di C. burnetii e il suo alto numero di copie (7-110) nei batteri (Klee 2006). I nostri risultati hanno mostrato che LAMP può rilevare circa 25 copie dell&#39;elemento IS1111, che può correlare il meno una copia cromosomale di Coxiella DNA. In questo studio, p...

Il piccolo batterio Gram-negativi Coxiella burnetii è l&#39;agente eziologico della febbre Q, che è una zoonosi in tutto il mondo. A causa della distribuzione a livello mondiale di febbre Q e l&#39;alta infettività di C. burnetii, militari e civili personale statunitense dispiegate all&#39;estero sono a rischio di infezione nelle zone endemiche. La febbre Q si manifesta in due forme: infezioni acute e croniche. Acuta febbre Q si presenta con sintomi simil-influenzali, l&#39;epatite, o polmonite, ed è di solito una malattia autolimitante con un basso tasso di mortalità. Cronica febbre Q, mentre meno diffuso, si traduce spesso in endocardite, che ha un tasso di mortalità molto più alto se non trattata 1,2. Pertanto, la diagnosi precoce per guidare un trattamento appropriato è fondamentale per la cura del paziente. Reazione a catena della polimerasi (PCR) e in tempo reale PCR quantitativa (qPCR) test sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Sia PCR e qPCR sono costose e spesso non facilmente disponibili in aree con risorse limitate per il lavoro di routine. Originariamente descritto da Notomi 6, l&#39;amplificazione isotermica loop-mediata (LAMP) offre un metodo alternativo amplificazione del DNA. LAMP utilizza polimerasi Bst DNA per la sintesi del DNA filone spostamento lungo con i set di primer appositamente progettati che riconoscono almeno sei regioni indipendenti del gene bersaglio. Il vantaggio più significativo di LAMP è che l&#39;amplificazione avviene in condizioni isoterme. Pertanto, è necessario solo un bagno d&#39;acqua, blocco di riscaldamento o di un incubatore. Questo metodo è stato utilizzato per rilevare diversi patogeni rickettsie 7-9. Visualizzazione dei prodotti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel è il metodo più accurato che può differenziare i veri positivi da falsi positivi a causa di amplificazione non specifica. Tuttavia le procedure necessarie per elettroforesi su gel non sono pratici per ar risorse limitateEAS. Diversi metodi alternativi sono stati sviluppati per rilevare i prodotti di reazione. Queste alternative, come torbidità derivante dalla formazione di magnesio pirofosfato 10 o utilizzando un colorante intercalante fluorescente da visualizzare sotto luce UV 11,12 sono più favorevoli di esecuzione di un gel. I reagenti LAMP erano stabile per un mese se conservato a 25 ° C e 37 ° C, che sono temperature ambientali nei paesi tropicali e sub-tropicali, dove la febbre Q è endemica 13. Un test LAMP stato sviluppato nel nostro laboratorio per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di plasma 14. Qui si descrive un protocollo semplice per la preparazione della miscela di reazione LAMP dai reagenti liofilizzati. I reagenti liofilizzati sono stabili per un mese se conservati a RT. Quando combinato con un metodo di visualizzazione facile, questo è un metodo ideale da utilizzare per la rilevazione C. burnetii in un ambiente risorse limitate.

<table><tbody><tr><td>LAMP primers</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, salt free</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Bst DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 units/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycine</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel loading buffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualize products in tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualize products in gels</td></tr><tr><td>Lyophilized reagents</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol blue</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant tube scanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>real-time detection</td></tr></tbody></table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Coxiella burnetii, l&#39;agente che causa la febbre Q, è un batterio intracellulare obbligato. Saggi diagnostici basati sulla PCR sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici. PCR richiede attrezzature specializzate ed estesa formazione degli utenti finali, e quindi non è adatto per il lavoro di routine specialmente in una zona risorse limitate. Abbiamo sviluppato un saggio loop-mediata di amplificazione isotermica (LAMP) per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di pazienti. Questo metodo viene effettuata ad una sola temperatura di circa 60 ° C in un bagnomaria o riscaldamento. La sensibilità di questo test LAMP è molto simile a PCR con un limite di rilevazione di circa 25 copie per reazione. La relazione descrive la preparazione della reazione con reagenti liofilizzati e visualizzazione dei risultati usando blu di idrossinaftolo (HNB) o una lampada UV con colorante fluorescente intercalante nella reazione. I reagenti LAMP erano lyophilized e conservato a temperatura ambiente (RT) per un mese senza perdita di sensibilità di rilevazione. Questo test è particolarmente robusta LAMP perché la preparazione della miscela di reazione non comporta complessi passaggi. Questo metodo è ideale per l&#39;utilizzo in ambienti con risorse limitate, dove la febbre Q è endemica.

I reagenti LAMP liofilizzati all&#39;interno del tubo 0,2 ml contiene polimerasi Bst DNA, primer, e dNTP. 20 microlitri di tampone di ricostituzione è usato per risospendere i reagenti liofilizzati. La Figura 1 mostra i risultati di reazione LAMP su gel di agarosio con reagenti appena preparati e reagenti liofilizzati. Il reagente liofilizzato non riduce la sua attività. Reazioni LAMP preparati da entrambi i reagenti in grado di rilevare 25 copie del DNA stamp...

Watch this Scientific Journal Video about The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii at JoVE.com

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

10.5K Views.  Naval Medical Research Center. We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Video: The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Ricerca

Ambiente

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Immunologia e infezioni

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a multitude of samples. It has been extensively used in many research areas and achieved industrial application in fields such as human diagnostics and trait selection in crops of genetically modified organisms (GMO) crops. However, qPCR is not an error-proof technique. Mixing all reagents into a single master mix subsequently distributed onto 96 wells of a regular qPCR plate might lead to operator mistakes such as incorrect mixing of reagents or inaccurate dispensing into the wells. Here, a technique called gelification is presented, whereby most of the water present in the master mix is substituted by reagents that form a sol-gel mixture when submitted to a vacuum. As a result, qPCR reagents are effectively preserved for a few weeks at room temperature or a few months at 2-8 oC. Details of preparing each solution are shown here along with the expected aspect of a gelified reaction designed to detect&#160;T. cruzi satellite DNA (satDNA). A similar procedure can be applied to detect other organisms. Starting a gelified qPCR run is as simple as removing the plate from the refrigerator, adding the samples to their respective wells, and starting the run, thus decreasing the setup time of a full-plate reaction to the time it takes to load the samples. Additionally, gelified PCR reactions can be produced and controlled for quality in batches, saving time and avoiding common operator mistakes while running routine PCR reactions.

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

The present work describes the steps for producing ready-to-use qPCR for T. cruzi DNA detection that can be pre-loaded on the reaction vessel and stored in the refrigerator for several months.

qPCR pronta all'uso per la rilevazione del DNA da Trypanosoma cruzi o altri organismi patogeni

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

Biochimica

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Bioingegneria

Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with integrated fluorescence detection of amplicons. Isothermal nucleic acid amplification technologies eliminate the need for thermal cycling; however, fluorescence-based detection of products is still required for real-time, quantitative results. Several portable isothermal heaters with integrated fluorescence detection are now commercially available; however, the cost of these devices remains a significant barrier to widespread adoption in resource-limited settings. Described here is a protocol for the design and assembly of a modular, low-cost fluorimeter constructed from off-the-shelf components. Enclosed in a compact 3D printed housing, the fluorimeter is designed to be placed atop a commercially available heat block holding a PCR tube. The fluorimeter described here was optimized to detect fluorescein isothiocyanate (FITC) dye, but the system can be modified for use with dyes commonly used as reporters in real-time nucleic acid amplification reactions. Clinical applicability of the system is demonstrated by performing real-time nucleic acid detection with two isothermal amplification technologies: recombinase polymerase amplification (RPA) for detection of positive control DNA provided in a commercial kit and reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for detection of clinically meaningful levels of SARS-CoV-2 RNA.

Detailed instructions are provided to build an open-source, modular fluorimeter that is compatible with many low-cost heaters to perform real-time, quantitative isothermal nucleic acid amplification.

Fluorimetro in miniatura open source per monitorare le reazioni di amplificazione dell'acido nucleico isotermico in tempo reale in impostazioni limitate alle risorse

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with ...

Diagnosi delle infezioni batteriche respiratorie umane mediante amplificazione isotermica

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

Autore in primo piano: Miglioramento del rilevamento rapido dei patogeni respiratori mediante chip microfluidico 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, fungal, parasitic, and viral agents. Salmonella is a bacterial pathogen of worldwide food safety concern, including food for animals. Presented here is a multi-laboratory-validated Salmonella LAMP protocol that can be used to rapidly screen animal food for the presence of Salmonella contamination and can also be used to confirm presumptive Salmonella isolates recovered from all food categories. The LAMP assay specifically targets the Salmonella invasion gene (invA) and is rapid, sensitive, and highly specific. Template DNAs are prepared from enrichment broths of animal food or pure cultures of presumptive Salmonella isolates. The LAMP reagent mixture is prepared by combining an isothermal master mix, primers, DNA template, and water. The LAMP assay runs at a constant temperature of 65 &#176;C for 30 min. Positive results are monitored via real-time fluorescence and can be detected as early as 5 min. The LAMP assay exhibits high tolerance to inhibitors in animal food or culture medium, serving as a rapid, reliable, robust, cost-effective, and user-friendly method for screening and confirming Salmonella. The LAMP method has recently been incorporated into the U.S. Food and Drug Administration&#8217;s Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5.

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is an isothermal nucleic acid amplification test (iNAAT) that has attracted broad interest in the pathogen detection field. Here, we present a multi-laboratory-validated Salmonella LAMP protocol as a rapid, reliable, and robust method for screening Salmonella in animal food and confirming presumptive Salmonella from culture isolation.

Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di

qPCR pronta all'uso per la rilevazione del DNA da Trypanosoma cruzi o altri organismi patogeni

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Fluorimetro in miniatura open source per monitorare le reazioni di amplificazione dell'acido nucleico isotermico in tempo reale in impostazioni limitate alle risorse

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura